Name: stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging
Uploaded: 2021-10-08T14:00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüsü (NIH) 5P20GM121310, R61NS115161 ve UG3NS115608'den gelen hibelerle desteklenmektedir.

<ol>
	<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+signaling.">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li><li>Brini, M., Cali, T., Ottolini, D., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+calcium+signaling:+function+and+dysfunction.">Neuronal calcium signaling: function and dysfunction.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (15), 2787-2814 (2014).</li><li>Chen, T. W., Li, N., Daie, K., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Map+of+Anticipatory+Activity+in+Mouse+Motor+Cortex.">A Map of Anticipatory Activity in Mouse Motor Cortex.</a> Neuron. 94 (4), 866-879 (2017).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>Komiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning-related+fine-scale+specificity+imaged+in+motor+cortex+circuits+of+behaving+mice.">Learning-related fine-scale specificity imaged in motor cortex circuits of behaving mice.</a> Nature. 464 (7292), 1182-1186 (2010).</li><li>Peters, A. J., Lee, J., Hedrick, N. G., O'Neil, K., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reorganization+of+corticospinal+output+during+motor+learning.">Reorganization of corticospinal output during motor learning.</a> Nature Neuroscience. 20 (8), 1133-1141 (2017).</li><li>Barbera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+compact+neural+clusters+in+the+dorsal+striatum+encode+locomotion+relevant+information.">Spatially compact neural clusters in the dorsal striatum encode locomotion relevant information.</a> Neuron. 92 (1), 202-213 (2016).</li><li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time.">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li><li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NINscope,+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations.">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987 (2020).</li><li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope.">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li><li>Jacob, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+compact+head-mounted+endoscope+for+in+vivo+calcium+imaging+in+freely+behaving+mice.">A compact head-mounted endoscope for in vivo calcium imaging in freely behaving mice.</a> Current Protocols in Neuroscience. 84 (1), 51 (2018).</li><li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+and+Dynamic+ON+and+OFF+neural+ensembles+in+the+prefrontal+cortex+code+social+exploration.">Distinct and Dynamic ON and OFF neural ensembles in the prefrontal cortex code social exploration.</a> Neuron. 100 (3), 700-714 (2018).</li><li>Liberti, W. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unstable+neurons+underlie+a+stable+learned+behavior.">Unstable neurons underlie a stable learned behavior.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1665-1671 (2016).</li><li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks.">In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (12), 7319-7324 (2003).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Miyawaki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+Ca2++based+on+green+fluorescent+proteins+and+calmodulin.">Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin.</a> Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).</li><li>Bassett, J. J., Monteith, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+as+probes+to+assess+the+role+of+calcium+channels+in+disease+and+for+high-throughput+drug+discovery.">Genetically encoded calcium indicators as probes to assess the role of calcium channels in disease and for high-throughput drug discovery.</a> Advances in Pharmacology. 79, 141-171 (2017).</li><li>Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+indicators+of+neuronal+activity.">Genetically encoded indicators of neuronal activity.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).</li><li>Tian, L., Akerboom, J., Schreiter, E. R., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+activity+imaging+with+genetically+encoded+calcium+indicators.">Neural activity imaging with genetically encoded calcium indicators.</a> Progress in Brain Research. 196, 79-94 (2012).</li><li>Moore, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient-index+optics:+A+review.">Gradient-index optics: A review.</a> Applied Optics. 19 (7), 1035-1038 (1980).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miniscope+GRIN+Lens+System+for+Calcium+Imaging+of+Neuronal+Activity+from+Deep+Brain+Structures+in+Behaving+Animals.">Miniscope GRIN Lens System for Calcium Imaging of Neuronal Activity from Deep Brain Structures in Behaving Animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+two-step+GRIN+lens+coating+for+in+vivo+brain+imaging.">A two-step GRIN lens coating for in vivo brain imaging.</a> Neuroscience Bulletin. 35 (3), 419-424 (2019).</li><li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation.">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 83-88 (2019).</li><li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis.">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173 (2019).</li><li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+wireless+miniScope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice.">A wireless miniScope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 323, 56-60 (2019).</li><li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice.">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li><li>Werner, C. T., Williams, C. J., Fermelia, M. R., Lin, D. T., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circuit+mechanisms+of+neurodegenerative+diseases:+A+new+frontier+with+miniature+fluorescence+microscopy.">Circuit mechanisms of neurodegenerative diseases: A new frontier with miniature fluorescence microscopy.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1174 (2019).</li><li>Brault, V., Besson, V., Magnol, L., Duchon, A., Herault, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre/loxP-mediated+chromosome+engineering+of+the+mouse+genome.">Cre/loxP-mediated chromosome engineering of the mouse genome.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. (178), 29-48 (2007).</li><li>McLellan, M. A., Rosenthal, N. A., Pinto, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-loxP-mediated+recombination:+General+principles+and+experimental+considerations.">Cre-loxP-mediated recombination: General principles and experimental considerations.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 7 (1), 1-12 (2017).</li></ol>

Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını bildirmektedir.

