Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Эта работа поддерживается грантами Национального института здравоохранения (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 и UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Авторы сообщают об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Центральным вопросом в нейробиологии является понимание того, как нейронная динамика и схемы кодируют и хранят информацию, и как они изменяются при заболеваниях мозга. Используя систему визуализации miniscope in vivo Ca2+, индивидуальная нейронная активность нескольких сотен нейронов в локальной микросхеме может одновременно контролироваться от свободно ведущего себя животного. Здесь описан подробный хирургический протокол для вирусной инъекции и имплантации линзы GRIN для подготовки грызунов к глубокой визуализации мозга in vivo Ca2 + с помощью специально разработанной системы записи минископа. В таблице 1 показаны сравнения нашей минископической системы с другими коммерчески доступными и изготовленными на заказ системами минископов 7,8,9,10,11,13,25,26. Стоит отметить, что имплантация хрусталика GRIN с использованием настоящего хирургического протокола совместима с любыми коммерческими или изготовленными на заказ однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием.
От вирусной инъекции до получения данных минископом in vivo кальциевой визуализации, вся экспериментальная процедура занимает не менее 2 месяцев. Это сложный и трудоемкий процесс. Конечный успех эксперимента зависит от множества факторов, включая правильный выбор GECI, точную инъекцию вируса в целевую область мозга, достаточную вирусную экспрессию в желаемой нейронной популяции, имплантацию хрусталика GRIN точно в нужное место, адекватное восстановление после операций, а также, возникает ли тяжелое воспаление после операции, и серьезно ли поведение животного влияет на операции, и так далее.
Два критических этапа включают стереотаксическую инъекцию вируса и имплантацию хрусталика GRIN. Для демонстрационной цели стереотаксическую микроинъекцию выполняли в мышином mPFC, с аденоассоциированным вирусом (AAV1), кодирующим GCaMP6f под контролем промотора CaMKII, который избирательно маркирует пирамидальные нейроны в mPFC. GCaMP6f был выбран, так как это один из самых быстрых и чувствительных показателей кальция со временем полураспада 71 мс15. Кроме того, вирусная экспрессия AAV GCaMP6f является длительной (т.е. несколько месяцев), что делает ее идеальной для выполнения повторяющейся визуализации in vivo Ca2+ в течение длительного периода для продольных исследований на мышиных моделях нейродегенеративных заболеваний27. Текущий протокол операции может быть адаптирован для нацеливания на различные клеточные популяции в любой другой области мозга. Различные доступные вирусные инструменты позволяют селективно маркировать конкретные нейронные популяции в нужной области мозга в нужном возрасте. Кроме того, исследователи могут воспользоваться системой рекомбинации Cre-LoxP и различными доступными трансгенными моделями мышей для проведения генетических модификаций и изучения поведенческих и нейронных схем28,29.
Одной из уникальных особенностей представленного протокола является то, что автоматизированная послойная аспирация мозговой ткани была выполнена перед имплантацией линзы GRIN (диаметром 1 мм). Это достигается с помощью иглы 27 G, подключенной к вакуумной системе, управляемой специально изготовленной роботизированной рукой и программным обеспечением23. Основываясь на нашем опыте, этот метод создает однородную поверхность для контакта линзы GRIN и наносит меньший ущерб соседней ткани, чем мануальная тканевая аспирация23. По этой причине эта процедура приносит очевидное преимущество для линз GRIN с относительно более широким диаметром (например, 1 мм). Однако тканевая аспирация может не потребоваться для имплантации линзы GRIN с меньшим диаметром (0,5 мм или 0,25 мм). Вместо этого он может быть непосредственно посажен вдоль ведущей дорожки, сделанной с помощью иглы30 G 21.
Помимо двух критических шагов, рассмотренных выше, многие другие факторы должны быть тщательно рассмотрены для успешной операции. (1) Все инструменты, которые контактируют с мозгом, должны быть стерилизованы для предотвращения инфекции. (2) Все хирургические шаги должны быть выполнены, чтобы свести к минимуму повреждение мозга, чтобы предотвратить дальнейшее воспаление и чрезмерное образование рубцовой ткани. (3) Дозы анестезии, вводимые первоначально и поддерживаемые во время операции, особенно те, которые вводятся внутрибрюшинно, должны быть тщательно рассмотрены. Дозы анестезии могут быть изменены в соответствии с различными штаммами мышей, так как некоторые из них могут быть более восприимчивыми. (4) Состояние мыши необходимо постоянно контролировать во время операции. Наконец, (5) мыши должны регулярно контролироваться после операции, так как после операции может возникнуть много осложнений.
Хотя кусок мозговой ткани удаляется в одностороннем порядке на этапе имплантации хрусталика GRIN, мы не наблюдали каких-либо очевидных дефицитов поведения 7,12. Вес минископа составляет около 2 граммов, а кабель специально разработан, чтобы сделать его легким и гарантировать, что мышь может легко его переносить. Минископ и кабель прикрепляются к животному только перед визуализацией in vivo и отсоединяются после визуализации. Весь процесс визуализации обычно занимает не более 30 минут. Поэтому эти приборы не мешают мыши свободно вести себя. Этапы установки и деинсталляции минископа требуют кратковременной анестезии (менее 2 минут) изофлураном с целью удержания животных. Обычно мы оставляем мышь оправиться от кратковременного воздействия изофлурана в течение 30 минут, прежде чем выполнять визуализацию in vivo. Мы проводили минископическую визуализацию кальция in vivo один раз в неделю в течение нескольких недель, не замечая какого-либо влияния на здоровье мышей и социальное поведение мыши12.
Одним из основных ограничений нынешней системы записи минископа является необходимость подключения микроскопа к кабелю для сбора данных. Наличие кабеля иногда ограничивает выполнение задач мыши и ограничивает запись одного животного за раз. Недавно был разработан беспроводной минископ25,26. Это расширит производительность задачи и позволит одновременно получать изображения in vivo от нескольких животных в группе. Кроме того, разработка более чувствительных GECI со спектрально разделяемыми длинами волн в сочетании с двухцветным минископом предложит более захватывающие возможности для исследований в области неврологии.

