Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av tilskudd fra National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 og UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Forfatterne rapporterer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Et sentralt spørsmål innen nevrovitenskap er å forstå hvordan nevral dynamikk og kretser koder og lagrer informasjon, og hvordan de endres i hjernesykdommer. Ved hjelp av et miniskop in vivo Ca2+ bildebehandlingssystem kan individuell nevral aktivitet fra flere hundre nevroner i en lokal mikrokrets overvåkes samtidig fra et fritt oppførende dyr. Her er en detaljert kirurgiprotokoll for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon beskrevet for å forberede gnagere for en dyp hjerne in vivo Ca2 + avbildning via et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Tabell 1 viser sammenligningene av vårt miniskopsystem med andre kommersielt tilgjengelige og spesialbygde miniskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. Det er verdt å merke seg at GRIN linse implantasjon ved hjelp av den nåværende kirurgiske protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for en dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.
Fra viral injeksjon til datainnsamling av miniskop in vivo kalsiumavbildning tar hele eksperimentell prosedyre minst 2 måneder å fullføre. Det er en komplisert og arbeidsintensiv prosess. Den endelige suksessen til eksperimentet avhenger av flere faktorer, inkludert riktig valg av GECIer, injeksjon av virus nøyaktig i det målrettede hjerneområdet, tilstrekkelig viralt uttrykk i ønsket nevral populasjon, implantasjon av GRIN-linse nettopp på ønsket sted, tilstrekkelig gjenoppretting fra operasjoner, samt om alvorlig betennelse oppstår etter operasjonen, og om dyrets oppførsel er sterkt påvirket av operasjoner, og så videre.
To kritiske trinn inkluderer stereotaxic injeksjon av virus og GRIN linse implantasjon. For demonstrasjonsformålet ble stereotaxisk mikroinjeksjon utført i musen mPFC, med adeno-assosiert virus (AAV1) koding GCaMP6f under kontroll av CaMKII promotor som selektivt merker pyramidale nevroner i mPFC. GCaMP6f ble valgt da det er en av de raskeste og mest følsomme kalsiumindikatorene med en halv forfallstid på 71 ms15. I tillegg er AAV viralt uttrykk for GCaMP6f langvarig (dvs. flere måneder), noe som gjør det ideelt for å utføre repeterende in vivo Ca2 + avbildning over en lang periode for langsgående studier i musemodeller av nevrodegenerative sykdommer27. Den nåværende kirurgiprotokollen kan tilpasses for å målrette mot forskjellige cellepopulasjoner i en hvilken som helst annen hjerneregion. Ulike tilgjengelige virale verktøy tillater selektiv merking av spesifikke nevrale populasjoner i ønsket hjerneregion i ønsket alder. I tillegg kan forskere dra nytte av Cre-LoxP-rekombinasjonssystemet og ulike tilgjengelige transgene musemodeller for å utføre genetiske modifikasjoner og studere det atferdsmessige og nevrale kretsutfallet28,29.
Et unikt trekk ved den presenterte protokollen er at den automatiserte lag-for-lag hjernevevsaspirasjonen ble utført før GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantasjon. Dette oppnås gjennom en 27 G nål koblet til et vakuumsystem, styrt av en spesialbygd robotarm og programvare23. Basert på vår erfaring genererer denne metoden en jevn overflate for GRIN-linsen å kontakte og forårsaker mindre skade på nabovevet enn manuell vevsaspirasjon23. Av denne grunn gir denne prosedyren en åpenbar fordel for GRIN-linser med en relativt bredere diameter (f.eks. 1 mm). Vevsaspirasjon er imidlertid kanskje ikke nødvendig for å implantere en GRIN-linse med mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). I stedet kan den plantes direkte langs det ledende sporet laget med en 30 G nål21.
I tillegg til de to kritiske trinnene som er diskutert ovenfor, må mange andre faktorer vurderes nøye for en vellykket operasjon. (1) Alle instrumenter som kommer i kontakt med hjernen, bør steriliseres for å forhindre infeksjon. (2) Alle operasjonstrinn må utføres for å minimere skade på hjernen for å forhindre ytterligere betennelse og overdreven arrvevsdannelse. (3) Anestesidosene som gis i utgangspunktet og vedlikeholdes under operasjonen, spesielt de som administreres intraperitonealt, må vurderes nøye. Anestesidosene kan endres i henhold til forskjellige musestammer, da noen kan være mer utsatt. (4) Tilstanden til musen må overvåkes kontinuerlig under operasjonen. Til slutt, (5) musene må regelmessig overvåkes etter operasjonen, da mange komplikasjoner kan oppstå etter operasjonen.