Sinirbilimdeki merkezi bir soru, sinirsel dinamiklerin ve devrelerin bilgiyi nasıl kodladığını ve depoladığını ve beyin hastalıklarında nasıl değiştirildiğini anlamaktır. Bir miniskop in vivo Ca2+ görüntüleme sistemi kullanılarak, yerel bir mikro devre içindeki yüzlerce nörondan bireysel nöral aktivite, serbestçe davranan bir hayvandan aynı anda izlenebilir. Burada, kemirgenleri özel olarak geliştirilmiş bir miniskop kayıt sistemi aracılığıyla in vivo Ca2+ görüntülemeye derin bir beyin için hazırlamak için viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için ayrıntılı bir cerrahi protokol açıklanmaktadır. Tablo 1, miniskop sistemimizin ticari olarak temin edilebilen ve özel olarak üretilen diğer miniskop sistemleri 7,8,9,10,11,13,25,26 ile karşılaştırmalarını göstermektedir. Mevcut cerrahi protokolü kullanan GRIN lens implantasyonunun, derin bir beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemleriyle uyumlu olduğunu belirtmek gerekir.
Viral enjeksiyondan miniskobun in vivo kalsiyum görüntülemesinin veri toplanmasına kadar, tüm deneysel prosedürün tamamlanması en az 2 ay sürer. Karmaşık ve emek yoğun bir süreçtir. Deneyin nihai başarısı, GECI'lerin doğru seçimi, hedeflenen beyin bölgesine doğru virüs enjeksiyonu, istenen nöral popülasyonda yeterli viral ekspresyon, GRIN lensin tam olarak istenen yere implantasyonu, ameliyatlardan yeterli iyileşme, ayrıca ameliyat sonrası şiddetli inflamasyonun meydana gelip gelmediği ve hayvanın davranışının ameliyatlardan ciddi şekilde etkilenip etkilenmediği gibi birçok faktöre bağlıdır. ve benzeri.
İki kritik adım stereotaksik virüs enjeksiyonu ve GRIN lens implantasyonunu içerir. Gösterim amacıyla, stereotaksik mikroenjeksiyon, fare mPFC'sinde, mPFC'deki piramidal nöronları seçici olarak etiketleyen CaMKII promotörünün kontrolü altında GCaMP6f'yi kodlayan adeno ilişkili virüs (AAV1) ile gerçekleştirildi. GCaMP6f, 71 ms15'lik yarı bozunma süresine sahip en hızlı ve en hassas kalsiyum göstergelerinden biri olduğu için seçildi. Ek olarak, GCaMP6f'ın AAV viral ekspresyonu uzun ömürlüdür (yani, birkaç ay), nörodejeneratif hastalıkların fare modellerinde uzunlamasına çalışmalar için uzun bir süre boyunca tekrarlayan in vivo Ca2 + görüntüleme yapmak için idealdir27. Mevcut cerrahi protokol, başka herhangi bir beyin bölgesindeki farklı hücre popülasyonlarını hedeflemek için uyarlanabilir. Çeşitli mevcut viral araçlar, istenen yaşta istenen beyin bölgesindeki spesifik nöral popülasyonların seçici olarak etiketlenmesine izin verir. Ek olarak, araştırmacılar genetik modifikasyonlar yapmak ve davranışsal ve nöral devre sonuçlarını incelemek için Cre-LoxP rekombinasyon sisteminden ve çeşitli transgenik fare modellerinden yararlanabilirler28,29.
Sunulan protokolün benzersiz bir özelliği, otomatik katman katman beyin dokusu aspirasyonunun GRIN lens (1 mm çapında) implantasyonundan önce gerçekleştirilmiş olmasıdır. Bu, özel yapım bir robotik kol ve yazılım 23 tarafından kontrol edilen bir vakum sistemine bağlı27 G'lik bir iğne ile elde edilir. Deneyimlerimize dayanarak, bu yöntem GRIN lensin temas etmesi için düzgün bir yüzey oluşturur ve komşu dokuya manuel doku aspirasyonundan daha az zarar verir23. Bu nedenle, bu prosedür nispeten daha geniş çaplı (örneğin, 1 mm) GRIN lensler için belirgin bir avantaj sağlar. Bununla birlikte, daha küçük çaplı (0,5 mm veya 0,25 mm) bir GRIN lensin implante edilmesi için doku aspirasyonu gerekli olmayabilir. Bunun yerine, 30 G iğne21 ile yapılan öncü iz boyunca doğrudan ekilebilir.
Yukarıda tartışılan iki kritik adımın yanı sıra, başarılı bir operasyon için diğer birçok faktör de dikkatlice düşünülmelidir. (1) Beyne temas eden tüm aletler enfeksiyonu önlemek için sterilize edilmelidir. (2) Daha fazla inflamasyonu ve aşırı skar dokusu oluşumunu önlemek için beyne verilen hasarı en aza indirmek için tüm cerrahi adımların uygulanması gerekir. (3) Başlangıçta verilen ve ameliyat sırasında sürdürülen anestezi dozları, özellikle intraperitoneal olarak uygulananlar dikkatle düşünülmelidir. Anestezi dozları, bazıları daha duyarlı olabileceğinden, farklı fare suşlarına göre değiştirilebilir. (4) Ameliyat sırasında farenin durumu sürekli izlenmelidir. Son olarak, (5) farelerin ameliyat sonrası düzenli olarak izlenmesi gerekir, çünkü ameliyattan sonra birçok komplikasyon ortaya çıkabilir.
GRIN lens implantasyon adımı sırasında beyin dokusunun bir kısmı tek taraflı olarak çıkarılmasına rağmen, belirgin bir davranış eksikliği gözlemlemedik 7,12. Miniskopun ağırlığı yaklaşık 2 gramdır ve kablo, hafif hale getirmek ve farenin kolayca taşıyabilmesini sağlamak için özel olarak tasarlanmıştır. Miniskop ve kablo sadece in vivo görüntülemeden önce hayvana bağlanır ve görüntülemeden sonra ayrılır. Tüm görüntüleme işlemi genellikle 30 dakikadan fazla sürmez. Bu nedenle, bu araçlar farenin serbestçe davranmasını engellemez. Miniskop kurulum ve demontaj adımları, hayvan kısıtlaması amacıyla izofluran ile kısa bir anesteziye (2 dakikadan az) ihtiyaç duyar. Genellikle farenin in vivo görüntüleme yapmadan önce 30 dakika boyunca izoflurana kısa süre maruz kalmaktan kurtulmasına izin veriyoruz. Fare sağlığı ve fare sosyal davranışı üzerinde herhangi bir etki fark etmeden birkaç hafta boyunca haftada bir kez miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme yaptık12.
Mevcut miniskop kayıt sisteminin en büyük sınırlamalarından biri, mikroskobu veri toplama için bir kabloya bağlama ihtiyacıdır. Kablonun varlığı bazen fare görev performansını kısıtlar ve aynı anda bir hayvanın kaydını sınırlar. Son zamanlarda, kablosuz bir miniskop geliştirildi25,26. Bu, görev performansını genişletecek ve bir gruptaki birden fazla hayvandan eşzamanlı in vivo görüntülemeye izin verecektir. Dahası, çift renkli bir miniskop ile birleştirilmiş spektral olarak ayrılabilir dalga boylarına sahip daha hassas GECI'ler geliştirmek, sinirbilim araştırmaları için daha heyecan verici olanaklar sunacaktır.

