Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Este trabalho é apoiado por subvenções do Instituto Nacional de Saúde (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 e UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Os autores não relatam interesses financeiros concorrentes.

Uma questão central na neurociência é entender como a dinâmica neural e os circuitos codificam e armazenam informações, e como eles são alterados em doenças cerebrais. Usando um miniscópio in vivo Ca2+ sistema de imagem, a atividade neural individual de várias centenas de neurônios dentro de um microcircuito local pode ser monitorada simultaneamente a partir de um animal que se comporta livremente. Aqui, um protocolo de cirurgia detalhado para injeção viral e implantação de lentes GRIN é descrito para preparar roedores para um cérebro profundo em imagens in vivo Ca2+ através de um sistema de gravação de miniscópio desenvolvido sob medida. A Tabela 1 mostra as comparações do nosso sistema de miniscópio com outros sistemas de miniscópios disponíveis comercialmente e personalizados 7,8,9,10,11,13,25,26. Vale ressaltar que a implantação da lente GRIN usando o protocolo cirúrgico atual é compatível com qualquer sistema comercial ou personalizado de imagem de fóton único e de dois fótons para um cérebro profundo em imagens de cálcio vivo.
Da injeção viral à aquisição de dados de miniscópio em imagem de cálcio vivo , todo o procedimento experimental leva pelo menos 2 meses para ser concluído. É um processo complicado e intensivo em mão-de-obra. O sucesso final do experimento depende de múltiplos fatores, incluindo escolha adequada de GECIs, injeção de vírus com precisão na área cerebral alvo, expressão viral suficiente na população neural desejada, implantação de lente GRIN precisamente no local desejado, recuperação adequada de cirurgias, bem como, se a inflamação grave ocorre após a cirurgia, e se o comportamento do animal é severamente afetado por cirurgias, e assim por diante.
Duas etapas críticas incluem injeção estereotaxica de vírus e implantação de lentes GRIN. Para efeito de demonstração, a microinjeção estereotaxa foi realizada no mPFC do mouse, com a codificação GCaMP6f (AAV1) do vírus adeno sob o controle do promotor CaMKII que rotula seletivamente neurônios piramifecionais no mPFC. O GCaMP6f foi escolhido por ser um dos indicadores de cálcio mais rápidos e sensíveis com um tempo de meia decomposição de 71 ms15. Além disso, a expressão viral AAV de GCaMP6f é de longa duração (ou seja, vários meses), tornando-a ideal para a realização de imagens repetitivas in vivo Ca2+ durante um longo período para estudos longitudinais em modelos de camundongos de doenças neurodegenerativas27. O protocolo de cirurgia atual pode ser adaptado para atingir diferentes populações celulares em qualquer outra região cerebral. Várias ferramentas virais disponíveis permitem rotulagem seletiva de populações neurais específicas na região cerebral desejada na idade desejada. Além disso, os pesquisadores podem aproveitar o sistema de recombinação Cre-LoxP e vários modelos de camundongos transgênicos disponíveis para realizar modificações genéticas e estudar o resultado dos circuitos comportamentais e neurais28,29.
Uma característica única do protocolo apresentado é que a aspiração automatizada do tecido cerebral camada por camada foi realizada antes da implantação da lente GRIN (1 mm de diâmetro). Isso é conseguido através de uma agulha de 27 G conectada a um sistema de vácuo, controlado por um braço robótico personalizado e software23. Com base em nossa experiência, este método gera uma superfície uniforme para a lente GRIN entrar em contato e causa menos danos ao tecido vizinho do que a aspiração manual do tecido23. Por essa razão, este procedimento traz uma vantagem óbvia para as lentes GRIN com um diâmetro relativamente maior (por exemplo, 1 mm). No entanto, a aspiração tecidual pode não ser necessária para implantar uma lente GRIN com diâmetro menor (0,5 mm ou 0,25 mm). Em vez disso, pode ser diretamente plantado ao longo da pista principal feita com uma agulha de 30 G21.
Além das duas etapas críticas discutidas acima, muitos outros fatores devem ser cuidadosamente considerados para uma operação bem sucedida. (1) Todos os instrumentos que entram em contato com o cérebro devem ser esterilizados para prevenir infecções. (2) Todas as etapas da cirurgia precisam ser realizadas para minimizar os danos ao cérebro para evitar inflamações adicionais e formação excessiva de tecido cicatricial. (3) As doses de anestesia dadas inicialmente e mantidas durante a cirurgia, especialmente as administradas intraperitonealmente, precisam ser cuidadosamente consideradas. As doses de anestesia podem ser modificadas de acordo com diferentes cepas de camundongos, pois algumas podem ser mais suscetíveis. (4) A condição do camundongo precisa ser constantemente monitorada durante a cirurgia. Por fim, (5) os camundongos precisam ser monitorados regularmente após a cirurgia, pois muitas complicações podem ocorrer após a cirurgia.
Embora um pedaço de tecido cerebral seja removido unilateralmente durante a etapa de implantação das lentes GRIN, não observamos nenhum déficit de comportamento óbvio 7,12. O peso do miniscópio é de cerca de 2 gramas e o cabo é projetado sob medida para torná-lo leve e para garantir que o mouse possa carregá-lo facilmente. O miniscópio e o cabo só são ligados ao animal antes da imagem in vivo e separados após a imagem. Todo o processo de imagem geralmente não leva mais do que 30 minutos. Portanto, essas instrumentações não impedem que o mouse se comporte livremente. As etapas de instalação e desinstalação do miniscópio precisam de uma breve anestesia (menos de 2 minutos) com isoflurano para fins de contenção animal. Normalmente deixamos o rato se recuperar da breve exposição de isoflurane por 30 minutos antes de realizar imagens in vivo. Realizamos miniscópios de imagem de cálcio vivo uma vez por semana durante algumas semanas sem notar qualquer impacto na saúde do camundongo e no comportamento social do rato12.
Uma das principais limitações do sistema de gravação de miniscópios atuais é a necessidade de conectar o microscópio a um cabo para aquisição de dados. A presença do cabo às vezes restringe o desempenho da tarefa do mouse e limita a gravação de um animal por vez. Recentemente, um miniscópio sem fio foi desenvolvido25,26. Isso ampliará o desempenho da tarefa e permitirá imagens simultâneas in vivo de vários animais em um grupo. Além disso, desenvolver GECIs mais sensíveis com comprimentos de onda espectralmente separáveis combinados com um miniscópio de dupla cor oferecerá possibilidades mais interessantes para a pesquisa em neurociência.

