Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata dalla National Natural Science Foundation of China (31571738) e dall'Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).

1. Materiali
<ol><li>Ottenere varietà di tabacco. NOTA: Per questo esperimento "Beinhart1000-1" (una selezione di Beinhart 1000) (BH) e "Xiaohuangjin1025" (XHJ) sono stati ottenuti dalla National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH è resistente, mentre XHJ è suscettibile all'infezione da P. nicotianae16. Un isolato di campo di P. nicotianae razza 0, che è stato conservato nell'Istituto di ricerca sul tabacco dell'Accademia ...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

Molteplici fonti di resistenza sono state utilizzate per migliorare la resistenza di P. nicotianae nel tabacco coltivato. Singoli geni R dominanti, Php e Phl, sono stati introgrediti da Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, rispettivamente10. La varietà di tabacco da sigaro Beinhart 1000 ha il più alto livello riportato di resistenza quantitativa a P. nicotianae13. Molteplici esperimenti di mappatura degli ...

P. nicotianae è distruttivo per molte colture solanacee. Può causare tabacco "gambo nero"1, marciume fogliare e tubero di patate2, corona di pomodoro e peperone dolce e marciume radicale3 e colletto e marciume radicale di Goji4. P. nicotianae può attaccare tutte le parti delle piante di tabacco, comprese le radici, i gambi e le foglie in qualsiasi fase di crescita5. Il sintomo più comune della malattia è la base nera del gambo. Le radici sono inizialmente visibili come imbevute d'acqua e poi diventano necrotiche, e le foglie mostrano grandi lesioni circolari5. Questa malattia può essere devastante per una pianta di tabacco in serra, così come sul campo6. Il metodo più pratico ed economico per controllare P. nicotianae è l'uso di varietà resistenti7. Tuttavia, è necessario un protocollo di screening efficace per l'identificazione delle accessioni resistenti a P. nicotianae dalle collezioni di germoplasma del tabacco.
Sono stati descritti vari metodi di identificazione per valutare la resistenza a P. nicotianae nel tabacco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. In generale, sono stati utilizzati tre approcci principali per l'identificazione dei genotipi del tabacco resistenti a P. nicotianae. Il primo include la miscelazione di miceli con mezzo agar su piastre di Petri contenenti P. nicotianae. I miceli vengono poi coltivati al buio a temperatura ambiente per 2 settimane. 1 L di acqua deionizzata viene aggiunta ai miceli e omogeneizzata per 30 s. L'inoculo viene tenuto sul ghiaccio fino a quando non è necessario. Due fori (1 cm di diametro e 4-5 cm di profondità) sono fatti su ciascun lato della pianta, e 10 ml di inoculo vengono versati in ogni foro. I fori vengono quindi riempiti con il terreno circostante e lo sviluppo della malattia viene monitorato quotidianamente per 2 settimane8,10.
Nel secondo metodo, le piante vengono inoculate con stuzzicadenti infestati da agenti patogeni. Per questo approccio, le piante dovrebbero essere utilizzate circa 6 settimane dopo il trapianto e dovrebbero avere un'altezza minima di 30 cm. Gli stuzzicadenti autoclavati sono posti sulla superficie di colture contenenti miceli di P. nicotianae. I piatti di coltura vengono quindi conservati sotto la luce a temperatura ambiente per 7 giorni. Quindi, gli stuzzicadenti colonizzati vengono utilizzati per inoculare le piante. Gli stuzzicadenti vengono inseriti nei gambi del tabacco tra il quarto e il quinto nodo. Le piante sono monitorate quotidianamente per 5 giorni9,15. Questo metodo non è applicabile per piantine di piccole dimensioni. Poiché l'inoculo è costituito da stuzzicadenti infestati da agenti patogeni, l'intensità dell'inoculazione non può essere controllata con precisione.
L'approccio più frequentemente utilizzato coinvolge i chicchi d'avena per l'inoculazione. In questo caso, i chicchi d'avena vengono preparati in autoclave 500 mL di avena e 300 mL di acqua deionizzata a 121 °C per 1 ora una volta al giorno per 3 giorni. Quindi, i chicchi d'avena vengono aggiunti al terreno di coltura colonizzato dall'agente patogeno. Le piastre sono sigillate con film di paraffina e incubate a 25 °C alla luce per 7-12 giorni. Quattro fori separati profondi 5 cm sono fattisull'terriccio, 4 cm da ogni pianta, e un chicco d'avena infestato da agenti patogeni viene posto in ogni foro. Il periodo di incubazione è determinato in base a quando si verifica il primo sintomo fuori terra7,11,12,13,14,15,16. Questo metodo è efficiente e applicabile per lo screening della resistenza su larga scala. Tuttavia, una limitazione di questo approccio è che l'inoculo è costituito da chicchi d'avena infestati da agenti patogeni, quindi l'intensità dell'inoculazione non può essere controllata con precisione.
Tuttavia, qui è presentato un metodo più accurato applicabile alla valutazione della resistenza della camera di crescita. Rispetto agli altri approcci, l'inoculo è in sospensione di zoospore, quindi l'intensità dell'inoculazione è controllabile e regolabile. Poiché le piante di tabacco in questo studio sono coltivate senza terra, i risultati sono più facili da osservare. Inoltre, il campionamento delle radici delle piante dal terreno provoca sempre danni alle radici, il che induce una serie di risposte fisiologiche17. In questo metodo, poiché le piante vengono coltivate senza suolo, l'interferenza nel danno alle radici può essere eliminata. In conclusione, questo metodo è più pratico per la ricerca sui meccanismi molecolari e l'allevamento di precisione. Utilizzando questo protocollo, i dati vengono in genere ottenuti entro 5 giorni, con più di 200 piante valutate in un singolo esperimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