Hücre içi Ca2+ sinyalizasyonu, hücre büyümesi, proliferasyon, farklılaşma, migrasyon, gen transkripsiyonu, sekresyon ve apoptozun önemli bir düzenleyicisidir1. Nöronlarda, Ca 2+ sinyallemesi tam olarak kontrol edilir, çünkü uzay-zamansal paterni, membran uyarılabilirliği, nörotransmitter salınımı ve sinaptik plastisite2 gibi önemli işlevlerle ilgilidir.
İn vivo kalsiyum görüntüleme, normal hayvan davranışlarına temel nöral devre temsilini çözmek, beyin bozukluklarının hayvan modellerinde anormal nöronal aktiviteleri tanımlamak ve bu değiştirilmiş devreleri normalleştirebilecek potansiyel terapötik hedefleri çözmek için kullanılabilecek güçlü bir tekniktir. İki yaygın in vivo kalsiyum görüntüleme sistemi iki fotonlu lazer taramalı floresan mikroskopi 3,4,5,6 ve başa monte minyatür mikroskopi (miniskop)7,8,9,10,11,12,13 . Geleneksel iki foton mikroskobu, daha iyi çözünürlük, daha düşük gürültü ve daha düşük fotobeyazlatma gibi komuta avantajları sunar; ancak deney hayvanlarının kafalarının sabit olması ve yapılabilecek davranış çalışmalarınısınırlayan 3,4,5,6 olması gerekmektedir. Buna karşılık, başa monte miniskop sistemi küçük ve taşınabilirdir, bu da serbestçe davranan hayvanlarıkullanarak çok çeşitli davranış testlerini incelemeyi mümkün kılar 7,8,9,10,11,12,13.
İki önde gelen Ca2+ göstergesi, kimyasal göstergeler5,14 ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI'ler) 15,16 vardır. Ca2+ görüntüleme, hedeflenen devredeki nöronların spesifik olarak etiketlenmesine izin veren viral vektörlerle birlikte verilen oldukça hassas GECI'ler kullanılarak kolaylaştırılmıştır. Hassasiyeti, uzun ömürlülüğü ve hücre altı bölmeleri bile etiketleme yeteneğini arttırmaya yönelik sürekli çaba, GECI'leri çeşitli in vivo kalsiyum görüntüleme çalışmaları için ideal kılmaktadır17,18,19.
Görüntüleme sırasında ışığın beyin dokusuna saçılması, iki fotonlu mikroskopi ile bile optik penetrasyonu derinlemesine sınırlar. Bununla birlikte, Gradient Index (GRIN) lens, GRIN lensi doğrudan biyolojik dokulara gömülebildiği ve derin beyin bölgesinden gelen görüntüleri mikroskop hedefine aktarabildiği için bu sorunun üstesinden gelir. Optik olarak homojen malzemeden yapılmış geleneksel lenslerin aksine ve odaklamak ve görüntü oluşturmak için karmaşık şekilli bir yüzey gerektiren GRIN lens performansı, lens malzemesi içinde düzlem yüzeyi20 ile odaklanmayı sağlayan kademeli bir kırılma indisi değişikliğine dayanır. GRIN lens çapı 0,2 mm'ye kadar üretilebilir. Bu nedenle, minyatür bir GRIN lens, çok fazla hasara neden olmadan derin beyne implante edilebilir.
Bu makalede, derin beyin in vivo kalsiyum görüntülemesi için tam bir cerrahi protokol sunulmuştur. Gösterim amacıyla, özellikle fare beyninin medial prefrontal korteksi (mPFC) ve in vivo kalsiyum görüntüleme kaydını hedefleyen beyin ameliyatlarını, Ulusal Uyuşturucu Bağımlılığı Enstitüsü'ndeki (NIDA / IRP) Dr. Lin'in grubu tarafından geliştirilen özel yapım bir miniskop sistemi aracılığıyla tanımladık7,12. Deneysel prosedür iki büyük beyin ameliyatını içerir. İlk ameliyat, mPFC'de GCaMP6f'yi (bir GECI) eksprese eden bir viral vektörün stereotaksik olarak enjekte edilmesidir. İkinci ameliyat, GRIN lensini aynı beyin bölgesine implante etmektir. Bu beyin ameliyatlarından kurtulduktan sonra, sonraki prosedür, diş çimentosu kullanarak fare kafatasına miniskop tutucusunu (taban) yapıştırmaktır. İn vivo Ca2+ görüntüleme, miniskobu tabanına monte ettikten sonra herhangi bir zamanda gerçekleştirilebilir. Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için cerrahi protokol, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemleriyle uyumludur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.6mm and 1.2mm drill burrs</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-G and 30-G needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>REF 305109 and REF305106</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 angled forceps</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7.5% povidone-iodine solution (Betadine)</td>
			<td>Purdue Products L.P.</td>
			<td>NDC 67618-151-17</td>
			<td>Surface disinfectant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124-1L</td>
			<td>GRIN lens cleaner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539-25G</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic ointment</td>
			<td>HeliDerm Technology</td>
			<td>81073087</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-inflamatory drug (Ibuprofen)</td>
			<td>Johnson &#38; Johnson Consumer Inc</td>
			<td>30043308</td>
			<td>Acts as pain killer after surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoStereota</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>github.com/liang-bo/autostereota</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Behavior Recoding Software (Point Grey FlyCap2)</td>
			<td>Point Grey</td>
			<td>Point Grey Research Blackfly BFLY-PGE-12A2C</td>
			<td>For recording behavior</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brass hex nut</td>
			<td>McMASTER-CARR</td>
			<td>92736A112</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine</td>
			<td>Par Pharmaceuticals</td>
			<td>NDC 4202317905</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commutator</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen and Caxbondioxide tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>BI-OX-CD5C-K</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressed Oxygen tank</td>
			<td>Rocky Mountain Air Solutions</td>
			<td>OX-M-K</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cordless Microdrill</td>
			<td>KF technology</td>
			<td>8000037800</td>
			<td>For craniotomy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyanoacrylate</td>
			<td>Henkel Coorporation</td>
			<td># 1811182</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data acquisition controller</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data transmission cable</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>Component of image acquisition system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>C&#38;B Metabond and Catalyst</td>
			<td>A00253revA306 and A00168revB306</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental cement set</td>
			<td>Duralay</td>
			<td>2249D</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethasone</td>
			<td>VETone</td>
			<td>NDC 1398503702</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>50-99-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diet gel</td>
			<td>Clear H20</td>
			<td>72-06-5022</td>
			<td>Diet Supplement for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GRIN lens</td>
			<td>GRINTECH</td>
			<td>NEM-100-25-10-860-S</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating Pad</td>
			<td>Physitemp Instruments LLC.</td>
			<td>#10023</td>
			<td>To keep the mouse body warm during surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 502017</td>
			<td>Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 501072</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine</td>
			<td>WEST-WARD</td>
			<td>NDC 0143-9575-01</td>
			<td>Local anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7791-18-6</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microliter syringe (Hamilton)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7653-01</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroSyringe Pump Controller</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>#178647</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope base</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope holding arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miniscope protection cap</td>
			<td>Protolabs</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For protecting the miniscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized controller</td>
			<td>Thorlabs</td>
			<td>KMTS50E</td>
			<td>For mounting the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NeuView</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>https://github.com/giovannibarbera/miniscope_v1.0</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Puralube Vet Ointment</td>
			<td>NDC 17033-211-38</td>
			<td>Ophthalmic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-0622</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pinch Clamp</td>
			<td>World Precision Instrument</td>
			<td>14040</td>
			<td>For clamping the tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) tape</td>
			<td>TegaSeal PTFE Tape</td>
			<td>A-A-58092</td>
			<td>For fastening miniScope to the base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7447-40-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Robotic arm</td>
			<td>NIDA/IRP</td>
			<td>Custom-designed</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>RL 7302</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Set screw</td>
			<td>DECORAH LLC.</td>
			<td>3BT-P9005-00-0025</td>
			<td>For screwing the brass hex nut in miniscope base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Silicone Rubber tubing, 0.062&#8221;ID, 1/8&#8221;OD</td>
			<td>McMaster</td>
			<td>2124T3</td>
			<td>For irrigation of aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td>For preparing aCSF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic stage</td>
			<td>KOPF</td>
			<td>Model 962 Dual Ultra Precise Small Animal Stereotaxic</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile cotton swab</td>
			<td>Puritan</td>
			<td>REF 806-WC</td>
			<td>For both surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical tools</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>11251-35</td>
			<td>For surgeries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Suture</td>
			<td>Sofsilk</td>
			<td>REF SS683</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Syringe filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Millex</td>
			<td>SLGVR33RS</td>
			<td>For filtering aCSF during GRIN lens implantation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viral suspension (AAV1-CamKII-GCamp6f)</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100834-AAV1</td>
			<td>For virus injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Titre: 2.8 X 10^13 GC/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>VETone</td>
			<td>V1 510650</td>
			<td>For GRIN lens implantation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging

Minyatür floresan mikroskop (miniskop), serbestçe davranan hayvanlardan in vivo kalsiyum görüntüleme için güçlü bir araçtır. Geleneksel çoklu foton kalsiyum görüntüleme sistemlerine göre çeşitli avantajlar sunar: (1) kompakt; (2) hafif; (3) uygun fiyatlı; ve (4) serbestçe davranan hayvanlardan kayıt yapılmasına izin verir. Bu protokol, özel olarak geliştirilmiş bir miniskop kayıt sistemi kullanarak derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için beyin ameliyatlarını tanımlar. Hazırlık prosedürü, (1) genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörü ile belirli bir nöron alt grubunu etiketlemek için virüsü bir fare beyninin istenen beyin bölgesine stereotaksik olarak enjekte etmek; (2) kalsiyum görüntüsünü derin beyin bölgesinden miniskop sistemine aktarabilen gradyan indeksli (GRIN) lensin implantasyonu; ve (3) miniskop tutucusunu, miniskobun daha sonra takılabileceği fare kafatasının üzerine yapıştırmak. İn vivo kalsiyum görüntülemeyi gerçekleştirmek için, miniskop tutucuya bağlanır ve eşzamanlı davranış kayıtlarıyla birlikte nöronal kalsiyum görüntüleri toplanır. Mevcut cerrahi protokol, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki fotonlu görüntüleme sistemleriyle uyumludur.