Внутриклеточная передача сигналов Ca2+ является важным регулятором роста клеток, пролиферации, дифференцировки, миграции, транскрипции генов, секреции и апоптоза1. В нейронах передача сигналов Ca2+ точно контролируется, поскольку ее пространственно-временная картина связана с важнейшими функциями, такими как возбудимость мембраны, высвобождение нейротрансмиттера и синаптическая пластичность2.
Визуализация кальция in vivo является мощным методом, который может быть использован для декодирования элементального представления нейронной цепи для нормального поведения животных, выявления аберрантной нейронной активности в животных моделях расстройств головного мозга и разгадки потенциальных терапевтических целей, которые могут нормализовать эти измененные схемы. Двумя распространенными системами визуализации кальция in vivo являются двухфотонная лазерная сканирующая флуоресцентная микроскопия 3,4,5,6 и головная миниатюрная микроэндоскопия (минископ)7,8,9,10,11,12,13 . Обычная двухфотонная микроскопия предлагает такие преимущества, как лучшее разрешение, более низкий уровень шума и более низкое фотоотбеливание; тем не менее, экспериментальные животные должны быть зафиксированы головой, ограничивая исследования поведения, которые могут быть выполнены 3,4,5,6. Напротив, головная минископическая система является небольшой и портативной, что позволяет изучать широкий спектр поведенческих тестов с использованием свободно ведущих себя животных 7,8,9,10,11,12,13.
Есть два ведущих индикатора Ca2+, химические показатели 5,14 и генетически закодированные показатели кальция (GECI)15,16. Визуализация Ca2+ была облегчена за счет использования высокочувствительных GECI, доставленных с вирусными векторами, которые позволяют специфическую маркировку нейронов в целевой цепи. Постоянные усилия по повышению чувствительности, долговечности и способности маркировать даже субклеточные компартменты делают GECI идеальными для различных исследований визуализации кальция in vivo 17,18,19.
Рассеяние света в ткани мозга во время визуализации ограничивает глубокое оптическое проникновение, даже при двухфотонной микроскопии. Тем не менее, линза Gradient Index (GRIN) преодолевает эту проблему, поскольку линза GRIN может быть непосредственно встроена в биологические ткани и передавать изображения из глубокой области мозга на объектив микроскопа. В отличие от обычной линзы, изготовленной из оптически однородного материала и требующей сложной формы поверхности для фокусировки и создания изображений, характеристики объектива GRIN основаны на постепенном изменении показателя преломления в материале линзы, которое достигает фокусировки с плоской поверхностью20. Объектив GRIN может быть изготовлен диаметром до 0,2 мм. Таким образом, миниатюрная линза GRIN может быть имплантирована в глубокий мозг, не причиняя слишком большого ущерба.
В этой статье представлен полный протокол операции для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием. Для демонстрационной цели мы описываем операции на головном мозге, специально нацеленные на медиальную префронтальную кору (mPFC) мозга мыши и запись визуализации кальция in vivo с помощью специально разработанной системы минископа, разработанной группой доктора Лина в Национальном институте по злоупотреблению наркотиками (NIDA / IRP) 7,12. Экспериментальная процедура включает в себя две крупные операции на головном мозге. Первая операция заключается в стереотаксическом введении вирусного вектора, экспрессирующего GCaMP6f (GECI) в mPFC. Вторая операция заключается в имплантации хрусталика GRIN в ту же область мозга. После восстановления после этих операций на головном мозге последующая процедура заключается в прикреплении держателя минископа (основания) к черепу мыши с помощью зубного цемента. In vivo Визуализация Ca2+ может быть выполнена в любое время после установки минископа на его основание. Хирургический протокол для вирусных инъекций и имплантации линз GRIN совместим с любыми коммерческими или специально созданными однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальция.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Миниатюрный флуоресцентный микроскоп (минископ) является мощным инструментом для визуализации кальция in vivo от свободно ведущих себя животных. Он предлагает несколько преимуществ по сравнению с обычными многофотонными системами визуализации кальция: (1) компактный; 2) легкие; 3) доступные; и (4) позволяет вести запись от свободно ведущих себя животных. Этот протокол описывает операции на головном мозге для глубокой визуализации кальция in vivo с использованием специально разработанной системы записи минископа. Процедура подготовки состоит из трех этапов, включая (1) стереотаксическое введение вируса в желаемую область мозга мыши для маркировки определенной подгруппы нейронов генетически закодированным датчиком кальция; (2) имплантация линзы с градиентным индексом (GRIN), которая может передавать изображение кальция из глубокой области мозга в систему минископа; и (3) прикрепление держателя минископа к черепу мыши, где минископ может быть прикреплен позже. Для выполнения визуализации кальция in vivo минископ крепится к держателю, и нейронные изображения кальция собираются вместе с одновременными записями поведения. Настоящий протокол операции совместим с любыми коммерческими или специально созданными однофотонными и двухфотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальцием.

