Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Detta arbete stöds av bidrag från National Institute of Health (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 och UG3NS115608.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Författarna rapporterar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

En central fråga inom neurovetenskapen är att förstå hur neural dynamik och kretsar kodar och lagrar information, och hur de förändras vid hjärnsjukdomar. Med hjälp av ett miniskop in vivo Ca2+ bildsystem kan individuell neural aktivitet från flera hundra neuroner inom en lokal mikrokrets övervakas samtidigt från ett fritt uppträdande djur. Här beskrivs ett detaljerat kirurgiskt protokoll för viral injektion och GRIN-linsimplantation för att förbereda gnagare för en djup hjärna in vivo Ca2+ -avbildning via ett specialutvecklat miniskopinspelningssystem. Tabell 1 visar jämförelserna av vårt miniskopsystem med andra kommersiellt tillgängliga och specialbyggda miniskopsystem 7,8,9,10,11,13,25,26. Det är värt att notera att GRIN-linsimplantation med det nuvarande kirurgiska protokollet är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för en djup hjärna in vivo kalciumavbildning.
Från viral injektion till datainsamling av miniskop in vivo kalciumavbildning, hela experimentella proceduren tar minst 2 månader att slutföra. Det är en komplicerad och arbetsintensiv process. Experimentets slutliga framgång beror på flera faktorer, inklusive korrekt val av GECI, injektion av virus exakt i det riktade hjärnområdet, tillräckligt viralt uttryck i den önskade neurala befolkningen, implantation av GRIN-lins exakt på önskad plats, adekvat återhämtning från operationer, samt om allvarlig inflammation uppstår efter operationen och om djurets beteende påverkas allvarligt av operationer, och så vidare.
Två kritiska steg inkluderar stereotaxisk injektion av virus och GRIN-linsimplantation. För demonstrationsändamålet utfördes stereotaxisk mikroinjektion i musen mPFC, med adenoassocierat virus (AAV1) som kodar för GCaMP6f under kontroll av CaMKII-promotorn som selektivt märker pyramidala neuroner i mPFC. GCaMP6f valdes eftersom det är en av de snabbaste och mest känsliga kalciumindikatorerna med en halv sönderfallstid på 71 ms15. Dessutom är AAV-viralt uttryck av GCaMP6f långvarigt (dvs. flera månader), vilket gör det idealiskt för att utföra repetitiv in vivo Ca2+ avbildning under en lång period för longitudinella studier i musmodeller av neurodegenerativa sjukdomar27. Det nuvarande operationsprotokollet kan anpassas för att rikta in sig på olika cellpopulationer i någon annan hjärnregion. Olika tillgängliga virala verktyg möjliggör selektiv märkning av specifika neurala populationer i önskad hjärnregion vid önskad ålder. Dessutom kan forskare dra nytta av Cre-LoxP-rekombinationssystemet och olika tillgängliga transgena musmodeller för att utföra genetiska modifieringar och studera beteendemässiga och neurala kretsar resultat28,29.
En unik egenskap hos det presenterade protokollet är att den automatiserade skikt-för-lager-hjärnvävnadsaspirationen utfördes före GRIN-linsen (1 mm i diameter) implantation. Detta uppnås genom en 27 G nål ansluten till ett vakuumsystem, styrd av en specialbyggd robotarm och programvara23. Baserat på vår erfarenhet genererar denna metod en enhetlig yta för GRIN-linsen att kontakta och orsakar mindre skada på den närliggande vävnaden än manuell vävnadsaspiration23. Av denna anledning ger denna procedur en uppenbar fördel för GRIN-linser med en relativt större diameter (t.ex. 1 mm). Vävnadsaspiration kanske dock inte är nödvändig för att implantera en GRIN-lins med en mindre diameter (0,5 mm eller 0,25 mm). Istället kan den planteras direkt längs det ledande spåret med en 30 G nål21.
Förutom de två kritiska stegen som diskuterats ovan måste många andra faktorer noggrant övervägas för en framgångsrik operation. (1) Alla instrument som kommer i kontakt med hjärnan bör steriliseras för att förhindra infektion. (2) Alla kirurgiska steg måste utföras för att minimera skador på hjärnan för att förhindra ytterligare inflammation och överdriven ärrvävnadsbildning. (3) De anestesidoser som ges initialt och upprätthålls under operationen, särskilt de som administreras intraperitonealt, måste noggrant övervägas. Anestesidoserna kan modifieras enligt olika musstammar, eftersom vissa kan vara mer mottagliga. (4) Musens tillstånd måste övervakas ständigt under operationen. Slutligen, (5) mössen måste övervakas regelbundet efter operationen, eftersom många komplikationer kan uppstå efter operationen.
Även om en bit hjärnvävnad avlägsnas ensidigt under GRIN-linsimplantationssteget, observerade vi inga uppenbara beteendeunderskott 7,12. Miniskopets vikt är cirka 2 gram och kabeln är specialdesignad för att göra den lätt och för att säkerställa att musen enkelt kan bära den. Miniskopet och kabeln fästs endast på djuret före in vivo-avbildning och lossas efter avbildning. Hela avbildningsprocessen tar vanligtvis inte längre än 30 minuter. Därför hindrar dessa instrumentationer inte musen från att bete sig fritt. Miniskopinstallations- och avinstallationsstegen behöver en kort anestesi (mindre än 2 minuter) med isofluran för djurhållning. Vi låter vanligtvis musen återhämta sig från den korta exponeringen av isofluran i 30 minuter innan vi utför in vivo-avbildning. Vi har utfört miniskop in vivo kalciumavbildning en gång i veckan i några veckor utan att märka någon inverkan på musens hälsa och musens sociala beteende12.
En stor begränsning av det nuvarande miniskopinspelningssystemet är behovet av att ansluta mikroskopet till en kabel för datainsamling. Närvaron av kabeln begränsar ibland musens uppgiftsprestanda och begränsar inspelningen av ett djur i taget. Nyligen har ett trådlöst miniskop utvecklats25,26. Detta kommer att bredda uppgiftsprestandan och möjliggöra samtidig in vivo-avbildning från flera djur i en grupp. Dessutom kommer utvecklingen av mer känsliga GECI med spektralt separerbara våglängder i kombination med ett dubbelfärgsminiskop att erbjuda mer spännande möjligheter för neurovetenskaplig forskning.