Il gambo nero, causato dall'oomiceti Phytophthora nicotianae, è distruttivo per il tabacco e questo agente patogeno è altamente patogeno per molte colture solanacee. P. nicotianae è ben adattato alle alte temperature; pertanto, la ricerca su questo agente patogeno sta guadagnando importanza in agricoltura in tutto il mondo a causa del riscaldamento globale. Le varietà di piante di tabacco resistenti a P. nicotianae sono comunemente sottoposte a screening mediante inoculazione con chicchi d'avena colonizzati da P. nicotianae e monitoraggio dei sintomi della malattia. Tuttavia, è difficile quantificare l'intensità dell'inoculazione poiché l'inoculazione accurata è cruciale in questo caso. Questo studio mirava a sviluppare un metodo efficiente e affidabile per valutare la resistenza del tabacco all'infezione da P. nicotianae. Questo metodo è stato utilizzato con successo per identificare varietà resistenti e l'efficienza dell'inoculazione è stata confermata dalla PCR in tempo reale. Il metodo di valutazione della resistenza presentato in questo studio è efficiente e pratico per l'allevamento di precisione, così come la ricerca sui meccanismi molecolari.

Le piante di 4 settimane della varietà resistente BH e della varietà sensibile XHJ sono state sfidate con P. nicotianae utilizzando il metodo presentato in questo articolo. L'esperimento è stato progettato con tre repliche, ciascuna con 8 piante per gruppo. L'infezione da P. nicotianae delle due varietà di tabacco, BH e XHJ, è presentata nella Figura 2. A 3 giorni dopo l'inoculazione, per XHJ, le lesioni dello stelo coprivano circa la metà della circonferenza dello s...

Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Qui viene presentato un protocollo per lo screening efficiente e accurato dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae nelle piantine . Questo è un approccio pratico per l'allevamento di precisione, così come la ricerca sui meccanismi molecolari.