A sinalização intracelular Ca2+ é um regulador essencial do crescimento celular, proliferação, diferenciação, migração, transcrição genética, secreção e apoptose1. Nos neurônios, a sinalização Ca2+ é precisamente controlada, uma vez que seu padrão espátula-temporal está relacionado a funções cruciais como excitabilidade de membrana, liberação de neurotransmissores e plasticidade sináptica2.
A imagem in vivo de cálcio é uma técnica poderosa que pode ser utilizada para decodificar a representação do circuito neural elementar aos comportamentos normais dos animais, identificar atividades neuronais aberrantes em modelos animais de distúrbios cerebrais e desvendar potenciais alvos terapêuticos que podem normalizar esses circuitos alterados. Os dois sistemas de imagem de cálcio in vivo são microscopia de fluorescência de fluorescência a laser de dois fótons 3,4,5,6 e microendoscopia miniaturizada montada na cabeça (miniscópio)7,8,9,10,11,12,13 . A microscopia convencional de dois fótons oferece vantagens de comando, como melhor resolução, menor ruído e fotobleaching mais baixo; no entanto, os animais experimentais são necessários para serem fixados na cabeça, limitando os estudos comportamentais que podem ser realizadosem 3,4,5,6. Em contrapartida, o sistema de miniscópio montado na cabeça é pequeno e portátil, tornando possível estudar uma grande variedade de testes de comportamento usando animais de comportamento livre 7,8,9,10,11,12,13.
Existem dois indicadores principais de Ca2+, indicadores químicos 5,14 e indicadores de cálcio geneticamente codificados (GECIs)15,16. A imagem ca2+ foi facilitada usando GECIs altamente sensíveis entregues com vetores virais que permitem rotulagem específica de neurônios no circuito alvo. O esforço contínuo para aumentar a sensibilidade, longevidade e capacidade de rotular até mesmo os compartimentos subcelulares torna os GECIs ideais para vários estudos de imagem de cálcio in vivo 17,18,19.
A dispersão da luz no tecido cerebral durante a imagem limita a penetração óptica em profundidade, mesmo com a microscopia de dois fótons. No entanto, a lente do Índice de Gradiente (GRIN) supera essa questão, pois a lente GRIN pode ser diretamente incorporada nos tecidos biológicos e retransmitir imagens da região cerebral profunda para o objetivo do microscópio. Ao contrário da lente convencional feita de material opticamente homogêneo e requer uma superfície em forma complicada para focar e criar imagens, o desempenho da lente GRIN é baseado em uma mudança gradual de índice de refração dentro do material da lente que alcança o foco com uma superfíciede plano 20. A lente GRIN pode ser fabricada até 0,2 mm de diâmetro. Portanto, uma lente GRIN miniaturizada pode ser implantada no cérebro profundo sem causar muito dano.
Neste artigo, é apresentado um protocolo de cirurgia completo para o cérebro profundo in vivo de imagem de cálcio. Para o propósito da demonstração, descrevemos as cirurgias cerebrais especificamente visando o córtex pré-frontal medial (mPFC) do cérebro do camundongo e a gravação de imagens in vivo de cálcio através de um sistema de miniscópio personalizado desenvolvido pelo grupo do Dr. Lin no National Institute on Drug Abuse (NIDA/IRP)7,12. O procedimento experimental envolve duas grandes cirurgias cerebrais. A primeira cirurgia é injetar estereotipicamente um vetor viral expressando GCaMP6f (um GECI) no mPFC. A segunda cirurgia é implantar a lente GRIN na mesma região cerebral. Após a recuperação dessas cirurgias cerebrais, o procedimento subsequente é fixar o suporte de miniscópio (base) no crânio do rato usando cimento dental. In vivo A imagem ca2+ pode ser realizada a qualquer momento após a montagem do miniscópio em sua base. O protocolo de cirurgia para injeção viral e implantação de lentes GRIN é compatível com qualquer sistema comercial ou personalizado de imagem de fótons e dois fótons para o cérebro profundo em imagens de cálcio vivo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Um microscópio de fluorescência em miniatura (miniscópio) é uma ferramenta potente para imagens in vivo de cálcio de animais que se comportam livremente. Oferece várias vantagens em relação aos sistemas convencionais de imagem de cálcio multifótons: (1) compacto; (2) levemente ponderado; (3) acessível; e (4) permite gravar de animais que se comportam livremente. Este protocolo descreve cirurgias cerebrais para imagens de cálcio no cérebro profundo usando um sistema de gravação de miniscópio desenvolvido sob medida. O procedimento de preparação consiste em três etapas, incluindo (1) injetar estereotipicamente o vírus na região cerebral desejada de um cérebro de camundongo para rotular um subgrupo específico de neurônios com sensor de cálcio geneticamente codificado; (2) implantação de lente de gradiente-índice (GRIN) que possa retransmitir imagem de cálcio da região cerebral profunda para o sistema de miniscópio; e (3) afixar o suporte do miniscópio sobre o crânio do mouse onde o miniscópio pode ser anexado mais tarde. Para realizar imagens in vivo de cálcio, o miniscópio é preso ao suporte, e imagens neuronais de cálcio são coletadas juntamente com gravações de comportamento simultâneas. O presente protocolo cirúrgico é compatível com qualquer sistema comercial ou personalizado de imagem de fótons e dois fótons para imagens de cálcio profundo no cérebro vivo.