На рисунке 1 показана схематическая экспериментальная процедура, включая вирусную инъекцию, имплантацию линзы GRIN, прикрепление основания минископа к черепу мыши и визуализацию кальция in vivo с помощью минископа. Вся процедура занимает ~2 месяца. На рисунке 2 показаны основные компоненты, описанные в протоколе визуализации кальция in vivo минископом in vivo. На рисунке 3 показаны интерфейсы программного обеспечения AutoStereota во время имплантации линзы GRIN. На рисунке 4 показаны интерфейсы NeuView и программного обеспечения для записи поведения во время визуализации кальция in vivo.
Результат визуализации кальция in vivo зависит от успеха как вирусных инъекций, так и операций по имплантации хрусталика GRIN. На рисунке 5 показан ряд исходов (т.е. неудачных, неоптимальных и хороших) из записей визуализации кальция in vivo . В неудачных случаях изображение кальция может казаться либо темным, либо ярким, но обычно не обнаруживает или очень мало активных нейронов. Обычно мы не проводим эксперименты по регистрации кальция in vivo , если есть менее пяти активных нейронов. Хорошая визуализация кальция in vivo обычно выявляет несколько сотен активных нейронов. Если запись содержит менее ста активных нейронов, мы считаем ее неоптимальной записью.
Как в неоптимальных, так и в хороших записях проводились эксперименты по визуализации кальция in vivo , и был проведен последующий анализ данных. На ролике 1 показана репрезентативная запись визуализации кальция in vivo от мыши mPFC. Видео о поведении и данные визуализации кальция обычно обрабатываются отдельно. Видео о поведении мыши можно оценивать вручную. Файлы изображений кальция обрабатываются с использованием набора инструментов24 для обработки изображений кальция CaImAn. На рисунке 6 показана репрезентативная карта клеток и несколько следов кальция из хорошей записи визуализации кальция in vivo .
После завершения визуализации кальция in vivo последним шагом является подтверждение того, произошла ли вирусная инъекция и имплантация линзы GRIN в желаемую область мозга. Для этой цели мышь перфузировали фосфат-буферным физиологическим раствором (PBS), за которым следовал 4% параформальдегид (PFA). Мозг мыши собирали, постфиксировали в 4% PFA в течение 12 ч и хранили в PBS при 4 °C. Затем мозг мыши был разделен на срезы толщиной 50 мкм с вибратомом. Срезы мозга окрашивали DAPI и наблюдали под микроскопом (не описанным в протоколе)12. На рисунке 7 показан срез мозга мыши ~ 1,94 мм к брегме от экспериментальной мыши, показывающий след, где была имплантирована линза GRIN. Зеленая область флуоресценции под и вокруг трека объектива GRIN указывает на экспрессию GCaMP6f в области mPFC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Рисунок 1: Схематический обзор экспериментальной процедуры. (А) Стереотаксическая инъекция вируса в mPFC. (B) Имплантация хрусталика GRIN в mPFC. (C) Прикрепление основания минископа к черепу мыши. (D) Монтаж минископа и визуализация кальция in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Рисунок 2: Основные компоненты, необходимые для визуализации кальция in vivo . (A) Объектив GRIN диаметром 1 мм и длиной 4,38 мм. (B) Игла 27 Г, отполированная вручную тупой концом, используемая для аспирации тканей головного мозга. (C) Роботизированная рука, соединенная с держателем иглы. (D) Изготовленный на заказ колпачок из ПЦР-трубки для защиты экспонированной линзы GRIN до прикрепления основания минископа к черепу мыши. (E) Держатель минископа (основание) с шестигранной гайкой. (F) Минископ, резьбовая часть которого обернута лентой из PTFE. (G) Минископ, прикрепленный