Intracellulär Ca2+ signalering är en viktig regulator för celltillväxt, proliferation, differentiering, migration, gentranskription, utsöndring och apoptos1. I neuroner styrs Ca2+ signalering exakt eftersom dess spatio-temporala mönster är relaterat till avgörande funktioner som membran excitabilitet, neurotransmittorfrisättning och synaptisk plasticitet2.
In vivo kalciumavbildning är en kraftfull teknik som kan användas för att avkoda neural kretsrepresentation elementär till normalt djurbeteende, identifiera avvikande neuronala aktiviteter i djurmodeller av hjärnsjukdomar och riva upp potentiella terapeutiska mål som kan normalisera dessa förändrade kretsar. De två vanliga in vivo kalciumavbildningssystemen är tvåfotonlaserskanning fluorescensmikroskopi 3,4,5,6 och huvudmonterad miniatyriserad mikroendoskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Den konventionella tvåfotonmikroskopin erbjuder befallande fördelar som bättre upplösning, lägre brus och lägre fotoblekning; Försöksdjuren måste dock vara huvudfastade, vilket begränsar de beteendestudier som kan utföras 3,4,5,6. Däremot är det huvudmonterade miniskopsystemet litet och bärbart, vilket gör det möjligt att studera en mängd olika beteendetester med fritt uppträdande djur 7,8,9,10,11,12,13.
Det finns två ledande Ca2+ indikatorer, kemiska indikatorer 5,14 och genetiskt kodade kalciumindikatorer (GECI)15,16. Ca2+ avbildning har underlättats genom att använda mycket känsliga GECI levererade med virala vektorer som möjliggör specifik märkning av neuroner i den riktade kretsen. Den kontinuerliga ansträngningen att förbättra känsligheten, livslängden och förmågan att märka även de subcellulära facken gör GECI idealiska för olika in vivo kalciumavbildningsstudier 17,18,19.
Spridningen av ljus i hjärnvävnad under avbildning begränsar den optiska penetrationen på djupet, även med tvåfotonmikroskopi. Gradient Index (GRIN) -linsen övervinner dock detta problem eftersom GRIN-linsen kan bäddas in direkt i de biologiska vävnaderna och vidarebefordra bilder från den djupa hjärnregionen till mikroskopmålet. Till skillnad från konventionell lins tillverkad av optiskt homogent material och kräver en komplicerad formad yta för att fokusera och skapa bilder, är GRIN-linsens prestanda baserad på en gradvis brytningsindexförändring i linsmaterialet som uppnår fokus med en plan yta20. GRIN-linsen kan tillverkas ner till 0,2 mm i diameter. Därför kan en miniatyriserad GRIN-lins implanteras i den djupa hjärnan utan att orsaka för mycket skada.
I denna artikel presenteras ett komplett kirurgiskt protokoll för den djupa hjärnan in vivo kalciumavbildning. För demonstrationsändamålet beskriver vi hjärnoperationer som specifikt riktar sig mot mushjärnans mediala prefrontala cortex (mPFC) och in vivo kalciumavbildningsinspelning via ett specialbyggt miniskopsystem som utvecklats av Dr. Lins grupp vid National Institute on Drug Abuse (NIDA / IRP) 7,12. Det experimentella förfarandet involverar två stora hjärnoperationer. Den första operationen injicerar stereotaxiskt en viral vektor som uttrycker GCaMP6f (en GECI) i mPFC. Den andra operationen är att implantera GRIN-linsen i samma hjärnregion. Efter återhämtning från dessa hjärnoperationer är det efterföljande förfarandet att fästa miniskophållaren (basen) på musskallen med tandcement. In vivo Ca2+ avbildning kan utföras när som helst efter montering av miniskopet på basen. Operationsprotokollet för viral injektion och GRIN-linsimplantation är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för den djupa hjärnan in vivo kalciumavbildning.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Ett miniatyrfluorescensmikroskop (miniskop) är ett potent verktyg för in vivo kalciumavbildning från fritt uppträdande djur. Det erbjuder flera fördelar jämfört med konventionella kalciumavbildningssystem med flera fotoner: (1) kompakt; (2) lätt vikt, (3) överkomligt; och (4) tillåter inspelning från fritt uppträdande djur. Detta protokoll beskriver hjärnoperationer för djup hjärna in vivo kalciumavbildning med hjälp av ett specialutvecklat miniskopinspelningssystem. Beredningsförfarandet består av tre steg, inklusive (1) stereotaxiskt injicera viruset vid den önskade hjärnregionen i en mushjärna för att märka en specifik undergrupp av neuroner med genetiskt kodad kalciumsensor; (2) implantation av gradientindex (GRIN) lins som kan vidarebefordra kalciumbild från djup hjärnregion till miniskopsystemet; och (3) fästa miniskophållaren över musskallen där miniskop kan fästas senare. För att utföra in vivo kalciumavbildning fästs miniskopet på hållaren och neuronala kalciumbilder samlas in tillsammans med samtidiga beteendeinspelningar. Det nuvarande kirurgiska protokollet är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och tvåfotonavbildningssystem för djup hjärna in vivo kalciumavbildning.