A Figura 1 mostra o procedimento experimental esquemático, incluindo injeção viral, implantação de lentes GRIN, afixação da base do miniscópio no crânio do rato e imagem de cálcio in vivo através de um miniscópio. Todo o procedimento leva ~2 meses. A Figura 2 mostra os principais componentes descritos no protocolo para miniscópio de imagem de cálcio in vivo. A Figura 3 exibe as interfaces do software AutoStereota durante a implantação da lente GRIN. A Figura 4 exibe as interfaces do NeuView e o software de gravação de comportamento durante a imagem in vivo de cálcio.
O resultado da imagem in vivo de cálcio depende do sucesso tanto das cirurgias de injeção viral quanto de implantação de lentes GRIN. A Figura 5 mostra uma série de desfechos (ou seja, mal sucedidos, subótimos e bons) a partir de gravações in vivo de imagem de cálcio. Em casos mal sucedidos, a imagem de cálcio pode parecer escura ou brilhante, mas geralmente revela nenhum ou muito poucos neurônios ativos. Normalmente não buscamos experimentos in vivo de registro de cálcio se houver menos de cinco neurônios ativos. Uma boa imagem in vivo de cálcio normalmente revela várias centenas de neurônios ativos. Se uma gravação contém menos de cem neurônios ativos, consideramos uma gravação subótima.
Tanto em gravações subótimas quanto em boas gravações in vivo , foram realizados experimentos de imagem de cálcio, e a análise subsequente de dados foi realizada. O filme 1 mostra um representante in vivo gravação de imagem de cálcio do mouse mPFC. Vídeos de comportamento e dados de imagem de cálcio geralmente são processados separadamente. Vídeos de comportamento do mouse podem ser pontuados manualmente. Os arquivos de imagem de cálcio são processados usando a caixa de ferramentas de processamento de imagem de cálcio CaImAn24. A Figura 6 mostra um mapa celular representativo e vários traços de cálcio de uma boa gravação de imagem de cálcio in vivo .
Após a conclusão da imagem in vivo de cálcio, o passo final é confirmar se a injeção viral e a implantação das lentes GRIN ocorreram na região cerebral desejada. Para isso, o camundongo foi perfundido com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), seguido por 4% de paraformaldeído (PFA). O cérebro do camundongo foi colhido, pós-fixado em 4% pfa por 12 h, e armazenado em PBS a 4 °C. O cérebro do rato foi então seccionado em fatias de 50 μm de espessura com um vibratome. As fatias cerebrais foram manchadas com DAPI e observadas sob o microscópio (não descrito no protocolo)12. Figura 7 é uma fatia cerebral do rato ~1,94 mm anterior a bregma de um rato experimental, mostrando a faixa onde a lente GRIN foi implantada. A região de fluorescência verde abaixo e ao redor da pista de lentes GRIN indica a expressão de GCaMP6f na região mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral esquemática do procedimento experimental. (A) Injeção estereóxica do vírus no mPFC. (B) Implantação de lentes GRIN no mPFC. (C) Base de miniscópio afixação no crânio do mouse. (D) Montagem de miniscópio e imagem de cálcio in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figura 2: Principais componentes necessários para a imagem in vivo de cálcio. (A) Uma lente GRIN com 1 mm de diâmetro e 4,38 mm de comprimento. (B) Uma agulha de extremidade cega polida manualmente de 27 G usada para aspiração de tecido cerebral. (C) O braço robótico acoplado ao suporte de agulha. (D) Uma tampa personalizada de um tubo PCR para proteger a lente GRIN exposta até a afixação da base de miniscópio no crânio do mouse. (E) O porta-miniscópio (base) com uma porca de hex. (F) Um miniscópio cuja parte da rosca é embrulhada com a fita