Selv om en del av hjernevev fjernes ensidig under GRIN-linseimplantasjonstrinnet, observerte vi ingen åpenbare atferdsunderskudd 7,12. Vekten på miniskopet er rundt 2 gram og kabelen er spesialdesignet for å gjøre den lett og for å sikre at musen enkelt kan bære den. Miniskopet og kabelen festes kun til dyret før in vivo-avbildning og løsnes etter avbildning. Hele bildebehandlingsprosessen tar vanligvis ikke mer enn 30 minutter. Derfor forhindrer disse instrumenteringene ikke at musen oppfører seg fritt. Miniskopets installasjons- og avinstallasjonstrinn trenger en kort anestesi (mindre enn 2 minutter) med isofluran med det formål å begrense dyr. Vi lar vanligvis musen komme seg etter den korte eksponeringen av isofluran i 30 minutter før du utfører in vivo-avbildning. Vi har utført miniskop in vivo kalsiumavbildning en gang i uken i noen uker uten å merke noen innvirkning på musens helse og mus sosial oppførsel12.
En stor begrensning i det nåværende miniskopopptakssystemet er behovet for å koble mikroskopet til en kabel for datainnsamling. Tilstedeværelsen av kabelen begrenser noen ganger musens oppgaveytelse og begrenser registreringen av ett dyr om gangen. Nylig har et trådløst miniskop blitt utviklet 25,26. Dette vil utvide oppgaveytelsen og tillate samtidig in vivo-avbildning fra flere dyr i en gruppe. Videre vil utvikling av mer sensitive GECIer med spektralt separerbare bølgelengder kombinert med et miniskop med to farger gi mer spennende muligheter for nevrovitenskapelig forskning.

Intracellulær Ca2+ signalering er en viktig regulator for cellevekst, spredning, differensiering, migrasjon, gentranskripsjon, sekresjon og apoptose1. I nevroner kontrolleres Ca2+ signalering nøyaktig siden det romlige-temporale mønsteret er relatert til viktige funksjoner som membraneksitabilitet, nevrotransmitterutløsning og synaptisk plastisitet2.
In vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk som kan brukes til å dekode nevral kretsrepresentasjon elementær til normal dyreatferd, identifisere avvikende nevronaktiviteter i dyremodeller av hjernesykdommer, og avdekke potensielle terapeutiske mål som kan normalisere disse endrede kretsene. De to vanlige in vivo kalsiumavbildningssystemene er tofoton laserskanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 og hodemontert miniatyrisert mikroskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Den konvensjonelle to-fotonmikroskopien gir kommanderende fordeler som bedre oppløsning, lavere støy og lavere fotobleaching; De eksperimentelle dyrene må imidlertid være hodefaste, noe som begrenser atferdsstudiene som kan utføres 3,4,5,6. Derimot er det hodemonterte miniskopsystemet lite og bærbart, noe som gjør det mulig å studere et bredt utvalg av atferdstester ved hjelp av fritt oppfører dyr 7,8,9,10,11,12,13.
Det er to ledende Ca2+ indikatorer, kjemiske indikatorer 5,14 og genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer)15,16. Ca2 + avbildning har blitt tilrettelagt ved å bruke svært sensitive GECIer levert med virale vektorer som tillater spesifikk merking av nevroner i den målrettede kretsen. Den kontinuerlige innsatsen for å forbedre følsomheten, levetiden og evnen til å merke selv de subcellulære rommene, gjør GECIer ideelle for ulike in vivo kalsiumavbildningsstudier 17,18,19.