Figur 1 visar det schematiska experimentella förfarandet, inklusive viral injektion, GRIN-linsimplantation, anbringande av miniskopbasen på musskallen och in vivo kalciumavbildning via ett miniskop. Hela proceduren tar ~ 2 månader. Figur 2 visar de viktigaste komponenterna som beskrivs i protokollet för miniskop in vivo kalciumavbildning. Figur 3 visar gränssnitten för AutoStereota-programvaran under GRIN-linsimplantation. Figur 4 visar gränssnitten för NeuView och programvara för beteenderegistrering under in vivo-kalciumavbildning .
Resultatet av kalciumavbildning in vivo är beroende av framgången för både virusinjektion och GRIN-linsimplantationsoperationer. Figur 5 visar en rad resultat (dvs. misslyckade, suboptimala och bra) från in vivo kalciumavbildningsinspelningar. I misslyckade fall kan kalciumbilden verka antingen mörk eller ljus men avslöjar vanligtvis inga eller mycket få aktiva neuroner. Vi bedriver vanligtvis inte in vivo kalciuminspelningsexperiment om det finns färre än fem aktiva neuroner. En bra in vivo kalciumavbildning avslöjar vanligtvis flera hundra aktiva neuroner. Om en inspelning innehåller mindre än hundra aktiva neuroner anser vi att det är en suboptimal inspelning.
I både suboptimala och bra inspelningar in vivo genomfördes kalciumavbildningsexperiment, och den efterföljande dataanalysen utfördes. Film 1 visar en representativ in vivo kalciumavbildningsinspelning från musen mPFC. Beteendevideor och kalciumavbildningsdata bearbetas vanligtvis separat. Videor med musbeteende kan poängsättas manuellt. Kalciumavbildningsfiler bearbetas med hjälp av CaImAn kalciumbildbehandlingsverktygslåda24. Figur 6 visar en representativ cellkarta och flera kalciumspår från en bra in vivo-kalciumavbildningsinspelning .
Efter avslutad in vivo kalciumavbildning är det sista steget att bekräfta om virusinjektionen och GRIN-linsimplantationen har inträffat i önskad hjärnregion. För detta ändamål perfusionerades musen med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) följt av 4% paraformaldehyd (PFA). Mushjärnan skördades, postfixerades i 4% PFA i 12 timmar och lagrades i PBS vid 4 ° C. Mushjärnan sektionerades sedan i 50 μm tjocka skivor med en vibratom. Hjärnskivorna färgades med DAPI och observerades under mikroskopet (beskrivs inte i protokollet)12. Figur 7 är en mushjärnskiva ~ 1,94 mm främre till bregma från en experimentell mus, som visar spåret där GRIN-linsen implanterades. Det gröna fluorescensområdet under och runt GRIN-linsspåret indikerar uttrycket av GCaMP6f i mPFC-regionen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Figur 1: Schematisk översikt över det experimentella förfarandet. (A) Stereotaxisk injektion av virus i mPFC. (B) GRIN-linsimplantation i mPFC. (C) Anbringande av miniskopbas på musskallen. (D) Miniskopmontering och kalciumavbildning in vivo . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Figur 2: Huvudkomponenter som behövs för kalciumavbildning in vivo . (A) Ett GRIN-objektiv med en diameter på 1 mm och en längd på 4,38 mm. (B) En 27 G manuellt polerad trubbig nål som används för hjärnvävnadsaspiration. (C) Robotarmen kopplad till nålhållaren. (D) Ett skräddarsytt lock från ett PCR-rör för att skydda den exponerade GRIN-linsen tills miniskopbasen fästs på musskallen. (E) Miniskophållaren (basen) med en insexmutter. F) Ett miniskop vars gängdel är lindad med PTFE-tejpen. (G) Ett miniskop fäst vid basen med en låsskruv. (H) Miniskopets