Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31571738) en het Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).

1. Materialen
<ol><li>Verkrijg tabaksvariëteiten. OPMERKING: Voor dit experiment werden "Beinhart1000-1" (een selectie van Beinhart 1000) (BH) en "Xiaohuangjin1025" (XHJ) verkregen van de National Medium-term Genbank van de Tobacco Germplasm Resource of China. BH is resistent, terwijl XHJ gevoelig is voor P. nicotianae-infectie16. Een veldisolaat van P. nicotianae ras 0, dat werd bewaard in het Tobacco Research Institute van de Chinese Academie voor Landbou...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

Meerdere resistentiebronnen zijn gebruikt om de P. nicotianae-resistentie in gekweekte tabak te verbeteren. Enkele dominante R-genen, Php en Phl, zijn introgressed van respectievelijk Nicotiana plumbaginifolia en Nicotiana longiflora10. De sigarentabakvariëteit Beinhart 1000 heeft het hoogste gerapporteerde niveau van kwantitatieve resistentie tegen P. nicotianae13. Meerdere interval mapping experimenten hebben gesugger...

P. nicotianae is destructief voor veel solanaceous gewassen. Het kan tabak "zwarte schacht"1, aardappelblad en knolrot2, tomaat en paprika kroon en wortelrot3, en Goji kraag en wortelrot4 veroorzaken. P. nicotianae kan alle delen van tabaksplanten aanvallen, inclusief de wortels, stengels en bladeren in elk groeistadium5. Het meest voorkomende symptoom van de ziekte is de zwarte basis van de stengel. De wortels zijn aanvankelijk zichtbaar als met water doordrenkt en worden vervolgens necrotisch en de bladeren vertonen grote cirkelvormige laesies5. Deze ziekte kan verwoestend zijn voor een tabaksplant in de kas, maar ook in het veld6. De meest praktische en economische methode voor het beheersen van P. nicotianae is het gebruik van resistente variëteiten7. Er is echter een effectief screeningsprotocol vereist voor de identificatie van P. nicotianae-resistente toetredingen uit tabakskiemplasmacollecties.
Er zijn verschillende identificatiemethoden beschreven om de resistentie van P. nicotianae in tabak te beoordelen7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Over het algemeen zijn drie belangrijke benaderingen gebruikt voor de identificatie van P. nicotianae-resistente tabaksgenotypes. De eerste omvat het mengen van mycelia met agar medium op petriplaten met P. nicotianae. De mycelia worden vervolgens gedurende 2 weken in het donker bij kamertemperatuur gekweekt. 1 L gedeïoniseerd water wordt toegevoegd aan de mycelia en gehomogeniseerd gedurende 30 s. Het entmateriaal wordt op ijs gehouden tot het nodig is. Twee gaten (1 cm in diameter en 4-5 cm diep) worden aan elke kant van de plant gemaakt en 10 ml van het entmateriaal wordt in elk gat gegoten. De gaten worden vervolgens opgevuld met de omringende grond en de ontwikkeling van ziekten wordt dagelijks gedurende 2 weken gemonitord8,10.
Bij de tweede methode worden de planten ingeënt met met ziekteverwekkers besmette tandenstokers. Voor deze aanpak moeten de planten ongeveer 6 weken na het verplanten worden gebruikt en een minimale hoogte van 30 cm hebben. Geautoclaveerde tandenstokers worden geplaatst op het oppervlak van culturen die P. nicotianae mycelia bevatten. De kweekschotels worden vervolgens 7 dagen onder het licht bij kamertemperatuur bewaard. Vervolgens worden gekoloniseerde tandenstokers gebruikt om de planten te enten. Tandenstokers worden in de tabaksstengels tussen de vierde en vijfde knop ingebracht. De planten worden dagelijks gedurende 5 dagen gemonitord9,15. Deze methode is niet van toepassing op kleine zaailingen. Omdat het entmateriaal met ziekteverwekkers besmet is, kan de intensiteit van de inenting niet nauwkeurig worden gecontroleerd.
De meest gebruikte aanpak omvat haverkorrels voor inenting. In dit geval worden haverkorrels bereid door 500 ml haver en 300 ml gedeïoniseerd water bij 121 ° C gedurende 1 uur eenmaal daags gedurende 3 dagen te autoclaveren. Vervolgens worden haverkorrels toegevoegd aan het pathogeen-gekoloniseerde kweekmedium. De gerechten worden afgesloten met paraffinefilm en geïncubeerd bij 25 °C in licht gedurende 7-12 dagen. Vier afzonderlijke 5 cm diepe gaten worden gemaaktop de potgrond, 4 cm van elke plant, en één met ziekteverwekkers aangetaste haverkorrel wordt in elk gat geplaatst. De incubatietijd wordt bepaald op basis van wanneer het eerste bovengrondse symptoom optreedt7,11,12,13,14,15,16. Deze methode is efficiënt en toepasbaar voor grootschalige weerstandsscreening. Een beperking van deze benadering is echter dat het entmateriaal pathogene aangetaste haverkorrels zijn, waardoor de inentingsintensiteit niet precies kan worden gecontroleerd.
Hier wordt echter een nauwkeurigere methode gepresenteerd die van toepassing is op de evaluatie van de groeikamerweerstand. In vergelijking met de andere benaderingen is het entmateriaal zoospore-suspensie, vandaar dat de inentingsintensiteit controleerbaar en instelbaar is. Omdat de tabaksplanten in deze studie zonder grond worden gekweekt, zijn de resultaten gemakkelijker waar te nemen. Bovendien veroorzaakt het bemonsteren van plantenwortels uit de grond altijd schade aan de wortels, wat een reeks fysiologische reacties veroorzaakt17. Bij deze methode, omdat planten zonder grond worden gekweekt, kan de interferentie in wortelschade worden geëlimineerd. Kortom, deze methode is praktischer voor moleculair mechanismeonderzoek en precisieveredeling. Met behulp van dit protocol worden gegevens meestal binnen 5 dagen verkregen, met meer dan 200 planten geëvalueerd in een enkel experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