PTFE. (G) Um miniscópio preso à sua base com um parafuso de travamento. (H) O miniscópio segurando o braço. (I) Um controlador motorizado 3D personalizado usado para facilitar o movimento do miniscópio nas posições XYZ. (J) Uma tampa protetora presa na base para proteger a lente GRIN exposta enquanto o mouse não está realizando imagens in vivo de cálcio. (K) O miniscópio conectado ao cabo. (L) O Sistema de Aquisição de Dados para imagens in vivo Ca2 +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figura 3: Interfaces do software AutoStereota durante aspiração de tecido cerebral camada por camada. (A) A interface correspondente às etapas 2.17.1 a 2.17.3. (B) A interface correspondente às etapas 2.17.4 a 2.17.6. (C) A interface correspondente às etapas 2.17.7 a 2.17.9. (D) A interface correspondente às etapas 2.17.10 a 2.17.12. As caixas vermelhas destacam os valores de entrada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figura 4: Interfaces do software NeuView e o software de gravação de comportamento durante a imagem in vivo de cálcio. (A) A interface do NeuView. (B,C) As interfaces do software de gravação de comportamento. Caixas vermelhas destacam botões que precisam ser clicados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figura 5: Mapas máximos de células de fluorescência de projeção para mostrar a gama de possíveis desfechos. (A,B) Imagens in vivo de cálcio não sucedidas que não são aceitáveis para análise de dados subsequentes. (A) é escuro e contém menos de 5 neurônios ativos. (B) é brilhante, mas não tem neurônios ativos. (C) O mapa celular de uma imagem subótima in vivo de cálcio que contém alguns neurônios ativos. (D) O mapa celular de uma boa imagem in vivo de cálcio que inclui várias centenas de neurônios ativos. Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figura 6: Mapa celular representativo e transitórios de cálcio de uma imagem de cálcio in vivo bem sucedida. O painel esquerdo é o mapa máximo da célula de fluorescência de projeção a partir de uma gravação de imagem de cálcio in vivo no mPFC durante um teste de campo aberto. A gravação dura 5 minutos. O painel direito mostra transitórios de cálcio de 15 regiões de interesse (combinadas com cores). Barra de escala: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figura 7: Avaliação pós-morte de um rato experimental. A avaliação pós-morte para expressão GCaMP6f e implantação de lentes GRIN no mPFC de um rato experimental. A área retangular indica o caminho para implantação da lente GRIN. A área verde sob a região implantada pela lente GRIN confirma que o GCaMP6f foi expresso, e a lente GRIN foi implantada precisamente na região cerebral desejada. Cg, córtex cingulado; PrL, córtex pré-limíbico; IL, córtex infralimíbido. Barra de escala: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Tabela 1: Comparações do sistema de miniscópio personalizado no NIDA com outros sistemas de miniscópio 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta Tabela.</a>
Filme 1: Uma gravação de imagem de cálcio in vivo do mPFC do mouse durante um teste de campo aberto. Para fins de demonstração, este vídeo mostra apenas 1 min de gravação. A taxa de quadros de gravação original é de 10 quadros/s. O vídeo é 6 vezes mais rápido que a gravação original. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Filme.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscópio em imagem de cálcio vivo é uma técnica poderosa para estudar dinâmica neuronal e microcircuitos em camundongos que se comportam livremente. Este protocolo descreve a realização de cirurgias cerebrais para obter uma boa imagem in vivo de cálcio usando um miniscópio.

