Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (31571738) og Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).

1. Materialer
<ol><li>Få tobakssorter. BEMÆRK: Til dette eksperiment blev "Beinhart1000-1" (et udvalg af Beinhart 1000) (BH) og "Xiaohuangjin1025" (XHJ) opnået fra National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH er resistent, mens XHJ er modtagelig for P. nicotianae-infektion16. Et feltisolat af P. nicotianae race 0, som blev bevaret i Tobacco Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences, blev brugt til al...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

Flere resistenskilder er blevet brugt til at forbedre P. nicotianae-resistens i dyrket tobak. Enkelt dominerende R-gener, Php og Phl, er blevet introgresseret fra henholdsvis Nicotiana plumbaginifolia og Nicotiana longiflora10. Cigartobakssorten Beinhart 1000 har det højeste rapporterede niveau af kvantitativ resistens over for P. nicotianae13. Flere intervalkortlægningseksperimenter har antydet, at mindst seks kvantit...

P. nicotianae er ødelæggende for mange solanaceous afgrøder. Det kan forårsage tobak "sort skaft"1, kartoffelblad og knoldrot2, tomat og sød peber krone og rodrot3 og Goji krave og rodrot4. P. nicotianae kan angribe alle dele af tobaksplanter, herunder rødder, stilke og blade på ethvert vækststadium5. Det mest almindelige symptom på sygdommen er den sorte base af stilken. Rødderne er oprindeligt synlige som vandgennemblødte og bliver derefter nekrotiske, og bladene viser store cirkulære læsioner5. Denne sygdom kan være ødelæggende for en tobaksplante i drivhuset såvel som i marken6. Den mest praktiske og økonomiske metode til bekæmpelse af P. nicotianae er brugen af resistente sorter7. Der kræves imidlertid en effektiv screeningsprotokol til identifikation af P. nicotianae-resistente tiltrædelser fra tobakskimplasmasamlinger.
Forskellige identifikationsmetoder er blevet beskrevet for at vurdere P. nicotianae-resistens i tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Generelt er der anvendt tre hovedtilgange til identifikation af P. nicotianae-resistente tobaksgenotyper. Den første omfatter blanding af mycelier med agarmedium på Petri-plader indeholdende P. nicotianae. Mycelien dyrkes derefter i mørke ved stuetemperatur i 2 uger. 1 liter deioniseret vand tilsættes mycelien og homogeniseres i 30 s. Inokulumet holdes på is, indtil det er nødvendigt. To huller (1 cm i diameter og 4-5 cm dybe) er lavet på hver side af planten, og 10 ml af inokulumet hældes i hvert hul. Hullerne fyldes derefter med den omgivende jord, og sygdomsudviklingen overvåges dagligt i 2 uger8,10.
I den anden metode podes planterne med patogeninficerede tandstikkere. Til denne tilgang skal planterne anvendes ca. 6 uger efter transplantation og skal have en minimumshøjde på 30 cm. Autoklaverede tandstikkere placeres på overfladen af kulturer, der indeholder P. nicotianae mycelia. Kulturretterne opbevares derefter under lyset ved stuetemperatur i 7 dage. Derefter bruges koloniserede tandstikkere til at inokulere planterne. Tandstikkere indsættes i tobaksstængerne mellem fjerde og femte knude. Planterne overvåges dagligt i 5 dage9,15. Denne metode er ikke anvendelig til små frøplanter. Da inokulumet er patogeninficerede tandstikkere, kan podningsintensiteten ikke kontrolleres præcist.
Den mest anvendte tilgang involverer havrekorn til podning. I dette tilfælde fremstilles havrekorn ved autoklavering af 500 ml havre og 300 ml deioniseret vand ved 121 ° C i 1 time en gang om dagen i 3 dage. Derefter tilsættes havrekorn til det patogenkoloniserede kulturmedium. Skålene forsegles med paraffinfilm og inkuberes ved 25 ° C i lys i 7-12 dage. Fire separate 5 cm dybe huller er lavetpå pottejorden, 4 cm fra hver plante, og et patogeninficeret havrekorn placeres i hvert hul. Inkubationstiden bestemmes ud fra, hvornår det første overjordiske symptom opstår7,11,12,13,14,15,16. Denne metode er effektiv og anvendelig til modstandsscreening i stor skala. En begrænsning ved denne tilgang er imidlertid, at inokulumet er patogeninficerede havrekorn, hvorfor podningsintensiteten ikke kan kontrolleres præcist.
Men præsenteret her er en mere præcis metode, der gælder for vækstkammerresistensevaluering. Sammenlignet med de andre tilgange er inokulumet zoosporesuspension, hvorfor podningsintensiteten er kontrollerbar og justerbar. Da tobaksplanterne i denne undersøgelse dyrkes uden jord, er resultaterne lettere at observere. Desuden forårsager prøveudtagning af planterødder fra jord altid skade på rødderne, hvilket inducerer en række fysiologiske reaktioner17. I denne metode, da planter dyrkes uden jord, kan interferensen i rodskader elimineres. Afslutningsvis er denne metode mere praktisk til molekylær mekanismeforskning og præcisionsavl. Ved hjælp af denne protokol opnås data typisk inden for 5 dage, hvor mere end 200 planter evalueres i et enkelt eksperiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