hållarm. (I) En specialbyggd 3D-motoriserad styrenhet som används för att underlätta miniskopets rörelse i XYZ-positioner. (J) Ett skyddslock fäst på basen för att skydda den exponerade GRIN-linsen medan musen inte utför kalciumavbildning in vivo . (K) Miniskopet som är anslutet till kabeln. (L) Datainsamlingssystemet för in vivo Ca2+ avbildning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Figur 3: Gränssnitt för AutoStereota-programvara under aspiration av hjärnvävnad lager för lager. (A) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.1 till 2.17.3. (B) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.4–2.17.6. (C) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.7–2.17.9. (D) Gränssnittet som motsvarar steg 2.17.10–2.17.12. Röda rutor markerar ingångsvärdena. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Figur 4: Gränssnitt för NeuView-programvaran och beteendeinspelningsprogramvaran under in vivo-kalciumavbildning . (A) Gränssnittet för NeuView. (B,C) Gränssnitten för beteendeinspelningsprogramvaran. Röda rutor markerar knappar som måste klickas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Figur 5: Maximal projektionsfluorescens cellkartor för att visa intervallet av möjliga resultat. (A,B) Misslyckad in vivo kalciumavbildning som inte är acceptabel för efterföljande dataanalys. (A) är mörk och innehåller mindre än 5 aktiva nervceller. (B) är ljus men har inga aktiva nervceller. (C) Cellkartan från en suboptimal in vivo kalciumavbildning som innehåller några aktiva neuroner. (D) Cellkartan från en bra in vivo kalciumavbildning som innehåller flera hundra aktiva neuroner. Skalstång: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Figur 6: Representativ cellkarta och kalciumtransienter från en framgångsrik in vivo-kalciumavbildning. Den vänstra panelen är den maximala projektionsfluorescenscellkartan från en in vivo-kalciumavbildningsinspelning i mPFC under ett öppet fälttest. Inspelningen varar i 5 minuter. Den högra panelen visar kalciumtransienter från 15 intressanta regioner (färgmatchade). Skalstång: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Figur 7: Postmortembedömning av en experimentell mus. Postmortembedömningen för GCaMP6f-uttryck och GRIN-linsimplantation i mPFC hos en experimentell mus. Det rektangulära området anger vägen för GRIN-linsimplantation. Det gröna området under GRIN-linsen implanterade regionen bekräftar att GCaMP6f uttrycktes och GRIN-linsen implanterades exakt i önskad hjärnregion. Cg, cingulära cortex; PrL, prelimbisk cortex; IL, infralimbisk cortex. Skalstång: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
Tabell 1: Jämförelser av det specialbyggda miniskopsystemet vid NIDA med andra miniskopsystem 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner denna tabell.</a>
Film 1: En in vivo kalciumavbildningsinspelning från musen mPFC under ett öppet fälttest. För demonstrationsändamål visar den här videon endast 1 min inspelning. Den ursprungliga inspelningsbildhastigheten är 10 bilder / s. Videon är 6 gånger snabbare än originalinspelningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filmen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniscope in vivo kalciumavbildning är en kraftfull teknik för att studera neuronal dynamik och mikrokretsar i fritt uppträdande möss. Detta protokoll beskriver att utföra hjärnoperationer för att uppnå god kalciumavbildning in vivo med hjälp av ett miniskop.