Injeção viral esteretaxica e implantação de lente de índice de gradiente para imagem de cálcio no cérebro profundo em vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniscópio em imagem de cálcio vivo capacita os pesquisadores a examinar a atividade espacial e temporalmente coordenada de centenas de neurônios em estruturas cerebrais profundas de animais que se comportam livremente. Miniscópio em imagem de cálcio vivo oferece muitas vantagens, incluindo a capacidade de realizar gravações específicas do tipo celular, em grande escala e longitudinal. Nosso protocolo de cirurgia para injeção viral e implantação de lentes GRIN é compatível com qualquer fóton único comercial ou personalizado e dois sistemas de imagem de fótons para o cérebro profundo em imagem de cálcio vivo.Demonstrando o procedimento estará Rashmi Thapa, estudante de pós-graduação do meu laboratório. Depois de desinfetar a área cirúrgica raspada de um rato anestesiado, use um bisturi para fazer uma incisão de dois centímetros através da pele ao longo da linha média para expor a lambda e bregma do crânio. Depois de localizar a rebarba de perfuração dentária de 0,5 milímetros para uma posição de 1,94 milímetros posterior anterior e 0,5 milímetros lateral medial do bregma, comece a perfurar através do crânio.Em seguida, carregue o vírus na seringa microliter usando o painel de controle da micro bomba e retire 500 nanoliters de bolha de ar seguido por 800 nanoliters do vírus a uma taxa de fluxo de 50 nanoliters por segundo. Mova-se lentamente para baixo da agulha para o tecido cerebral para a coordenada Z alvo do ventral dorsal 1,75 milímetros e, em seguida, movê-lo ligeiramente para a coordenada Z de ventral dorsal 1,65 milímetros. No painel de controle, defina a micro bomba para injetar 500 nanoliters do vírus na taxa de fluxo de 50 nanoliters por minuto antes de apertar o botão Executar para injetar o vírus.Quando a injeção acabar, fore a linha das bordas da pele e feche cuidadosamente a incisão com uma sutura 4-0. Aplique pomada antibiótica na área costurada para prevenir infecções. Para implantar índice de gradiente ou lente GRIN, extirpa uma área triangular da pele de 1,5 centímetro de altura e base de 1,5 centímetros do lado anterior entre os olhos para o lado posterior atrás da lambda usando uma tesoura fina.Depois que o crânio estiver completamente limpo e seco, aplique cianoacrilato nas bordas da pele e conecte a pele ao crânio. Após cinco minutos quando o cianoacrilato secar, localize uma rebarba de broca dentária de 1,2 milímetros de diâmetro para uma posição de 1,94 milímetros posterior anterior, lateral medial 0,8 milímetros do bregma. Perfurar o crânio, seguido de remover a dura usando uma ponta de agulha calibre 30.Limpe todos os pedaços de detritos ósseos com fórceps afiados de 45 graus. Em seguida, conecte uma agulha final cega polida manualmente de 27 ao suporte da agulha acoplado a um braço robótico inclinado com um ângulo de 10 graus e conecte a outra extremidade do suporte da agulha ao sistema de vácuo da casa. Localize a ponta da agulha para apenas tocar na bregma antes de clicar no botão Bregma para definir a coordenada Z de bregma a zero.Defina o valor de entrada X para 0,8, o valor de entrada Y para 1,94, o valor de entrada Z para 1.0 e clique no botão Encontrar para mover a agulha para a parte superior do orifício perfurado no crânio. Centralizar a ponta da agulha para o orifício perfurado e trazê-la para a posição Z zero. Ligue o vácuo e comece a enxaguar a área do cérebro exposta com fluido cerebrospinal artificial, ou ACSF, através de um sistema de tubulação controlado pela gravidade conectado a uma agulha de calibre 30 com uma ponta dobrada.ACSF é continuamente borbulhado com uma mistura de gás de 95% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono enquanto é filtrado através de um filtro de 0,2 