к его основанию с помощью стопорного винта. (H) Минископ, держащий руку. (I) Специально изготовленный 3D-моторизованный контроллер, используемый для облегчения перемещения минископа в положениях XYZ. (J) Защитный колпачок, прикрепленный к основанию для защиты открытой линзы GRIN, в то время как мышь не выполняет визуализацию кальция in vivo . (K) Минископ, подключенный к кабелю. (L) Система сбора данных для визуализации in vivo Ca2+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Рисунок 3: Интерфейсы программного обеспечения AutoStereota во время послойной аспирации мозговой ткани. (A) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.1 - 2.17.3. (B) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.4-2.17.6. (C) Интерфейс, соответствующий шагам 2.17.7-2.17.9. D) интерфейс, соответствующий шагам 2.17.10-2.17.12. Красными полями выделены входные значения. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Рисунок 4: Интерфейсы программного обеспечения NeuView и программного обеспечения для записи поведения во время визуализации кальция in vivo . (A) Интерфейс NeuView. (В,С) Интерфейсы программного обеспечения для записи поведения. Красными полями выделены кнопки, которые необходимо нажать. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Рисунок 5: Карты клеток максимальной проекции флуоресценции для отображения диапазона возможных исходов. (A,B) Неудачная визуализация кальция in vivo , которая неприемлема для последующего анализа данных. (A) темный и содержит менее 5 активных нейронов. (B) яркий, но не имеет активных нейронов. (C) Клеточная карта из субоптимальной визуализации кальция in vivo , которая содержит некоторые активные нейроны. (D) Клеточная карта из хорошей визуализации кальция in vivo , которая включает в себя несколько сотен активных нейронов. Шкала: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативная клеточная карта и переходные процессы кальция из успешной визуализации кальция in vivo . Левая панель представляет собой карту клеток максимальной проекции флуоресценции из записи визуализации кальция in vivo в mPFC во время испытания в открытом поле. Запись длится 5 минут. На правой панели показаны переходные процессы кальция из 15 областей, представляющих интерес (в соответствии с цветом). Шкала: 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Рисунок 7: Посмертная оценка экспериментальной мыши. Посмертная оценка экспрессии GCaMP6f и имплантации линзы GRIN в mPFC экспериментальной мыши. Прямоугольная область указывает путь для имплантации хрусталика GRIN. Зеленая зона под имплантированной областью линзы GRIN подтверждает, что GCaMP6f был экспрессирован, а линза GRIN была имплантирована именно в нужную область мозга. Cg, поясная кора; PrL, прелимбическая кора; IL, инфралимбическая кора. Шкала: 400 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1: Сравнение специализированной системы минископов в NIDA с другими минископическими системами 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>
Фильм 1: Запись изображений кальция in vivo с мыши mPFC во время испытания в открытом поле. В демонстрационных целях это видео показывает только 1 минуту записи. Исходная частота кадров записи составляет 10 кадров/с. Видео в 6 раз быстрее, чем оригинальная запись. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Минископ in vivo кальциевая визуализация является мощным методом для изучения динамики нейронов и микросхем у свободно ведущих себя мышей. Этот протокол описывает выполнение операций на головном мозге для достижения хорошей визуализации кальция in vivo с использованием минископа.