Spredningen av lys i hjernevev under avbildning begrenser den optiske penetrasjonen i dybden, selv med to-fotonmikroskopi. Gradient Index (GRIN)-objektivet overvinner imidlertid dette problemet, da GRIN-objektivet kan bygges direkte inn i det biologiske vevet og videresende bilder fra den dype hjerneregionen til mikroskopmålet. I motsetning til konvensjonell linse laget av optisk homogent materiale og krever en komplisert formet overflate for å fokusere og lage bilder, er GRIN-linseytelsen basert på en gradvis brytningsindeksendring i linsematerialet som oppnår fokus med en planoverflate20. GRIN linse kan fremstilles ned til 0,2 mm i diameter. Derfor kan en miniatyrisert GRIN-linse implanteres i den dype hjernen uten å forårsake for mye skade.
I denne artikkelen presenteres en komplett kirurgiprotokoll for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning. For demonstrasjonsformålet beskriver vi hjerneoperasjoner spesielt rettet mot medial prefrontal cortex (mPFC) av musehjernen og in vivo kalsiumavbildningsopptak via et spesialbygd miniskopsystem utviklet av Dr. Lins gruppe ved National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Den eksperimentelle prosedyren involverer to store hjerneoperasjoner. Den første operasjonen er stereotaktisk injisere en viral vektor som uttrykker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den andre operasjonen er å implantere GRIN-linsen i samme hjerneregion. Etter utvinning fra disse hjerneoperasjonene, er den påfølgende prosedyren å feste miniskopholderen (basen) på museskallen ved hjelp av tannsement. In vivo Ca2+ avbildning kan utføres når som helst etter montering av miniskopet på basen. Kirurgiprotokollen for viral injeksjon og GRIN linseimplantasjon er kompatibel med alle kommersielle eller spesialbygde enkeltfoton- og tofotonavbildningssystemer for dyp hjernein vivo kalsiumavbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Et miniatyrfluorescensmikroskop (miniskop) er et potent verktøy for in vivo kalsiumavbildning fra fritt oppførende dyr. Det gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle multi-photon kalsiumavbildningssystemer: (1) kompakt; (2) nedtonet; (3) rimelig; og (4) tillater opptak fra fritt oppførende dyr. Denne protokollen beskriver hjerneoperasjoner for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et spesialutviklet miniskopopptakssystem. Forberedelsesprosedyren består av tre trinn, inkludert (1) stereotaxically injisere viruset i ønsket hjerneregion av en musehjerne for å merke en bestemt undergruppe av nevroner med genetisk kodet kalsiumsensor; (2) implantasjon av gradient-indeks (GRIN) linse som kan videresende kalsium bilde fra dyp hjerne region til miniskopsystemet; og (3) feste miniskopholderen over museskallen der miniskopet kan festes senere. For å utføre in vivo kalsiumavbildning, er miniskopet festet på holderen, og nevronale kalsiumbilder samles sammen med samtidige atferdsopptak. Den nåværende kirurgi protokollen er kompatibel med noen kommersielle eller spesialbygde single-photon og to-photon bildebehandling systemer for dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.

Figur 1 viser den skjematiske eksperimentelle prosedyren, inkludert viral injeksjon, GRIN-objektivimplantasjon, festing av miniskopbasen til museskallen og in vivo kalsiumavbildning via et miniskop. Hele prosedyren tar ~ 2 måneder. Figur 2 viser hovedkomponentene som er beskrevet i protokollen for miniskop in vivo kalsiumavbildning. Figur 3 viser grensesnittene til AutoStereota-programvaren under GRIN-objektivimplantasjon. Figur 4 viser grensesnittene til NeuView og programvare for innspilling av atferd under in vivo kalsiumavbildning.
Utfallet av in vivo kalsiumavbildning er avhengig av suksessen til både viral injeksjon og GRIN linse implantasjon operasjoner. Figur 5 viser en rekke resultater (dvs. mislykket, suboptimal og god) fra in vivo kalsiumavbildningsopptak. I mislykkede tilfeller kan kalsiumbildet virke enten mørkt eller lyst, men avslører vanligvis ingen eller svært få aktive nevroner. Vi forfølger vanligvis ikke in vivo kalsiumopptaksforsøk hvis det er færre enn fem aktive nevroner. En god in vivo kalsiumavbildning avslører vanligvis flere hundre aktive nevroner. Hvis et opptak inneholder mindre enn hundre aktive nevroner, anser vi det som et suboptimalt opptak.