Şekil 1, viral enjeksiyon, GRIN lens implantasyonu, miniskop tabanının fare kafatasına yapıştırılması ve bir miniskop aracılığıyla in vivo kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere şematik deneysel prosedürü göstermektedir. Tüm prosedür ~ 2 ay sürer. Şekil 2, miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme protokolünde açıklanan ana bileşenleri göstermektedir. Şekil 3, GRIN lens implantasyonu sırasında AutoStereota yazılımının arayüzlerini göstermektedir. Şekil 4, in vivo kalsiyum görüntüleme sırasında NeuView ve davranış kayıt yazılımının arayüzlerini göstermektedir.
İn vivo kalsiyum görüntülemenin sonucu hem viral enjeksiyon hem de GRIN lens implantasyon ameliyatlarının başarısına bağlıdır. Şekil 5 , in vivo kalsiyum görüntüleme kayıtlarından bir dizi sonucu (yani başarısız, optimal olmayan ve iyi) göstermektedir. Başarısız vakalarda, kalsiyum görüntüsü karanlık veya parlak görünebilir, ancak genellikle hiç veya çok az aktif nöron ortaya çıkarır. Beşten az aktif nöron varsa, tipik olarak in vivo kalsiyum kayıt deneylerini takip etmiyoruz. İyi bir in vivo kalsiyum görüntüleme tipik olarak yüzlerce aktif nöronu ortaya çıkarır. Bir kayıt yüzden az aktif nöron içeriyorsa, bunu yetersiz bir kayıt olarak kabul ederiz.
Hem suboptimal hem de iyi kayıtlarda in vivo kalsiyum görüntüleme deneyleri takip edildi ve ardından veri analizi yapıldı. Film 1 , fare mPFC'sinden temsili bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydını gösterir. Davranış videoları ve kalsiyum görüntüleme verileri genellikle ayrı ayrı işlenir. Fare davranışı videoları manuel olarak puanlanabilir. Kalsiyum görüntüleme dosyaları, CaImAn kalsiyum görüntü işleme araç kutusu24 kullanılarak işlenir. Şekil 6 , temsili bir hücre haritasını ve iyi bir in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından elde edilen birkaç kalsiyum izini göstermektedir.
İn vivo kalsiyum görüntülemeyi tamamladıktan sonra, son adım, viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonunun istenen beyin bölgesinde gerçekleşip gerçekleşmediğini doğrulamaktır. Bu amaçla, fare fosfat tamponlu salin (PBS) ve ardından% 4 paraformaldehit (PFA) ile perfüze edildi. Fare beyni hasat edildi, 12 saat boyunca% 4 PFA'ya sabitlendi ve 4 ° C'de PBS'de saklandı. Fare beyni daha sonra bir vibratom ile 50 μm kalınlığında dilimler halinde bölümlendi. Beyin dilimleri DAPI ile boyandı ve mikroskop altında gözlemlendi (protokolde tanımlanmadı)12. Şekil 7, GRIN lensinin implante edildiği izi gösteren, deneysel bir fareden bregma'ya ~ 1.94 mm ön tarafta bir fare beyin dilimidir. GRIN lens izinin altındaki ve etrafındaki yeşil floresan bölgesi, mPFC bölgesindeki GCaMP6f ekspresyonunu gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig01.jpg"> Şekil 1: Deneysel prosedüre şematik genel bakış . (A) mPFC'de virüsün stereotaksik enjeksiyonu. (B) mPFC'de GRIN lens implantasyonu. (C) Miniskop tabanının fare kafatasına yapıştırılması. (D) Miniskop montajı ve in vivo kalsiyum görüntüleme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig02.jpg"> Şekil 2: İn vivo kalsiyum görüntüleme için gerekli ana bileşenler. (A) 1 mm çapında ve 4,38 mm uzunluğunda GRIN lens. (B) Beyin dokusu aspirasyonu için kullanılan 27 G manuel olarak cilalanmış künt uçlu iğne. (C) Robotik kol iğne tutucuya bağlandı. (D) Açıkta kalan GRIN lensi fare kafatasına miniskop tabanının yapıştırılmasına kadar korumak için bir PCR tüpünden özel yapım bir kapak. (E) Altıgen somunlu miniskop tutucu (taban). (F) İplik kısmı PTFE bant ile sarılmış bir miniskop. (G) Tabanına bir kilitleme vidası ile tutturulmuş bir miniskop. (H) Miniskop tutma kolu. (I) Miniskobun XYZ konumlarında hareketini kolaylaştırmak için kullanılan özel yapım bir 3D motorlu kontrolör. (J) Fare in vivo kalsiyum görüntüleme yapmazken açıkta kalan GRIN lensi korumak için tabana tutturulmuş koruyucu bir kapak. (K) Kabloya bağlı miniskop. (L) İn vivo Ca2+ görüntüleme için Veri Toplama Sistemi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig03.jpg"> Şekil 3: Katman katman beyin dokusu aspirasyonu sırasında AutoStereota yazılımının arayüzleri. (A) Adım 2.17.1 ila 2.17.3'e karşılık gelen arayüz. (B) Adım 2.17.4 ila 2.17.6'ya karşılık gelen arayüz. (C) 2.17.7 ila 2.17.9 arasındaki adımlara karşılık gelen arayüz. (D) 2.17.10 ila 2.17.12 arasındaki adımlara karşılık gelen arayüz. Kırmızı kutular giriş değerlerini vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig04.jpg"> Şekil 4: NeuView yazılımının arayüzleri ve in vivo kalsiyum görüntüleme sırasında davranış kayıt yazılımı. (A) NeuView arayüzü. (B,C) Davranış kayıt yazılımının arayüzleri. Kırmızı kutular, tıklatılması gereken düğmeleri vurgular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig05.jpg"> Şekil 5: Olası sonuçların aralığını göstermek için maksimum projeksiyon floresan hücre haritaları . (A,B) Sonraki veri analizi için kabul edilemez başarısız in vivo kalsiyum görüntüleme. (A) karanlıktır ve 5'ten az aktif nöron içerir. (B) parlaktır ancak aktif nöronları yoktur. (C) Bazı aktif nöronları içeren suboptimal bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası. (D) Birkaç yüz aktif nöron içeren iyi bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig06.jpg"> Şekil 6: Başarılı bir in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen temsili hücre haritası ve kalsiyum geçicileri. Sol panel, açık alan testi sırasında mPFC'deki in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından maksimum projeksiyon floresan hücre haritasıdır. Kayıt 5 dakika sürer. Sağ panel, ilgi çekici 15 bölgeden (renk eşli) kalsiyum geçicilerini gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63049/63049fig07.jpg"> Şekil 7: Deneysel bir farenin ölüm sonrası değerlendirmesi. Deneysel bir farenin mPFC'sinde GCaMP6f ekspresyonu ve GRIN lens implantasyonu için postmortem değerlendirme. Dikdörtgen alan, GRIN lens implantasyonunun yolunu gösterir. GRIN lens implante edilen bölgenin altındaki yeşil alan, GCaMP6f'nin ifade edildiğini ve GRIN lensin tam olarak istenen beyin bölgesine implante edildiğini doğrulamaktadır. Cg, singulat korteks; PrL, prelimbik korteks; IL, infralimbik korteks. Ölçek çubuğu: 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1: NIDA'daki özel yapım miniskop sisteminin diğer miniskop sistemleriyle karşılaştırılması 7,8,9,10,11,13,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/63049_Table%201_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Film 1: Açık alan testi sırasında fare mPFC'sinden in vivo kalsiyum görüntüleme kaydı. Tanıtım amacıyla, bu video sadece 1 dakikalık kayıt gösterir. Orijinal kayıt kare hızı 10 kare/sn'dir. Video, orijinal kayıttan 6 kat daha hızlıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63049/movie.mp4" target="_blank">Bu Filmi indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging at JoVE.com