Sort skaft, forårsaget af oomycetes Phytophthora nicotianae, er ødelæggende for tobak, og dette patogen er højpatogent for mange solanaceous afgrøder. P. nicotianae er velegnet til høje temperaturer; derfor får forskning i dette patogen betydning i landbruget over hele verden på grund af den globale opvarmning. P. nicotianae-resistente sorter af tobaksplanter screenes almindeligvis ved podning med havrekorn koloniseret af P. nicotianae og overvågning af sygdomssymptomerne. Det er imidlertid vanskeligt at kvantificere podningsintensiteten, da nøjagtig podning er afgørende i dette tilfælde. Denne undersøgelse havde til formål at udvikle en effektiv og pålidelig metode til evaluering af tobaks resistens over for infektion med P. nicotianae. Denne metode er med succes blevet brugt til at identificere resistente sorter, og podningseffektiviteten blev bekræftet af PCR i realtid. Resistensevalueringsmetoden, der præsenteres i denne undersøgelse, er effektiv og praktisk til præcisionsforædling samt molekylær mekanismeforskning.

4 uger gamle planter af den resistente sort BH og modtagelige sort XHJ blev udfordret med P. nicotianae ved hjælp af metoden i denne artikel. Eksperimentet blev designet med tre replikater, hver med 8 planter pr. Gruppe. P. nicotianae-infektion af de to tobakssorter, BH og XHJ, er vist i figur 2. 3 dage efter podning dækkede stammelæsioner for XHJ ca. halvdelen af stammeomkredsen, og halvdelen af bladene var let visne; i den resistente sort BH blev der ikke observeret s...

Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Her præsenteres en protokol til effektiv og nøjagtig screening af tobaksgenotyper for Phytophthora nicotianae-resistens hos frøplanter. Dette er en praktisk tilgang til præcisionsavl samt molekylær mekanismeforskning.