I både suboptimale og gode opptak ble in vivo kalsiumavbildningsforsøk forfulgt, og den påfølgende dataanalysen ble utført. Film 1 viser en representativ in vivo kalsiumavbildning opptak fra musen mPFC. Atferdsvideoer og kalsiumavbildningsdata behandles vanligvis separat. Videoer med museatferd kan scores manuelt. Kalsiumavbildningsfiler behandles ved hjelp av CaImAn kalsiumbildebehandlingsverktøykasse24. Figur 6 viser et representativt cellekart og flere kalsiumspor fra et godt in vivo kalsiumavbildningsopptak.
Etter å ha fullført in vivo kalsiumavbildning, er det siste trinnet å bekrefte om viral injeksjon og GRIN linse implantasjon har skjedd i ønsket hjerneregion. Til dette formål ble musen perfundert med fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA). Musehjernen ble høstet, postfixed i 4% PFA i 12 timer, og lagret i PBS ved 4 °C. Musehjernen ble deretter seksjonert i 50 μm tykke skiver med en vibratom. Hjerneskivene ble farget med DAPI og observert under mikroskopet (ikke beskrevet i protokollen)12. Figur 7 er en musehjerneskive ~ 1,94 mm fremre til bregma fra en eksperimentell mus, som viser sporet der GRIN-objektivet ble implantert. Den grønne fluorescensområdet under og rundt GRIN-linsesporet indikerer uttrykket for GCaMP6f i mPFC-regionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk oversikt over eksperimentell prosedyre. (A) Stereotaxic injeksjon av virus i mPFC. (B) GRIN-objektivimplantasjon i mPFC. (C) Feste miniskopbase til museskallen. (D) Montering av miniskop og in vivo kalsiumavbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figur 2: Hovedkomponenter som trengs for in vivo kalsiumavbildning. (A) Et GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm og en lengde på 4,38 mm. (B) En 27 G manuelt polert stump-end nål som brukes til hjernevevsaspirasjon. (C) Robotarmen koblet til nåleholderen. (D) En skreddersydd hette fra et PCR-rør for å beskytte den eksponerte GRIN-linsen til festingen av miniskopbasen på museskallen. (E) Miniskopholderen (basen) med en sekskantmutter. (F) Et miniskop der gjengedelen er pakket inn i PTFE-båndet. (G) Et miniskop festet til basen med en låseskrue. (H) Miniskopet holder armen. (I) En spesialbygd 3D-motorisert kontroller som brukes til å lette bevegelsen av miniskop i XYZ-posisjoner. (J) En beskyttelseshette festet på basen for å beskytte den eksponerte GRIN-linsen mens musen ikke utfører in vivo kalsiumavbildning. (K) Miniskopet som er koblet til kabelen. (L) Datainnsamlingssystemet for in vivo Ca2+ avbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figur 3: Grensesnitt av AutoStereota-programvare under lag-for-lag hjernevevsaspirasjon. (A) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.1 til 2.17.3. (B) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.4 til 2.17.6. (C) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.7 til 2.17.9. (D) Grensesnittet som tilsvarer trinn 2.17.10 til 2.17.12. Røde bokser uthever inndataverdiene. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figur 4: Grensesnitt av NeuView-programvare og programvaren for innspilling av atferd under in vivo kalsiumavbildning. (A) Grensesnittet til NeuView. (B,C) Grensesnittene til programvaren for innspilling av oppførsel. Røde bokser uthever knapper som må klikkes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figur 5: Maksimal projeksjonsfluorescenscellekart for å vise omfanget av mulige utfall. (A,B) Mislykket in vivo kalsiumavbildning som ikke er akseptabelt for etterfølgende dataanalyse. (A) er mørk og inneholder mindre enn 5 aktive nevroner. (B) er lys, men har ingen aktive nevroner. (C) Cellekartet fra en suboptimal in vivo kalsiumavbildning som inneholder noen aktive nevroner. (D) Cellekartet fra en god in vivo kalsiumavbildning som inkluderer flere hundre aktive nevroner. Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figur 6: Representativt cellekart og kalsiumtransienter fra en vellykket in vivo kalsiumavbildning. Det venstre panelet er det maksimale projeksjonsfluorescenscellekartet fra et in vivo kalsiumavbildningsopptak i mPFC under en åpen felttest. Innspillingen varer i 5 min. Høyre panel viser kalsium forbigående fra 15 regioner av interesse (fargetilpasset). Skala bar: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figur 7: Postmortem vurdering av en eksperimentell mus. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-uttrykk og GRIN-objektivimplantasjon i mPFC av en eksperimentell mus. Det rektangulære området angir banen for GRIN-objektivimplantasjon. Det grønne området under GRIN-objektivet implantert region bekrefter at GCaMP6f ble uttrykt, og GRIN-linsen ble implantert nettopp i ønsket hjerneregion. Cg, cingulate cortex; PrL, prelimb cortex; IL, infralimb cortex. Skalastang: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1: Sammenligninger av det spesialbygde miniskopsystemet ved NIDA med andre miniskopsystemer 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>
Film 1: Et in vivo kalsium bildeopptak fra musen mPFC under en åpen felttest. For demonstrasjonsformål viser denne videoen bare 1 min innspilling. Den opprinnelige opptaksbildefrekvensen er 10 bilder/ s. Videoen er 6 ganger raskere enn den opprinnelige innspillingen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filmen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniskop in vivo kalsiumavbildning er en kraftig teknikk for å studere nevrondynamikk og mikrokretser i fritt oppførende mus. Denne protokollen beskriver å utføre hjerneoperasjoner for å oppnå god in vivo kalsiumavbildning ved hjelp av et miniskop.

Stereotoksisk viral injeksjon og gradient-indeks linse implantasjon for dyp hjerne in vivo kalsiumavbildning

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniskop in vivo kalsiumavbildning gir forskere mulighet til å undersøke den romlige og tidsmessig koordinerte aktiviteten fra hundrevis av nevroner i dype hjernestrukturer av fritt oppfører dyr. Miniskop in vivo kalsiumavbildning gir mange fordeler, inkludert muligheten til å utføre opptak som er celletypespesifikke, store skalaer og langsgående. Vår kirurgi protokoll for viral injeksjon og GRIN linse implantasjon er kompatibel med noen kommersiell eller spesialbygd enkelt foton og to foton bildesystemer for dyp hjerne in vivo kalsium avbildning.Å demonstrere prosedyren vil være Rashmi Thapa, en avgangsstudent fra laboratoriet mitt. Etter desinfisering av det barberte kirurgiske området av en bedøvet mus, bruk en skalpell for å gjøre et to centimeter snitt gjennom huden langs midtlinjen for å avsløre lambda og bregma av skallen. Etter å ha funnet den 0,5 millimeter tannborer burr til en posisjon av fremre bakre 1,94 millimeter og medial lateral 0,5 millimeter fra bregma, begynn å bore gjennom skallen.Deretter laster du viruset inn i mikrolitersprøyten ved hjelp av mikropumpens kontrollpanel og trekker ut 500 nanoliter luftboble etterfulgt av 800 nanoliter av viruset med en strømningshastighet på 50 nanoliter per sekund. Beveg langsomt ned nålen inn i hjernevevet til den målrettede Z-koordinaten til dorsale ventrale 1,75 millimeter og flytt den deretter litt opp til Z-koordinaten til dorsal ventral 1,65 millimeter. På kontrollpanelet stiller du inn mikropumpen til å injisere 500 nanoliter av viruset med en strømningshastighet på 50 nanoliter per minutt før du trykker på Kjør-knappen for å injisere viruset.Når injeksjonen er over, still opp hudkantene og lukk forsiktig snittet med en 4-0 sutur. Påfør antibiotikasalve på det sydde området for å forhindre infeksjon. For å implantere gradientindeks eller GRIN-linse, sluk et trekantet område av huden på 1,5 centimeter høyde og 1,5 centimeter base fra den fremre siden mellom øynene til den bakre siden bak lambdaen ved hjelp av fin saks.Etter at skallen er grundig rengjort og tørket, påfør cyanoacrylat på kantene av huden og fest huden til skallen. Etter fem minutter når cyanoacrylaten tørker, finn en tannborer burr på 1,2 millimeter diameter til en posisjon av fremre bakre 1,94 millimeter, medial