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, serbestçe davranan farelerde nöronal dinamikleri ve mikro devreleri incelemek için güçlü bir tekniktir. Bu protokol, bir miniskop kullanarak iyi in vivo kalsiyum görüntüleme elde etmek için beyin ameliyatları yapmayı açıklar.

Derin Beyin In Vivo Kalsiyum Görüntüleme için Stereotaksik Viral Enjeksiyon ve Degrade İndeks Lens İmplantasyonu

A miniature fluorescence microscope (miniscope) is a potent tool for in vivo calcium imaging from freely behaving animals. It offers several advantages ...

Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, araştırmacıların serbestçe davranan hayvanların derin beyin yapılarındaki yüzlerce nörondan mekansal ve geçici olarak koordine edilmiş aktiviteyi incelemelerini sağlar. Miniskop in vivo kalsiyum görüntüleme, hücre tipine özgü, büyük ölçekli ve uzunlamasına kayıtlar yapma yeteneği de dahil olmak üzere birçok avantaj sunar. Viral enjeksiyon ve GRIN lens implantasyonu için cerrahi protokolümüz, derin beyin in vivo kalsiyum görüntüleme için herhangi bir ticari veya özel yapım tek foton ve iki foton görüntüleme sistemi ile uyumludur.Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan yüksek lisans öğrencisi olan Rashmi Thapa olacak. Anestezi uygulanan bir farenin tıraş edilmiş cerrahi alanını dezenfekte ettikten sonra, kafatasının lambda ve bregmasını ortaya çıkarmak için orta hat boyunca deriden iki santimetrelik bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. 0,5 milimetrelik dental matkap çapağını anterior posterior 1,94 milimetre ve medial lateral 0,5 milimetre pozisyonuna getirdikten sonra, kafatasını delmeye başlayın.Daha sonra, mikro pompanın kontrol panelini kullanarak virüsü mikrolitre şırıngaya yükleyin ve saniyede 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre hava kabarcığı ve ardından 800 nanolitre virüs çekin. İğneyi yavaşça beyin dokusuna 1.75 milimetrelik dorsal ventralin hedeflenen Z koordinatına doğru hareket ettirin ve ardından hafifçe dorsal ventral 1.65 milimetrenin Z koordinatına kadar hareket ettirin. Kontrol panelinde, virüsü enjekte etmek için Çalıştır düğmesine basmadan önce mikro pompayı dakikada 50 nanolitre akış hızında 500 nanolitre virüs enjekte edecek şekilde ayarlayın.Enjeksiyon bittiğinde, cilt kenarlarını hizalayın ve insizyonu 4-0 dikişle dikkatlice kapatın. Enfeksiyonu önlemek için dikişli bölgeye antibiyotik merhem uygulayın. Degrade indeksi veya GRIN lensi implante etmek için, ince makas kullanarak cildin 1,5 santimetre yüksekliğinde ve 1,5 santimetre tabandaki üçgen bir alanını, gözler arasındaki ön taraftan lambda'nın arkasındaki arka tarafa kadar çıkarın.Kafatası iyice temizlendikten ve kurutulduktan sonra, cildin kenarlarına siyanoakrilat uygulayın ve cildi kafatasına takın. Siyanoakrilat kuruduğunda beş dakika sonra, 1.2 milimetre çapında bir diş matkap çapağını anterior posterior 1.94 milimetre, medial lateral 0.8 milimetre pozisyonuna getirin. Kafatasını delin, ardından 30 gauge iğne ucu kullanarak dura'yı çıkarın.Tüm kemik kalıntılarını 45 derece açılı keskin forseps ile temizleyin. Daha sonra, 10 derecelik bir açıyla eğilmiş bir robotik kola bağlı iğne tutucuya manuel olarak parlatılmış bir 27 gauge künt uç iğnesi takın ve iğne tutucunun diğer ucunu ev vakum sistemine bağlayın. Bregma'nın Z koordinatını sıfıra ayarlamak için Bregma düğmesine tıklamadan önce iğnenin ucunu sadece bregma'ya dokunmak için bulun.Giriş X değerini 0,8, giriş Y değerini 1,94, giriş Z değerini 1,0 olarak ayarlayın ve iğneyi kafatasındaki delinmiş deliğin üstüne taşımak için Bul düğmesine tıklayın. İğnenin ucunu delinmiş deliğe ortalayın ve Z pozisyonu sıfıra indirin. Vakumu açın ve maruz kalan beyin bölgesini, bükülmüş uçlu 30 gauge bir iğneye bağlı yerçekimi kontrollü bir boru sistemi aracılığıyla yapay beyin omurilik sıvısı veya ACSF ile durulamaya başlayın.ACSF, 0,2 mikronluk bir filtreden süzülürken,% 95 oksijen ve% 5 karbondioksit gaz karışımı ile sürekli olarak kabarcıklanır. AutoStereota yazılımını kullanarak, beyin dokusunun aspirasyonu dört turda tamamlanacaktır. İlk aspirasyon turu için, Z değerinin sıfır görüntülediğinden emin olun.Ardından zStep oturumunda, birinci ve ikinci satırları tıklayıp kontrol edin. İlk satırın değerlerini 0,2 ve 1 olarak ayarlayın. İkinci satırın değerlerini 0,15 ve 4 olarak ayarlayın.Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 1,2 olarak ayarlayın. Dims 0.9'u ayarlayın. Diğer tüm değerler varsayılan olacaktır.Aspirasyonu başlatmak için sırayla NotSet, KeepZero ve Start düğmelerine tıklayın. İlk aspirasyon turu, 0,8 milimetre derinliğinde ve 1 milimetre çapında bir sütun cebi oluşturur. Üçüncü aspirasyon turunda, zStep oturumu için ilk satırı tıklayıp kontrol edin ve ilk satırın değerlerini 1,8 ve 1 olarak ayarlayın.Mod oturumunda, iğne boyutunu 27 ölçer ve 2,2 olarak ayarlayın. Diğer değerleri önceki turunkiyle aynı tutarak aspirasyona başlayın. Üçüncü aspirasyon turundan sonra, sütun cebinin derinliği 1,8 milimetredir.Son aspirasyon turu, cebin dibinde biriken kanı temizlemektir. zStep oturumunda ilk satırın değerlerini 1,6 ve 1 olarak ayarlayın ve aspirasyona başlamadan önce Mod oturumunda iğne boyutu 27 ölçer ve 2,2 ve Dims 0,6 olarak ayarlayın. Cep kansız hale geldiğinde, vakumu durdurun, ACSF'nin sulanmasını durdurun ve iğneyi Z koordinatında 2 milimetre ve merkeze 0,5 milimetre önden getirin.Steril 1 milimetre GRIN lensi beyin dokusu cebine yerleştirin. Daha sonra, erimiş agarozu GRIN lens ve beyin dokusu arasındaki boşluğa bir spatula yardımıyla uygulayın. Agaroz bir jel oluşturduktan sonra, bir mikro bıçak kullanarak fazla agarozu çıkarın.Diş çimento tozunu ve katalizör sıvısını önceden soğutulmuş bir karıştırma kuyusunda karıştırın ve GRIN lensini çevreleyerek ve daha sonra maruz kalan tüm kafatasını kaplayarak kafatasına kendi kendine sertleşen yapışkan reçine çimento tabakası uygulayın. Temiz bir plastik kutuda, ilk diş çimentosu tabakasının üzerine karışımın ince bir tabakasını uygulamak için diş çimento tozu ve siyah odun kömürünü sıvı ile karıştırın. Beş dakika sertleşmesine izin verin.Miniscope'u kabloya bağlayın ve özel olarak geliştirilen NuView yazılımını açın. NuView'da Donanım'a tıklayın, LED1'i kontrol edin ve canlı görüntüleri görüntülemek için Akış düğmesine tıklayın. Canlı yayını durdurmak için, Durdur düğmesine tıklayın.Ardından, Miniscope'u özel yapım bir Miniscope tutma koluna yerleştirin. Motorlu kontrolörlerin yardımıyla, Miniscope'u açıkta kalan GRIN lensin hemen üzerine yerleştirin ve lensin yüzeyine paralel hale getirin. Miniskopu GRIN lense doğru yavaşça indirin ve en iyi netleme düzlemi bulunana kadar Z konumunu ayarlayın.Miniscope'un konumunu değiştirmeden Miniscope tabanının etrafına ilk diş çimentosu tabakasını uygulayın. Çimento sertleştikten sonra, Miniscope'un fare kafasında kendi başına durabilmesi için tutma kolunu yavaşça çıkarın. Tüm boşlukları doldurmak için tabanın etrafına ikinci bir diş çimentosu tabakası uygulayın, boşluklardan LED ışık sızıntısı olmadığından emin olun.Diş çimentosunun sertleşmesine izin verin. Fareyi izofluran ile kısa bir süre uyuşturduktan sonra, koruyucu kapağı çıkarmadan önce tabandaki kilitleme vidasını küçük bir tornavida ile gevşetin ve GRIN lensin yüzeyini asetonla ıslatılmış pamuklu çubukla temizleyin. Miniscope'u kabloya bağlayın ve künt forseps yardımıyla hafifçe sıkarak veya gevşeterek Miniscope'un tabana göre konumunu ayarlayarak en iyi odak düzlemini tanımlamaya başlamak için NuView yazılımını başlatın.En iyi odak düzlemi belirlendikten sonra, kablonun bağlantısını kesmeden ve fareyi tekrar ev kafesine yerleştirmeden önce kilitleme vidasını sıkın. Fare davranış alanını bir canlı yayın işlevi aracılığıyla görüntülemek için davranış kamerası yazılımını açın. Üst kameranın odağını manuel olarak ayarlayın.Trigger Strobe (Tetikleyici Flaşörü) öğesini seçin ve enable/disable trigger (Tetikleyiciyi etkinleştir/devre dışı bırak) seçeneğini işaretleyin ve ardından Record (Kaydet) düğmesini tıklayın. Ardından, davranış kayıtlarının kaydedileceği konumu seçmek için Gözat'ı kullanın. İstediğiniz görüntü formatını seçin.Fareyi arenaya yaklaştırın ve Miniscope'u veri toplama sistemine bağlı kabloya bağlayın. Ardından fareyi arenanın ortasına yerleştirin. Behavior camera yazılımında, Kaydı Başlat'ı tıklatın.NuView'da LED1'i kontrol edin, Yakala'ya tıklayın ve ardından kayda başlamak için düğmeleri tetikleyin. Bu, kalsiyum görüntüleme ve fare davranışının eşzamanlı olarak kaydedilmesini sağlar. 3.000 kare sonra Durdur'a basın ve dosyaları kaydedin.Kayıt tamamlandığında, fareyi izofluran ile kısaca uyuşturun, Miniscope'u tabandan ayırın ve fareyi ana kafesine geri yerleştirmeden önce koruyucu kapağı tabanın üzerine yerleştirin. Suboptimal in vivo kalsiyum görüntülemeden elde edilen hücre haritası bazı aktif nöronlar içerirken, başarılı görüntülemeden odaklanmış alanda yüzlerce aktif nöron içeriyordu. Başarısız bir in vivo kalsiyum görüntülemenin tipik örneğinde, bölgenin karanlık olduğu ve beşten az aktif nöron içerdiği gözlendi veya bölge parlaktı ancak aktif nöronları yoktu.Temsili analizde, maksimum projeksiyon floresan hücre haritası ve ardışık in vivo kalsiyum görüntüleme kaydından kalsiyum geçicileri gösterilmiştir. Deneysel bir farenin medial PFC'sinde GCaMP6f ekspresyonu ve GRIN lens implantasyonu için postmortem değerlendirme, GCaMP6f'nin eksprese edildiğini ve GRIN lensin tam olarak istenen beyin bölgesine implante edildiğini göstermiştir. İyi bir kalsiyum görüntüleme elde etmek için, GRIN lensini implante etmeden önce kanamanın tamamen durduğundan ve alanın kan pıhtılarından arındırıldığından emin olmak gerekir.Bu teknik, farklı insan beyni bozukluklarının fare modelindeki nöral devre değişikliklerini incelemek ve bir ilaç adayının değiştirilmiş devreyi normalleştirip normalleştiremeyeceğini test etmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Stereotaxic Viral Injection and Gradient-Index Lens Implantation for Deep Brain In Vivo Calcium Imaging