Screening af tobaksgenotyper for phytophthora nicotianaeresistens

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

Her præsenteres en protokol til effektiv og nøjagtig screening af tobaksgenotyper for Phytophthora nicotianae-resistens hos frøplanter. Det er praktisk til præcisionsavl samt molekylær mekanismeforskning. Materialer. Få tobakssorter Beinhart1000-1, et udvalg af Beinhart1000 BH og Xiaohuangjin1025 XHJ fra National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.BH er resistent, mens XHJ er modtagelig for Phytophthora nicotianae infektion. Plantning af tobaksgenotyper til Phytophthora nicotianae resistensevaluering. Bland tobaksfrø med vermikulit og send frøene forsigtigt på den steriliserede pottejord.Placer potterne i vækstkammeret. Oprethold en konstant temperatur på 25 grader Celsius under en 16-timers lys / otte timers mørk fotoperiode. Forbered hydroponiske enheder med bakker og skumplader.Efter at frøene spirer, skal du stikke frøplanter ud fra pottejorden. Vask rødderne forsigtigt med sterilt deioniseret vand og transplanter dem i de hydroponiske enheder. Placer enhederne i klimakamre ved 25 grader Celsius under en seks timers lys / otte timers mørk fotoperiode i 24 timer.Forbered Hoagland næringsopløsning på forhånd. Transplanter frøplanterne til hydroponiske enheder med Hoagland næringsopløsning. Placer enhederne i klimakammeret ved 25 grader Celsius under 16-timers lys / otte timers mørk fotoperiode i to uger.Fremstilling af Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Tilberedning af havregryn agar medium. Vej 33 gram havregryn i en hollowware og tilsæt 1.000 ml sterilt vand.Kog på en elektromagnetisk ovn. Når havregryn bliver klæbrig, spændes væsken gennem et stykke sterilt gasbind. Hæld væsken i en 1.000 ml gradueret cylinder og juster lydstyrken til 1.000 ml med sterilt vand.Hæld væsken i en glasreagensflaske og tilsæt 18 gram agar. Ryst godt og autoklave blandingen havregryn agar medium ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Lad det stå ved stuetemperatur i 30 minutter.Hæld omkring 20 ml steriliseret havregryn agar medium til hver petriskål. Lad petriskålene ved stuetemperatur afkøle grundigt inden myceldyrkning. Mycelial dyrkning.Forbered stans og tandstikkere med en diameter på en centimeter på forhånd ved at autoklavere dem i en autoklave ved 121 grader Celsius i 15 minutter. Stans huller i Phytophthora nicotianae mycelial agar kulturer for at lave runde myceliale måtter. Vælg mycelmåtter, læg mycelsiden ned på havregrynsagarmedium og inkuber myceliet ved 25 grader Celsius i mørke i 14 dage.Fremstilling af Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Tilsæt 0,1% kaliumnitratopløsning til hver myceldyrkning 15 ml pr. Skål, efterfulgt af dyrkning ved fire grader Celsius i 20 minutter for at fremkalde sporangium. Hold opvasken ved 25 grader Celsius i 25 minutter for at frigive zoosporer.Saml zoosporesuspensionen til et bægerglas, og mål zoosporekoncentrationen med mikroskop og hæmocytometer. Juster zoosporekoncentrationen til en gang 10 til den fjerde zoospore pr. Milliliter med sterilt vand. Identifikation af sygdomsresistente tobakssorter.Tag frøplanter fra Hoagland næringsopløsning og inokuler dem ved at nedsænke rødderne i 20 ml Phytophthora nicotianae zoospore suspension i en petriskål 90 millimeter ved 25 grader Celsius i tre timer i mørket. Efter podning sættes tobaksplanter til nye petriskåle med 10 ml sterilt vand og nedsænker rødderne. Hold rødderne fugtige ved at dække med to stykker filterpapir.Opbevar opvasken i 25 grader Celsius 16-timers lys / otte timers mørk fotoperiode. Efter to til tre dage skal du observere sygdommens sværhedsgrad. Til kontrolbehandlingen sættes tobaksplanterne direkte i petriskålene med 10 ml sterilt vand, nedsænkes rødderne og dækkes rødderne med to stykker filterpapir.Evaluering af Phytophthora nicotianae infektion. Evaluer sygdommens sværhedsgrad fire til fem dage efter podning. Baseret på den kinesiske nationale standard skal du score individuel plantesygdoms sværhedsgrad på en skala fra nul til ni.Grad 0 betyder ingen symptomer på hele planten. Grad 1 betyder stammelæsioner mindre end 1/3 af stammens omkreds eller 1/3 af blade, der visner. Grad 3 betyder stammelæsioner mellem 1/3 og 1/2 af stammeomkredsen eller mellem 1/3 og 1/2 af bladene, der visner let.Grad 5 betyder stammelæsioner større end 1/2 af stammens omkreds, men ikke helt omkring omkredsen eller mellem 1/2 og 2/3 af blade, der visner. Grad 7 betyder stammelæsioner omkring hele stammen omkreds eller større end 2/3 af blade, der visner. Grad 9 betyder, at planter ser døde ud.Beregn sygdomsindekset ved hjælp af følgende formel. Sygdommens sværhedsgrad blev opdelt i seks karakterer. Repræsentative resultater.Fire uger gamle planter af den resistente sort BH og modtagelige sort XHJ blev udfordret med Phytophthora nicotianae ved hjælp af metoden i denne artikel. Tre dage efter podningen dækkede stammelæsionerne i XHJ ca. 1/2 af stængelomkredsen, og 1/2 af bladene var let visne. I den resistente sort BH blev der ikke observeret symptomer.Fire dage efter podningen forekom bladvisning og alvorlige stængellæsioner i XHJ, mens disse symptomer ikke forekom i BH.At fem dage efter podning blev individuelle plantesygdommes sværhedsgrad registreret og beregnet ud fra den kinesiske nationale standard for tobakssygdommes og skadedyrs kvalitet og undersøgelsesmetode. Det gennemsnitlige sygdomsindeks for BH var 6,48, hvilket viser resistens R i henhold til standarden, og det gennemsnitlige sygdomsindeks for XHJ var 76,85, hvilket viser modtagelighed S i henhold til standarden. For at bekræfte podningseffektiviteten blev relativ patogenbiomasse kvantificeret ved PCR i realtid.Resultatet af PCR i realtid bekræfter de fænotypiske observationer. Fem afkom fra BC4 F2-populationen af en krydsning mellem BH og XHJ, to mellemliggende resistenssorter, K326 og Yunyan87, blev evalueret ved zoosporesuspensionspodningsmetode og havrekornspodningsmetode. Zoospore suspension metode blev udført på små frøplanter og havrekorn podning metode blev udført på voksne planter.For de fem afkom fra BC4 F2-populationen varierede sygdomsindekset fra 16,49 til 77,60 ved zoosporesuspensionsmetode og varierede fra 10,33 til 83,08 ved havrekornmetode. Resistensklassifikationerne mellem to infektionsmetoder er for det meste i overensstemmelse med hinanden. Med de to mellemresistenssorter K326 og Yunyan87 viste evalueringen resistent i begge metoder.Disse data illustrerer sammenhængen mellem to podningsmetoder, på trods af at de blev udført på tobak i forskellige vækstperioder. Protokollen beskrevet her er en effektiv og pålidelig metode til at evaluere tobaks resistens over for infektion med P.nicotianae frøplante stadium. Denne protokol er praktisk til avl såvel som til molekylær mekanismeforskning, da havrekornsmetoden er anvendelig til storstilet resistensscreening af voksne planter.Disse to metoder kan bruge komplementære. Tak fordi du så med.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerende screeningsassay til identifikation af modulatorer af GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Vurdere Murine Resistance Artery Funktion Brug Pressure Myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening for kemiske modulatorer af post-transkriptionelt regulerede gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Rumlig Reorganisering af et MAPK signalvej Brug af tobak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Sammenligning af Tobak Host Cell Protein Removal Metoder ved Blanchering Intakte Planter eller ved varmebehandling af ekstrakter

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...