mícrons. Usando o software AutoStereota, a aspiração do tecido cerebral será completada em quatro rodadas. Para a primeira rodada de aspiração, certifique-se de que o valor Z exibe zero.Em seguida, na sessão zStep, clique e verifique a primeira e segunda linhas. Defina os valores da primeira linha para 0,2 e 1. Defina os valores para a segunda linha para 0,15 e 4.Na sessão Mode, ajuste o tamanho da agulha calibre 27 e 1.2. Definir Dims 0.9. Todos os outros valores serão padrão.Para iniciar a aspiração, clique seqüentemente nos botões NotSet, KeepZero e Start. A primeira rodada de aspiração gera um bolso de coluna com 0,8 milímetros de profundidade e 1 milímetro de diâmetro. Na terceira rodada de aspiração, clique e verifique a primeira linha para a sessão zStep e defina os valores para a primeira linha para 1,8 e 1.Na sessão Mode, ajuste o tamanho da agulha calibre 27 e 2.2. Inicie a aspiração mantendo outros valores iguais aos da rodada anterior. Após a terceira rodada de aspiração, a profundidade do bolso da coluna é de 1,8 milímetros.A última rodada de aspiração é limpar o sangue acumulado na parte inferior do bolso. Defina os valores da primeira linha para 1,6 e 1 na sessão zStep e ajuste o tamanho da agulha 27 e 2.2 e Dims 0.6 na sessão mode antes de iniciar a aspiração. Uma vez que o bolso esteja livre de sangue, pare o vácuo, pare a irrigação de ACSF, e traga a agulha para cima 2 milímetros na coordenada Z e 0,5 milímetros anterior ao centro.Coloque a lente GRIN estéril de 1 milímetro no bolso do tecido cerebral. Em seguida, aplique a agarose derretida na abertura entre a lente GRIN e o tecido cerebral com a ajuda de uma espátula. Depois que agarose forma um gel, remova o excesso de agarose usando uma micro lâmina.Misture o pó de cimento dental e o líquido catalisador em um poço de mistura pré-refrigerado e aplique uma camada de cimento de resina adesivo auto-curando no crânio, começando por torno da lente GRIN e, em seguida, cobrindo todo o crânio exposto. Em um poço de plástico limpo, misture o pó de cimento dental e o carvão preto com líquido para aplicar uma fina camada da mistura em cima da primeira camada de cimento dental. Deixe endurecer por cinco minutos.Conecte o Miniscópio ao cabo e ligue o software desenvolvido sob medida NuView. No NuView, clique em Hardware, verifique LED1 e clique no botão Transmitir para ver as imagens ao vivo. Para interromper a transmissão ao vivo, clique no botão Parar.Em seguida, instale o Miniscópio em um braço de retenção miniscópio personalizado. Com a ajuda de controladores motorizados, localize o Miniscópio logo acima da lente GRIN exposta, tornando-o paralelo à superfície da lente. Abaixe lentamente o Miniscópio em direção à lente GRIN e ajuste sua posição Z até que o melhor plano de foco seja encontrado.Aplique a primeira camada de cimento dentário ao redor da base do Miniscópio sem alterar a posição do Miniscópio. Depois que o cimento for endurecido, remova suavemente o braço de retenção para que o Miniscópio possa ficar sozinho na cabeça do mouse. Aplique uma segunda camada de cimento dental ao redor da base para preencher todas as lacunas, garantindo que não haja vazamento de luz led das lacunas.Deixe o cimento dentário endurecer. Depois de anestesiar brevemente o rato com isoflurano, solte o parafuso de bloqueio na base com uma pequena chave de fenda antes de remover a tampa protetora e limpe a superfície da lente GRIN com um cotonete encharcado de acetona. Conecte o Miniscópio ao cabo e inicie o software NuView para começar a identificar o melhor plano focal com o ajuste da posição do Miniscópio em relação à base, apertando ou afrouxando ligeiramente com a ajuda de fórceps contundentes.Uma vez determinado o melhor plano focal, aperte o parafuso de travamento antes de desconectar o cabo e coloque o mouse de volta em sua gaiola doméstica. Ligue