Zwarte schacht, veroorzaakt door de oomyceten Phytophthora nicotianae, is destructief voor tabak en deze ziekteverwekker is hoogpathogeen voor veel solanaceous gewassen. P. nicotianae is goed aangepast aan hoge temperaturen; daarom wint onderzoek naar deze ziekteverwekker wereldwijd aan belang in de landbouw vanwege de opwarming van de aarde. P. nicotianae-resistente variëteiten van tabaksplanten worden vaak gescreend door inenting met haverkorrels gekoloniseerd door P. nicotianae en controle op de ziektesymptomen. Het is echter moeilijk om de inentingsintensiteit te kwantificeren, omdat nauwkeurige inenting in dit geval cruciaal is. Deze studie had tot doel een efficiënte en betrouwbare methode te ontwikkelen voor het evalueren van de resistentie van tabak tegen infectie met P. nicotianae. Deze methode is met succes gebruikt om resistente variëteiten te identificeren en de inentingsefficiëntie werd bevestigd door real-time PCR. De resistentie-evaluatiemethode die in deze studie wordt gepresenteerd, is efficiënt en praktisch voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.

4 weken oude planten van het resistente ras BH en het vatbare ras XHJ werden uitgedaagd met P. nicotianae volgens de methode die in dit artikel wordt gepresenteerd. Het experiment was ontworpen met drie replicaties, elk met 8 planten per groep. P. nicotianae-infectie van de twee tabakssoorten, BH en XHJ, is weergegeven in figuur 2. 3 dagen na de inenting, voor XHJ, bedekten stengellaesies ongeveer de helft van de stengelomtrek en de helft van de bladeren was licht verwelkt...

Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de efficiënte en nauwkeurige screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae-resistentie bij zaailingen. Dit is een praktische benadering voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen.

Screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae resistentie

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de efficiënte en nauwkeurige screening van tabaksgenotypes op Phytophthora nicotianae-resistentie bij zaailingen. Het is praktisch voor precisieveredeling, evenals onderzoek naar moleculaire mechanismen. Materiaal. Verkrijg tabaksvariëteiten Beinhart1000-1, een selectie van Beinhart1000 BH, en Xiaohuangjin1025 XHJ van de National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.BH is resistent, terwijl XHJ gevoelig is voor Phytophthora nicotianae-infectie. Het planten van tabak genotypen voor Phytophthora nicotianae resistentie evaluatie. Meng tabakszaden met vermiculiet en stralen de zaden voorzichtig uit op de gesteriliseerde potgrond.Plaats de potten in de groeikamer. Handhaaf een constante temperatuur van 25 graden Celsius onder een donkere fotoperiode van 16 uur licht / acht uur. Bereid hydroponische apparaten voor met trays en schuimplaten.Nadat zaden zijn ontkiemd, prik je zaailingen uit de potgrond. Was de wortels voorzichtig met steriel gedeïoniseerd water en transplanteer ze in de hydroponische apparaten. Plaats de apparaten in klimaatkamers bij 25 graden Celsius onder een zes uur durende lichte / acht uur donkere fotoperiode gedurende 24 uur.Bereid Hoagland voedingsoplossing van tevoren. Transplanteer de zaailingen naar hydroponische apparaten met Hoagland voedingsoplossing. Plaats de apparaten in de klimaatkamer bij 25 graden Celsius onder een licht- / acht uur donkere fotoperiode van 16 uur gedurende twee weken.Bereiding van Phytophthora nicotianae zoospore suspensie. Bereiding van havermout agar medium. Weeg 33 gram havermout in een holte en voeg 1.000 milliliter steriel water toe.Kook op een elektromagnetische oven. Nadat de havermout kleverig is geworden, zeef je de vloeistof door een stuk steriel gaas. Giet de vloeistof in een maatcilinder van 1.000 milliliter en stel het volume in op 1.000 milliliter met steriel water.Giet de vloeistof in een glazen reagensfles en voeg 18 gram agar toe. Schud goed en autoclaaf het mengsel havermout agar medium op 121 graden Celsius gedurende 15 minuten. Laat het 30 minuten op kamertemperatuur staan.Giet ongeveer 20 milliliter gesteriliseerd havermout agar medium op elke petrischaal. Laat de petrischaaltjes op kamertemperatuur goed afkoelen voor de myceliale teelt. Myceliale teelt.Bereid van tevoren ponsen en tandenstokers met een diameter van een centimeter voor door ze gedurende 15 minuten in een autoclaaf bij 121 graden Celsius te autoclaveren. Prik gaten in Phytophthora nicotianae myceliale agarculturen om ronde myceliale matten te maken. Kies myceliale matten uit, plaats de myceliale kant naar beneden op havermout agar medium en incubeer het mycelium bij 25 graden Celsius in het donker gedurende 14 dagen.Bereiding van Phytophthora nicotianae zoospore suspensie. Voeg 0,1% kaliumnitraatoplossing toe aan elke myceliale teelt 15 milliliter per gerecht, gevolgd door kweken bij vier graden Celsius gedurende 20 minuten om sporangium te induceren. Houd de gerechten 25 minuten op 25 graden Celsius om zoösporen vrij te maken.Verzamel de zoospore-suspensie naar een bekerglas en meet de zoospore-concentratie met microscoop en hemocytometer. Stel de zoosporeconcentratie in op één keer 10 tot de vierde zoospore per milliliter met steriel water. Identificatie van ziekteresistente tabaksvariëteiten.Neem zaailingen van Hoagland voedingsoplossing en ent ze in door de wortels drie uur lang in het donker onder te dompelen in 20 milliliter Phytophthora nicotianae zoospore suspensie in een petrischaaltje van 90 millimeter bij 25 graden Celsius. Zet na het inenten tabakszaailingen in nieuwe petrischalen met 10 milliliter steriel water, waarbij de wortels worden ondergedompeld. Houd de wortels vochtig door ze af te dekken met twee stukjes filtreerpapier.Bewaar de gerechten in 25 graden Celsius 16 uur licht / acht uur donkere fotoperiode. Na twee tot drie dagen, observeer de ernst van de ziekte. Voor de controlebehandeling plaatst u de tabakszaailingen direct in de petrischalen met 10 milliliter steriel water, dompelt u de wortels onder en bedekt u de wortels met twee stukjes filterpapier.Evaluatie van Phytophthora nicotianae infectie. Evalueer de ernst van de ziekte vier tot vijf dagen na inenting. Op basis van de Chinese nationale standaard, scoor de ernst van individuele plantenziekten op een schaal van nul tot negen.Graad 0 betekent