Стереотаксическая вирусная инъекция и имплантация линз с градиентным индексом для глубокой визуализации кальция in vivo

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Минископ in vivo кальциевая визуализация позволяет исследователям исследовать пространственно и временно скоординированную активность сотен нейронов в глубоких структурах мозга свободно ведущих себя животных. Минископ in vivo кальциевая визуализация предлагает множество преимуществ, в том числе возможность выполнять записи, которые являются специфическими для типа клеток, крупномасштабными и продольными. Наш хирургический протокол для вирусных инъекций и имплантации линз GRIN совместим с любыми коммерческими или специально построенными однофотонными и двумя фотонными системами визуализации для глубокой визуализации мозга in vivo кальция.Продемонстрировать процедуру будет Рашми Тхапа, аспирант из моей лаборатории. После дезинфекции выбритой хирургической области анестезированной мыши используйте скальпель, чтобы сделать двухсантиметровый разрез через кожу вдоль средней линии, чтобы обнажить лямбду и брегму черепа. После размещения 0,5-миллиметрового зубного бормашины в положение переднего заднего 1,94 миллиметра и медиального бокового 0,5 миллиметра от брегмы, приступайте к сверлению черепа.Далее загружают вирус в микролитровый шприц с помощью панели управления микронасоса и извлекают 500 нанолитров воздушного пузыря с последующим 800 нанолитрами вируса со скоростью потока 50 нанолитров в секунду. Медленно переместите иглу в мозговую ткань к целевой координате Z дорсального вентра 1,75 миллиметра, а затем слегка переместите ее вверх до координаты Z дорсального вентра 1,65 миллиметра. На панели управления настройте микронасос на впрыскивание 500 нанолитров вируса со скоростью потока 50 нанолитров в минуту, прежде чем нажать кнопку «Выполнить» для инъекции вируса.Когда инъекция закончится, выровняйте края кожи и аккуратно закройте разрез швом 4-0. Нанесите антибиотическую мазь на область шва, чтобы предотвратить инфекцию. Чтобы имплантировать градиентный индекс или линзу GRIN, иссечение треугольной области кожи высотой 1,5 сантиметра и основанием 1,5 сантиметра от передней стороны между глазами до задней стороны позади лямбды с помощью мелких ножниц.После того, как череп будет тщательно очищен и высушен, нанесите цианоакрилат на края кожи и прикрепите кожу к черепу. Через пять минут, когда цианоакрилат высохнет, расположите зубной бормашину диаметром 1,2 миллиметра в положение передней задней части 1,94 миллиметра, медиальной боковой 0,8 миллиметра от брегмы. Просверлите череп с последующим удалением твердой мозговой оболочки с помощью кончика иглы 30 калибра.Очистите все куски костного мусора острыми щипцами под углом 45 градусов. Затем прикрепите вручную отполированную тупую концевую иглу 27 калибра к держателю иглы, соединенному с роботизированной рукой, наклоненной под углом 10 градусов, и подключите другой конец держателя иглы к домашней вакуумной системе. Найдите кончик иглы, чтобы просто коснуться брегмы, прежде чем нажать кнопку Bregma, чтобы установить Z-координату брегмы на ноль.Установите входное значение X равным 0,8, входное значение Y 1,94, введите значение Z равным 1,0 и нажмите кнопку «Найти», чтобы переместить иглу на верхнюю часть просверленного отверстия на черепе. Центрируйте кончик иглы к просверленному отверстию и опустите его до нулевого положения Z. Включите вакуум и начните промывать открытую область мозга искусственной спинномозговой жидкостью или ACSF через систему трубок с гравитационным управлением, подключенную к игле 30-го калибра с изогнутым наконечником.ACSF непрерывно пузырится с газовой смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа при фильтрации через 0,2-микронный фильтр. Используя программное обеспечение AutoStereota, аспирация мозговой ткани завершится в четыре раунда. Для первого раунда аспирации убедитесь, что значение Z отображается как ноль.