o software da câmera de comportamento para visualizar a arena de comportamento do mouse através de uma função livestream. Ajuste manualmente o foco da câmera superior.Selecione Acionar Strobe e verifique ativar/desativar o gatilho, seguido de clicar no botão Gravar. Em seguida, use Procurar para selecionar um local onde as gravações de comportamento serão salvas. Selecione o formato de imagem desejado.Aproxime o mouse da arena e conecte o Miniscópio ao cabo ligado ao sistema de aquisição de dados. Em seguida, coloque o rato no centro da arena. No software da câmera de comportamento, clique em Iniciar gravação.No NuView, verifique LED1, clique em Capturar e, em seguida, acione botões para iniciar a gravação. Isso permite gravações simultâneas de imagens de cálcio e comportamento do rato. Aperte Stop após 3.000 quadros e salve os arquivos.Quando a gravação estiver pronta, anestesia brevemente o mouse com isoflurane, retire o Miniscópio da base e coloque a tampa protetora sobre a base antes de colocar o mouse de volta em sua gaiola doméstica. O mapa celular da imagem subótimal in vivo de cálcio continha alguns neurônios ativos, enquanto que a partir de imagens bem sucedidas incluía várias centenas de neurônios ativos na área focada. No exemplo típico de uma imagem in vivo de cálcio in vivo mal sucedida, observou-se que a região era escura e continha menos de cinco neurônios ativos, ou a região era brilhante, mas não tinha neurônios ativos.Na análise representativa, mostram-se o mapa celular de fluorescência máxima de projeção e os transitórios de cálcio a partir de um registro sucessivo de imagem de cálcio in vivo. A avaliação pós-morte para expressão GCaMP6f e implantação de lentes GRIN no PFC medial de um rato experimental indicou que GCaMP6f foi expressa e a lente GRIN foi implantada precisamente na região cerebral desejada. Para obter uma boa imagem de cálcio, é necessário garantir que o sangramento tenha parado completamente e que o campo esteja livre de coágulos sanguíneos antes de implantar a lente GRIN.Esta técnica pode ser utilizada para estudar mudanças no circuito neural no modelo de camundongos de diferentes distúrbios cerebrais humanos e testar se um candidato a medicamentos pode normalizar os circuitos alterados.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Neuroimagem Funcional Usando rompimento da barreira hemato-encefálica ultra-sônico e Manganês-RM

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Neurociência

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansão da embrionárias e adultas células-tronco neurais por<em&gt; In Utero</em&gt; Eletroporação ou injeção estereotáxica Viral

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Injeção estereotáxica de um vetor viral para manipulação genética condicional no Cabo de Rato Spinal

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Estimulação Cerebral Profunda com fMRI simultâneo em Roedores

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Injection Viral intracerebroventricular do Neonatal do rato do cérebro para a transdução neuronal persistente e generalizada

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Parênquima não-invasivo, Vascular e Metabólica alta freqüência ultra-som e Fotoacústica Rat Cerebral Profunda Imagem

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo funcional do cérebro Imagiologia Abordagem Baseada em cálcio Bioluminescent Indicador GFP-aequorina

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Imagem de cálcio para visualizar as respostas do cérebro a sinalização endócrina em Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Imagem de cálcio em rato de azeitona inferior

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Imagem pericínica cerebral de cálcio e hemodinâmica em camundongos transgênicos em Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...