lateral 0,8 millimeter fra bregma. Bor gjennom skallen, etterfulgt av å fjerne dura ved hjelp av en 30 gauge nålspiss.Rengjør alle biter av benrester med 45 graders vinklede skarpe tang. Deretter fester du en 27 gauge manuelt polert stump endenål til nåleholderen koblet til en robotarm vippet med en vinkel på 10 grader og kobler den andre enden av nåleholderen til husvakuumsystemet. Finn spissen av nålen for å bare berøre bregmaen før du klikker på Bregma-knappen for å sette Z-koordinaten til bregma til null.Sett inngangs X-verdien til 0,8, skriv inn Y-verdi til 1,94, skriv inn Z-verdien til 1,0 og klikk på Finn-knappen for å flytte nålen til toppen av det borede hullet på skallen. Sentrer spissen av nålen til det borede hullet og ta den ned til Z-posisjon null. Slå på vakuumet og begynn å skylle det eksponerte hjerneområdet med kunstig cerebrospinalvæske, eller ACSF, gjennom et tyngdekraftskontrollert rørsystem koblet til en 30 gauge nål med bøyd spiss.ACSF blir kontinuerlig boblet med en gassblanding på 95% oksygen og 5% karbondioksid mens de filtreres gjennom et 0,2 mikron filter. Ved hjelp av AutoStereota programvare, vil ambisjonen av hjernevevet fullføres i fire runder. For den første aspirasjonsrunden må du kontrollere at Z-verdien viser null.Deretter klikker du i zStep-økten og sjekker første og andre rad. Sett verdiene for den første raden til 0,2 og 1. Sett verdiene for den andre raden til 0,15 og 4.I Modus-økten angir du nålstørrelse 27 gauge og 1.2. Angi dims 0,9. Alle andre verdier vil være standard.For å starte aspirasjonen, klikk sekvensielt på NotSet-, KeepZero- og Start-knappene. Den første aspirasjonsrunden genererer en søylelomme med 0,8 millimeter i dybden og 1 millimeter i diameter. I den tredje aspirasjonsrunden klikker du og kontrollerer den første raden for zStep-økten og setter verdiene for den første raden til 1,8 og 1.I Modus-økten angir du nålstørrelse 27 gauge og 2.2. Start ambisjonen ved å holde andre verdier de samme som i forrige runde. Etter den tredje aspirasjonsrunden er dybden på kolonnelommen 1,8 millimeter.Den siste runden med aspirasjon er å rydde opp blod akkumulert på bunnen av lommen. Sett verdiene for den første raden til 1,6 og 1 i zStep-økten, og angi nålstørrelse 27 gauge og 2,2 og Dims 0,6 i modusøkt før du starter aspirasjon. Når lommen er blodfri, stopp vakuumet, stopp vanning av ACSF, og ta nålen opp 2 millimeter i Z-koordinat og 0,5 millimeter fremre til midten.Plasser den sterile 1 millimeter GRIN-linsen i hjernevevslommen. Deretter bruker du smeltet agarose i gapet mellom GRIN-linsen og hjernevevet ved hjelp av en spatel. Etter at agarose danner en gel, fjern overflødig agarose ved hjelp av et mikroblad.Bland tannsementpulveret og katalysatorvæsken i en forhåndskjølt blandebrønn og påfør et lag med selvherdende limharpikssement på skallen, start med å omgi GRIN-linsen og deretter dekke hele den eksponerte skallen. Bland dental sementpulver og svart trekull med væske i en ren plastbrønn for å påføre et tynt lag av blandingen på toppen av det første laget av tannsement. La det herdes i fem minutter.Koble miniskopet til kabelen og slå på den spesialutviklede programvaren NuView. I NuView klikker du på Maskinvare, sjekker LED1 og klikker på Stream-knappen for å se live-bildene. For å stoppe live streaming, klikk på Stopp-knappen.Deretter setter du miniskopet inn i en spesialbygd miniskopholdearm. Ved hjelp av motoriserte kontrollere finner du miniskopet rett over det eksponerte GRIN-objektivet, noe som gjør det parallelt med overflaten på linsen. Ta sakte ned miniskopet mot GRIN-objektivet og juster Z-posisjonen til det beste fokusplanet er funnet.Påfør det første laget av tannsement rundt miniskopbasen uten å endre miniskopets posisjon. Etter at sementen er herdet, fjern forsiktig holdearmen slik at miniskopet kan stå alene på musehodet. Påfør et andre lag med tannsement rundt basen for å fylle alle hullene, og sørg for at det ikke er noen LED-lyslekkasje fra hullene.La tannsementen herdes. Etter