Затем в сеансе zStep щелкните и проверьте первую и вторую строки. Задайте значения для первой строки равными 0,2 и 1. Задайте значения для второй строки равными 0,15 и 4.В сеансе Mode установите размер иглы 27 калибра и 1.2. Набор Димс 0.9. Все остальные значения будут по умолчанию.Чтобы начать аспирацию, последовательно нажмите на кнопки NotSet, KeepZero и Пуск. Первый раунд аспирации генерирует карман колонны глубиной 0,8 миллиметра и диаметром 1 миллиметр. В третьем раунде аспирации щелкните и проверьте первую строку для сеанса zStep и установите значения для первой строки равными 1,8 и 1.В сеансе Mode установите размер иглы 27 калибра и 2.2. Начните стремление, сохранив другие ценности такими же, как и в предыдущем раунде. После третьего раунда аспирации глубина кармана колонны составляет 1,8 миллиметра.Последний раунд стремления — очистить кровь, скопившуюся на дне кармана. Установите значения для первой строки равными 1,6 и 1 в сеансе zStep и установите размер иглы 27 калибра и 2,2 и Dims 0,6 в сеансе mode перед началом аспирации. Как только карман освободится от крови, прекратите вакуум, прекратите орошение ACSF и подведите иглу на 2 миллиметра в координате Z и на 0,5 миллиметра вперед к центру.Поместите стерильный 1-миллиметровый хрусталик GRIN в карман мозговой ткани. Далее применяем расплавленную агарозу в промежутке между хрусталиком GRIN и мозговой тканью с помощью шпателя. После того, как агароза образует гель, удалите избыток агарозы с помощью микролопасти.Смешайте стоматологический цементный порошок и каталитическую жидкость в предварительно охлажденном смесительном колодце и нанесите слой самоотверждающегося клейкого смоляного цемента на череп, начиная с окружения линзы GRIN, а затем покрывая весь открытый череп. В чистом пластиковом колодце смешайте зубной цементный порошок и черный древесный уголь с жидкостью, чтобы нанести тонкий слой смеси поверх первого слоя зубного цемента. Дайте ему затвердеть в течение пяти минут.Подключите Miniscope к кабелю и включите специально разработанное программное обеспечение NuView. В NuView щелкните Оборудование, проверьте LED1 и нажмите кнопку Поток, чтобы просмотреть живые изображения. Чтобы остановить прямую трансляцию, нажмите кнопку Стоп.Затем поместите минископ в специально изготовленный минископ. С помощью моторизованных контроллеров расположите минископ чуть выше экспонированного объектива GRIN, сделав его параллельным поверхности объектива. Медленно опустите минископ к объективу GRIN и отрегулируйте его положение Z, пока не будет найдена лучшая плоскость фокусировки.Нанесите первый слой зубного цемента вокруг основания минископа без изменения положения минископа. После того, как цемент затвердеет, аккуратно снимите удерживающую руку, чтобы минископ мог самостоятельно стоять на головке мыши. Нанесите второй слой зубного цемента вокруг основания, чтобы заполнить все зазоры, гарантируя, что из зазоров не будет утечки светодиодного света.Дайте зубному цементу затвердеть. После кратковременного обезболивания мыши изофлураном ослабьте запирающий винт в основании небольшой отверткой перед снятием защитного колпачка и очистите поверхность линзы GRIN пропитанным ацетоном ватным тампоном. Подключите минископ к кабелю и запустите программное обеспечение NuView, чтобы начать определение наилучшей фокальной плоскости с регулировки положения минископа относительно основания путем слегка затяжки или ослабления с помощью тупых щипцов.Как только будет определена лучшая фокальная плоскость, затяните стопорный винт, прежде чем отсоединить кабель и поместить мышь обратно в домашнюю клетку. Включите программное обеспечение поведенческой камеры для просмотра арены поведения мыши с помощью функции прямой трансляции. Вручную отрегулируйте фокус верхней камеры.