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Expansion of Embryonic and Adult Neural Stem Cells by In Utero Electroporation or Viral Stereotaxic Injection

Tarafından Embriyonik ve Erişkin Nöral Kök Hücre Genişletme<em&gt; In Utero</em&gt; Elektroporasyon veya Viral Stereotaksik Enjeksiyon

Somatic stem cells can divide to generate additional stem cells (expansion) or more differentiated cell types (differentiation), which is fundamental for ...

Stereotaxic Injection of a Viral Vector for Conditional Gene Manipulation in the Mouse Spinal Cord

Fare Omurilik Koşullu Gen Manipülasyon için bir Viral Vector Stereotaksik Enjeksiyon

Intraparenchymal injection of a viral vector enables conditional gene manipulation in distinct populations of neurons or particular regions of the central ...

Deep Brain Stimulation with Simultaneous fMRI in Rodents

Kemirgenler Eşzamanlı fMRI ile derin beyin stimülasyonu

In order to visualize the global and downstream neuronal responses to deep brain stimulation (DBS) at various targets, we have developed a protocol for ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Non-invasive Parenchymal, Vascular and Metabolic High-frequency Ultrasound and Photoacoustic Rat Deep Brain Imaging

Non-invaziv parankim, Vasküler ve Metabolik Yüksek frekanslı ultrason ve foto akustik Sıçan Derin Beyin Görüntüleme

Photoacoustics and high frequency ultrasound stands out as powerful tools for neurobiological applications enabling high-resolution imaging on the central ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Calcium Imaging for Visualizing Brain Responses to Endocrine Signaling in Drosophila

Ex Vivo Endokrin Drosophila içinde sinyal beyin yanıt-e doğru görüntülenmesi için kalsiyum görüntüleme

Organ-to-organ communication by endocrine signaling, for example, from the periphery to the brain, is essential for maintaining homeostasis. As a model ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Brain Pericyte Calcium and Hemodynamic Imaging in Transgenic Mice In Vivo

Vivo Transgenik Farelerde Beyin Perisit Kalsiyumu ve Hemodinamik Görüntüleme

Recent advances in protein biology and mouse genetics have made it possible to measure intracellular calcium fluctuations of brain cells in vivo and to ...