kort anestetisering av musen med isofluran løsner du låseskruen i basen med en liten skrutrekker før du fjerner beskyttelseshetten og rengjør overflaten på GRIN-linsen med en aceton-gjennomvåt bomullspinne. Koble miniskopet til kabelen og start NuView-programvaren for å begynne å identifisere det beste fokusplanet med å justere posisjonen til miniskopet i forhold til basen ved å stramme eller løsne litt ved hjelp av stumpe tang.Når det beste fokusplanet er bestemt, strammer du låseskruen før du kobler fra kabelen og plasserer musen tilbake i hjemmeburet. Slå på programvaren for atferdskamera for å vise musevirkemåtearenaen gjennom en livestream-funksjon. Juster fokuset på det øverste kameraet manuelt.Velg Trigger Strobe og sjekk aktiverings-/deaktiver utløseren, etterfulgt av å klikke på Record-knappen. Bruk deretter Bla gjennom for å velge en plassering der atferdsopptak skal lagres. Velg ønsket bildeformat.Ta musen nær arenaen og koble miniskopet til kabelen som er koblet til datainnsamlingssystemet. Plasser deretter musen i midten av arenaen. Klikk Start innspilling i programvaren for virkemåtekameraet.I NuView, sjekk LED1, klikk på Capture og deretter utløserknapper for å starte innspillingen. Dette tillater samtidige opptak av kalsiumavbildning og museadferd. Trykk Stopp etter 3000 rammer og lagre filene.Når opptaket er ferdig, bedøv musen kort med isofluran, løsne miniskopet fra basen og legg beskyttelseshetten over basen før du plasserer musen tilbake i hjemmeburet. Cellekartet fra suboptimal in vivo kalsiumavbildning inneholdt noen aktive nevroner, mens det fra vellykket avbildning inkluderte flere hundre aktive nevroner i det fokuserte området. I det typiske eksemplet på en mislykket in vivo kalsiumavbildning ble regionen observert å være mørk og inneholdt mindre enn fem aktive nevroner, eller regionen var lys, men hadde ingen aktive nevroner.I den representative analysen vises det maksimale projeksjonsfluorescenscellekartet og kalsiumtransientene fra et påfølgende in vivo kalsiumavbildningsopptak. Postmortem-vurderingen for GCaMP6f-uttrykk og GRIN-objektivimplantasjon i medial PFC av en eksperimentell mus indikerte at GCaMP6f ble uttrykt og GRIN-linsen ble implantert nøyaktig i ønsket hjerneregion. For å oppnå en god kalsiumavbildning, er det nødvendig å sikre at blødningen har stoppet helt og feltet er fritt for blodpropp før du implanterer GRIN-linsen.Denne teknikken kan brukes til å studere nevrale kretsendringer i musemodell av forskjellige menneskelige hjernesykdommer og teste om en legemiddelkandidat kan normalisere de endrede kretsene.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funksjonell Bildediagnostiske Bruke Ultrasonic blod-hjerne barrieren avbrudd og mangan forbedret MR

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utvidelse av embryonale og voksne nevrale stamceller ved<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation eller Viral stereotaksiske Injection

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaksiske Injeksjon av en viral vektor for betinget genmanipulering i Mouse Spinal Cord

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Dyp hjernestimulering med Simultaneous fMRI i Gnagere

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulær Viral Injeksjon av Neonatal Mouse Brain for Vedvarende og Utbredt Neuronal Transduksjon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Non-invasiv Parenkymalt, Vaskulær og metabolske Høyfrekvente Ultralyd og Foto-akustisk Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

I Vivo Functional Brain Imaging tilnærming basert på Bioluminescent Kalsium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalsium Imaging for å visualisere hjernen Svar å endokrine signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalsiumavbildning i musen dårligere oliven

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjernen pericyte kalsium og hemodynamisk avbildning i transgene mus i Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...