geen symptomen op de hele plant. Graad 1 betekent stengellaesies minder dan 1/3 van de stengelomtrek of 1/3 van de bladeren die verwelken. Graad 3 betekent stengellaesies tussen 1/3 en 1/2 van de stengelomtrek of tussen 1/3 en 1/2 van de bladeren die licht verwelken.Graad 5 betekent stengellaesies groter dan 1/2 van de stengelomtrek, maar niet volledig rond de omtrek of tussen 1/2 en 2/3 van de bladeren die verwelken. Graad 7 betekent stengellaesies rond de hele stengelomtrek of groter dan 2/3 van de bladeren die verwelken. Graad 9 betekent dat planten er dood uitzien.Bereken de ziekte-index met behulp van de volgende formule. De ernst van de ziekte werd verdeeld in zes gradaties. Representatieve resultaten.Vier weken oude planten van het resistente ras BH en het vatbare ras XHJ werden uitgedaagd met Phytophthora nicotianae met behulp van de methode die in dit artikel wordt gepresenteerd. Drie dagen na de inenting, bij XHJ, bedekten stengellaesies ongeveer 1/2 van de stengelomtrek en 1/2 van de bladeren waren licht verwelkt. Bij de resistente variant BH werden geen symptomen waargenomen.Vier dagen na inenting traden bladverwelking en ernstige stengellaesies op bij XHJ, terwijl deze symptomen niet verschenen in BH.At vijf dagen na inenting werd de ernst van de individuele plantenziekte geregistreerd en berekend op basis van de Chinese nationale standaard voor de graad en onderzoeksmethode van tabaksziekten en insectenplagen. De gemiddelde ziekte-index van BH was 6,48, wat resistentie R volgens de standaard laat zien, en de gemiddelde ziekte-index van XHJ was 76,85, wat gevoeligheid S volgens de standaard laat zien. Om de inentingsefficiëntie te bevestigen, werd de relatieve pathogene biomassa gekwantificeerd door realtime PCR.Het resultaat van de realtime PCR bevestigt de fenotypische waarnemingen. Vijf nakomelingen uit de BC4 F2-populatie van een kruising tussen BH en XHJ, twee intermediaire resistentievariëteiten, K326 en Yunyan87, werden geëvalueerd met behulp van de zoospore-suspensie-inentingsmethode en de haverkorrelineninentingsmethode. Zoospore-suspensiemethode werd uitgevoerd op kleine zaailingen en haverkorrels inentingsmethode werd uitgevoerd op volwassen planten.Voor de vijf nakomelingen uit de BC4 F2-populatie varieerde de ziekte-index van 16,49 tot 77,60 per zoospore-suspensiemethode en varieerde van 10,33 tot 83,08 volgens de haverkorrelmethode. De resistentieclassificaties tussen twee infectiemethoden zijn meestal consistent met elkaar. Bij de twee tussenliggende resistentievariëteiten K326 en Yunyan87 bleek de evaluatie resistent in beide methoden.Deze gegevens illustreren de correlatie tussen twee inentingsmethodes, ondanks dat ze werden uitgevoerd op tabak in verschillende groeiperioden. Het hier beschreven protocol is een efficiënte en betrouwbare methode om de weerstand van tabak tegen infectie door het P.nicotianae-zaailingstadium te evalueren. Dit protocol is praktisch voor zowel veredeling als voor moleculair mechanismeonderzoek, omdat de haverkorrelmethode toepasbaar is voor grootschalige resistentiescreening van volwassen planten.Deze twee methoden kunnen complementair gebruiken. Bedankt voor het kijken.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Keuze en No-keuze Assays voor het testen van de weerstand van A. thaliana te kauwen Insecten

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Bioassays voor Monitoring Insecticide Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Karakteriseren Herbivore resistentiemechanismen: Spittlebugs op Brachiaria Spp. als een voorbeeld

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Een TL-screeningstest voor het vaststellen van Modulators van GIRK kanalen

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA secundaire structuur Voorspelling behulp van High-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Beoordelen van Muizen Resistance Artery functie gebruiken Pressure myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

High-throughput screening voor Chemische Modulators van Post-transcriptioneel gereguleerde genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Beeldvorming Ruimtelijke Reorganisatie van een MAPK signaalroute Met behulp van de Tabak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Vergelijking van de Tabak Host Cell Protein methode voor het verwijderen van blancheren intacte planten of door een warmtebehandeling van Extracten

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...