Stereotaxisk viral injektion och gradientindexlinsimplantation för djup hjärna in vivo kalciumavbildning

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniskop in vivo kalciumavbildning ger forskare möjlighet att undersöka den rumsligt och temporärt samordnade aktiviteten från hundratals neuroner i djupa hjärnstrukturer hos fritt uppträdande djur. Miniskop in vivo kalciumavbildning erbjuder många fördelar, inklusive möjligheten att utföra inspelningar som är celltypsspecifika, storskaliga och längsgående. Vårt kirurgiska protokoll för viral injektion och GRIN-linsimplantation är kompatibelt med alla kommersiella eller specialbyggda enfoton- och två fotonavbildningssystem för den djupa hjärnan in vivo kalciumavbildning.Demonstrerar proceduren kommer att vara Rashmi Thapa, en doktorand från mitt laboratorium. Efter desinfektion av det rakade kirurgiska området hos en sövd mus, använd en skalpell för att göra ett snitt på två centimeter genom huden längs mittlinjen för att exponera skallens lambda och bregma. Efter att ha lokaliserat 0,5 millimeter tandborrborr till en position av främre bakre 1,94 millimeter och medial lateral 0,5 millimeter från bregma, börja borra genom skallen.Ladda sedan viruset i mikrolitersprutan med hjälp av mikropumpens kontrollpanel och dra tillbaka 500 nanoliter luftbubbla följt av 800 nanoliter av viruset med en flödeshastighet på 50 nanoliter per sekund. Flytta långsamt ner nålen i hjärnvävnaden till den riktade Z-koordinaten för dorsal ventral 1,75 millimeter och flytta den sedan något upp till Z-koordinaten för dorsal ventral 1,65 millimeter. På kontrollpanelen ställer du in mikropumpen för att injicera 500 nanoliter av viruset med en flödeshastighet på 50 nanoliter per minut innan du trycker på Kör-knappen för att injicera viruset.När injektionen är över, rikta upp hudkanterna och stäng försiktigt snittet med en 4-0 sutur. Applicera antibiotikasalva på det sydda området för att förhindra infektion. För att implantera gradientindex eller GRIN-lins, punktskatta ett triangulärt område av huden med 1,5 centimeter höjd och 1,5 centimeter bas från den främre sidan mellan ögonen till den bakre sidan bakom lambda med fin sax.När skallen är noggrant rengjord och torkad, applicera cyanoakrylat på hudens kanter och fäst huden på skallen. Efter fem minuter när cyanoakrylatet torkar, lokalisera en tandborrborr med 1,2 millimeter diameter till en position av främre bakre 1,94 millimeter, medial lateral 0,8 millimeter från bregma. Borra genom skallen, följt av att ta bort dura med en 30 gauge nålspets.Rengör alla bitar av benskräp med 45 graders vinklade vassa pincett. Fäst sedan en 27 gauge manuellt polerad trubbig ändnål på nålhållaren kopplad till en robotarm lutad med en vinkel på 10 grader och anslut den andra änden av nålhållaren till husvakuumsystemet. Leta reda på nålens spets för att bara röra vid bregma innan du klickar på Bregma-knappen för att ställa in Z-koordinaten för bregma till noll.Ställ in ingång X-värde till 0,8, mata in Y-värde till 1,94, mata in Z-värde till 1,0 och klicka på Sök-knappen för att flytta nålen till toppen av det borrade hålet på skallen. Centrera nålens spets till det borrade hålet och ta ner det till Z-läge noll. Slå på vakuumet och börja skölja det exponerade hjärnområdet med konstgjord cerebrospinalvätska, eller ACSF, genom ett gravitationsstyrt slangsystem anslutet till en 30 gauge nål med en böjd spets.ACSF bubblas kontinuerligt med en gasblandning av 95% syre och 5% koldioxid medan den filtreras genom ett 0,2 