Выберите Триггер Строб и установите флажок Включить/выключить триггер, а затем нажмите кнопку Запись. Затем нажмите кнопку Обзор, чтобы выбрать место, где будут сохраняться записи поведения. Выберите нужный формат изображения.Поднесите мышь близко к арене и подключите miniscope к кабелю, подключенному к системе сбора данных. Затем поместите мышь в центр арены. В программном обеспечении поведенческой камеры нажмите кнопку Начать запись.В NuView проверьте LED1, нажмите «Захват», а затем запустите кнопки, чтобы начать запись. Это позволяет одновременно записывать визуализацию кальция и поведение мыши. Нажмите «Стоп» через 3 000 кадров и сохраните файлы.Когда запись будет завершена, кратковременно обезболите мышь изофлураном, отсоедините минископ от основания и наденьте защитный колпачок на основание, прежде чем поместить мышь обратно в ее домашнюю клетку. Клеточная карта из субоптимальной визуализации кальция in vivo содержала некоторые активные нейроны, в то время как карта успешной визуализации включала несколько сотен активных нейронов в сфокусированной области. В типичном примере неудачной визуализации кальция in vivo область была темной и содержала менее пяти активных нейронов, или область была яркой, но не имела активных нейронов.В репрезентативном анализе показана карта клеток максимальной проекции флуоресценции и переходных процессов кальция из последовательной записи визуализации кальция in vivo. Посмертная оценка экспрессии GCaMP6f и имплантация линзы GRIN в медиальный PFC экспериментальной мыши показали, что GCaMP6f был экспрессирован и линза GRIN была имплантирована точно в нужную область мозга. Чтобы получить хорошую визуализацию кальция, необходимо убедиться, что кровотечение полностью остановилось и поле свободно от сгустков крови, прежде чем имплантировать линзу GRIN.Этот метод может быть использован для изучения изменений нейронной цепи в мышиной модели различных расстройств головного мозга человека и проверки, может ли кандидат на лекарство нормализовать измененную схему.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Функциональные нейровизуализации с использованием ультразвуковых Гематоэнцефалический Разрушение барьеров и марганца-МРТ

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Расширение эмбриональных и взрослых нервных стволовых клеток путем<em&gt; В Utero</em&gt; Электропорации или вирусных Стереотаксическая инъекций

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Стереотаксическая инъекции вирусных векторов для генной манипуляции Условные в спинной мозг мыши

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Глубокая стимуляция мозга с одновременным МРТ в Грызуны

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Интрацеребровентрикулярное Вирусный Инъекция по неонатологии мозга мыши для устойчив и распространен нейронов трансдукции

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Неинвазивная паренхимы, сосудов и метаболических Высокочастотный ультразвук и Фотоакустическая Крыса Deep Brain изображений

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

В Vivo Функциональное мозга изображений подход, основанный на Биолюминесцентный кальция Индикатор GFP-акворина

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Кальция изображений для визуализации мозга ответы на эндокринных сигнализации в дрозофилы

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Кальций Изображения в мыши Нижняя Оливковая

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Кальций и гемодинамическая визуализация перицитов головного мозга у трансгенных мышей In Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...