mikron filter. Med hjälp av AutoStereota-programvaran kommer aspiration av hjärnvävnaden att slutföras i fyra omgångar. För den första aspirationsomgången, se till att Z-värdet visar noll.Klicka sedan på och kontrollera första och andra raden i zStep-sessionen. Ange värdena för den första raden till 0,2 och 1. Ange värdena för den andra raden till 0,15 och 4.I lägessessionen ställer du in nålstorlek 27 mätare och 1.2. Ställ in Dims 0,9. Alla andra värden är standard.För att starta ambitionen, klicka sekventiellt på knapparna NotSet, KeepZero och Start. Den första aspirationsrundan genererar en kolonnficka med 0,8 millimeter djup och 1 millimeter i diameter. I den tredje ambitionsrundan klickar du på och kontrollerar den första raden för zStep-sessionen och ställer in värdena för den första raden till 1,8 och 1.I lägessessionen ställer du in nålstorlek 27 mätare och 2.2. Börja ambitionen genom att hålla andra värden desamma som i föregående omgång. Efter den tredje aspirationsrundan är kolonnfickans djup 1,8 millimeter.Den sista aspirationsrundan är att städa upp blod som ackumuleras i botten av fickan. Ställ in värdena för den första raden till 1,6 och 1 i zStep-sessionen och ställ in nålstorlek 27 gauge och 2,2 och Dims 0,6 i Mode session innan du startar ambitionen. När fickan är blodfri, stoppa vakuumet, stoppa bevattningen av ACSF och sätt nålen upp 2 millimeter i Z-koordinat och 0,5 millimeter främre till mitten.Placera den sterila 1 millimeter GRIN-linsen i hjärnvävnadsfickan. Applicera sedan den smälta agarosen i klyftan mellan GRIN-linsen och hjärnvävnaden med hjälp av en spatel. Efter att agaros bildar en gel, ta bort överskott av agaros med ett mikroblad.Blanda tandcementpulvret och katalysatorvätskan i en förkyld blandningsbrunn och applicera ett lager självhärdande självhärdande självhäftande hartscement på skallen, börja med att omge GRIN-linsen och sedan täcka hela den exponerade skallen. Blanda i en ren plastbrunn tandcementpulver och svart kol med vätska för att applicera ett tunt lager av blandningen ovanpå det första lagret av dentalcement. Låt det härda i fem minuter.Anslut miniskopet till kabeln och slå på den specialutvecklade programvaran NuView. I NuView klickar du på Maskinvara, kontrollerar LED1 och klickar på Stream-knappen för att visa livebilderna. För att stoppa livestreaming, klicka på Stopp-knappen.Sätt sedan miniskopet i en specialbyggd miniskophållarm. Med hjälp av motoriserade styrenheter, lokalisera miniskopet strax ovanför den exponerade GRIN-linsen, vilket gör den parallell med linsens yta. För långsamt ner miniskopet mot GRIN-objektivet och justera dess Z-position tills det bästa fokusplanet hittas.Applicera det första lagret tandcement runt miniskopbasen utan att ändra miniskopets position. När cementet är härdat, ta försiktigt bort hållarmen så att miniskopet kan stå på egen hand på mushuvudet. Applicera ett andra lager tandcement runt basen för att fylla alla luckor, så att det inte finns något LED-ljusläckage från luckorna.Låt tandcementet härda. Efter att ha bedövat musen kort med isofluran, lossa låsskruven i basen med en liten skruvmejsel innan du tar bort skyddslocket och rengör ytan på GRIN-linsen med en acetonindränkt bomullspinne. Anslut miniskopet till kabeln och starta NuView-programvaran för att börja identifiera det bästa fokalplanet med att justera miniskopets position i förhållande till basen genom att dra åt eller lossa något med hjälp av trubbiga pincett.När det bästa fokalplanet har bestämts, dra åt låsskruven innan du kopplar bort kabeln och placerar musen tillbaka i sin hembur. Slå på beteendekamerans programvara för att se musbeteendearenan genom en livestream-funktion. Justera fokus för den övre kameran manuellt.Välj Trigger Strobe och markera aktivera / inaktivera utlösare, följt av att klicka på Spela in knapp. Använd sedan Bläddra för att välja en plats där beteendeinspelningar ska sparas. Välj önskat bildformat.För musen nära arenan och anslut miniskopet till kabeln som är kopplad till datainsamlingssystemet. Placera sedan musen i mitten av arenan. Klicka på Starta inspelning i programvaran för beteendekamera.I NuView, kontrollera LED1, klicka på Capture och triggerknapparna för att starta inspelningen. Detta möjliggör samtidiga inspelningar av kalciumavbildning och musbeteende. Hit Sluta efter 3000 bilder och spara filerna.När inspelningen är klar, bedöva musen kort med isofluran, lossa miniskopet från basen och sätt skyddslocket över basen innan du placerar musen tillbaka i sin hembur. Cellkartan från suboptimal in vivo kalciumavbildning innehöll några aktiva neuroner, medan den från framgångsrik avbildning inkluderade flera hundra aktiva neuroner i det fokuserade området. I det typiska exemplet på en misslyckad in vivo-kalciumavbildning observerades regionen vara mörk och innehöll mindre än fem aktiva neuroner, eller regionen var ljus men hade inga aktiva neuroner.I den representativa analysen visas den maximala projektionsfluorescenscellkartan och kalciumtransienterna från en successiv in vivo-kalciumavbildningsinspelning. Postmortembedömningen för GCaMP6f-uttryck och GRIN-linsimplantation i den mediala PFC av en experimentell mus indikerade att GCaMP6f uttrycktes och GRIN-linsen implanterades exakt i önskad hjärnregion. För att få en bra kalciumavbildning är det nödvändigt att se till att blödningen helt har slutat och fältet är fritt från blodproppar innan GRIN-linsen implanteras.Denna teknik kan användas för att studera neurala kretsförändringar i musmodellen av olika mänskliga hjärnstörningar och testa om en läkemedelskandidat kan normalisera de förändrade kretsarna.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Funktionell hjärnavbildning med ultraljud Blod-hjärnbarriären störningar och mangan-förstärkt MRT

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Utbyggnad av embryonala och vuxna neurala stamceller genom<em&gt; I Utero</em&gt; Elektroporering eller viral stereotaxisk injektion

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Stereotaktisk injektion av en viral vektor för villkorad Gene Manipulation i ryggmärgen hos möss

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Deep Brain Stimulation med samtidig fMRI i Gnagare

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Intracerebroventrikulär Viral Injektion av neonatal mus hjärnans för långlivade och Utbredd neuronal Transduktion

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Icke-invasiv parenkyma, Vascular och Metabolic Högfrekventa Ultraljud och Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging strategi som bygger på Bioluminescent Kalcium indikator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Kalcium Imaging för att visualisera hjärnan Svaren till endokrin signalering i Drosophila

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Kalciumavbildning i mus underlägsen oliv

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Hjärnans pericytkalcium och hemodynamisk avbildning hos transgena möss in Vivo

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...