Screening dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

Qui viene presentato un protocollo per lo screening efficiente e accurato dei genotipi del tabacco per la resistenza a Phytophthora nicotianae nelle piantine. È pratico per l'allevamento di precisione, così come per la ricerca sui meccanismi molecolari. Materiali. Ottieni le varietà di tabacco Beinhart1000-1, una selezione di Beinhart1000 BH e Xiaohuangjin1025 XHJ dal National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.BH è resistente, mentre XHJ è suscettibile all'infezione da Phytophthora nicotianae. Piantare genotipi di tabacco per la valutazione della resistenza a Phytophthora nicotianae. Mescolare i semi di tabacco con la vermiculite e trasmettere delicatamente i semi sul terriccio sterilizzato.Posiziona i vasi nella camera di crescita. Mantenere una temperatura costante di 25 gradi Celsius sotto un periodo di luce di 16 ore / otto ore di foto scure. Preparare dispositivi idroponici con vassoi e fogli di schiuma.Dopo che i semi germinano, pungere le piantine dal terriccio. Lavare delicatamente le radici con acqua deionizzata sterile e trapiantarle nei dispositivi idroponici. Posizionare i dispositivi in camere climatiche a 25 gradi Celsius sotto un periodo di foto di luce di sei ore / otto ore di buio per 24 ore.Preparare in anticipo la soluzione nutritiva Hoagland. Trapiantare le piantine in dispositivi idroponici con soluzione nutritiva Hoagland. Posizionare i dispositivi nella camera climatica a 25 gradi Celsius sotto il periodo di luce di 16 ore / otto ore di foto scure per due settimane.Preparazione di Phytophthora nicotianae zoospore sospensione. Preparazione di agar di farina d'avena media. Pesare 33 grammi di farina d'avena in un hollowware e aggiungere 1.000 millilitri di acqua sterile.Far bollire su un forno elettromagnetico. Dopo che la farina d'avena diventa appiccicosa, filtrare il liquido attraverso un pezzo di garza sterile. Versare il liquido in un cilindro graduato da 1.000 millilitri e regolare il volume a 1.000 millilitri con acqua sterile.Versare il liquido in una bottiglia di reagente di vetro e aggiungere 18 grammi di agar. Agitare bene e autoclave la miscela di agar di farina d'avena media a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Lasciare a temperatura ambiente per 30 minuti.Versare circa 20 millilitri di agar medio di farina d'avena sterilizzato in ogni piatto di Petri. Lasciare raffreddare accuratamente le piastre di Petri a temperatura ambiente prima della coltivazione miceliale. Coltivazione miceliale.Preparare in anticipo punzoni e stuzzicadenti di un centimetro di diametro autoclavandoli in autoclave a 121 gradi Celsius per 15 minuti. Forare i fori nelle colture di agar miceliale Phytophthora nicotianae per realizzare stuoie miceliali rotonde. Scegli le stuoie miceliali, posiziona il lato miceliale verso il basso sul mezzo di agar di farina d'avena e incuba il micelio a 25 gradi Celsius al buio per 14 giorni.Preparazione di Phytophthora nicotianae zoospore sospensione. Aggiungere la soluzione di nitrato di potassio allo 0,1% a ciascuna coltivazione miceliale 15 millilitri per piatto, seguita da coltivazione a quattro gradi Celsius per 20 minuti per indurre lo sporangio. Mantenere i piatti a 25 gradi Celsius per 25 minuti per rilasciare zoospore.Raccogliere la sospensione di zoospore in un becher e misurare la concentrazione di zoospore al microscopio e all'emocitometro. Regolare la concentrazione di zoospore a una volta 10 alla quarta zoospora per millilitro con acqua sterile. Identificazione delle varietà di tabacco resistenti alle malattie.Prendi le piantine dalla soluzione nutritiva di Hoagland e inoculale immergendo le radici in 20 millilitri di sospensione zoospora di Phytophthora nicotianae in una capsula di Petri da 90 millimetri a 25 gradi Celsius per tre ore al buio. Dopo l'inoculazione, mettere le piantine di tabacco in nuove piastre di Petri con 10 millilitri di acqua sterile, immergendo le radici. Mantenere le radici umide coprendo con due pezzi di carta da filtro.Mantieni i piatti a 25 gradi Celsius 16 ore di luce / otto ore di buio periodo fotografico. Dopo due o tre giorni, osservare la gravità della malattia. Per il trattamento di controllo, mettere le piantine di tabacco direttamente nelle piastre di Petri con acqua sterile da 10 millilitri, immergendo le radici e coprendo le radici con due pezzi di carta da filtro.Valutazione dell'infezione da Phytophthora nicotianae. Valutare la gravità della malattia da quattro a cinque giorni dopo l'inoculazione. Sulla base dello standard nazionale cinese, valutare la gravità della malattia individuale delle piante su una scala da zero a nove.Grado 0 significa nessun sintomo su tutta la pianta. Grado 1 indica lesioni dello stelo inferiori a 1/3 della circonferenza dello stelo o 1/3 delle foglie che appassiscono. Grado 3 indica lesioni dello stelo tra 1/3 e 1/2 della circonferenza dello stelo o tra 1/3 e 1/2 delle foglie leggermente appassite.Grado 5 indica lesioni dello stelo superiori a 1/2 della circonferenza dello stelo, ma non completamente intorno alla circonferenza o tra 1/2 e 2/3 delle foglie che appassiscono. Grado 7 indica lesioni dello stelo intorno alla circonferenza dell'intero stelo o superiori a 2/3 delle foglie che appassiscono. Il grado 9 significa che le piante sembrano morte.Calcola l'indice di malattia usando la seguente formula. La gravità della malattia era divisa in sei gradi. Risultati rappresentativi.Le piante di quattro settimane della varietà resistente BH e della varietà sensibile XHJ sono state sfidate con Phytophthora nicotianae utilizzando il metodo presentato in questo articolo. A tre giorni dopo l'inoculazione, in XHJ, le lesioni dello stelo coprivano circa 1/2 della circonferenza del gambo e 1/2 delle foglie erano leggermente appassite. Nella varietà resistente BH, non sono stati osservati sintomi.A quattro giorni dall'inoculazione, l'avvizzimento delle foglie e le gravi lesioni dello stelo si sono verificati in XHJ, mentre questi sintomi non sono comparsi in BH.At cinque giorni dopo l'inoculazione, la gravità della malattia individuale delle piante è stata registrata e calcolata in base allo standard nazionale cinese per il grado e il metodo di indagine delle malattie del tabacco e degli insetti nocivi. L'indice medio di malattia di BH era 6,48, che mostra resistenza R secondo lo standard, e l'indice medio di malattia di XHJ era 76,85, che mostra la suscettibilità S secondo lo standard. Per confermare l'efficienza dell'inoculazione, la biomassa patogena relativa è stata quantificata mediante PCR in tempo reale.Il risultato della REAL TIME PCR conferma le osservazioni fenotipiche. Cinque progenie della popolazione BC4 F2 di un incrocio tra BH e XHJ, due varietà a resistenza intermedia, K326 e Yunyan87, sono state valutate con il metodo di inoculazione in sospensione di zoospore e il metodo di inoculazione dei chicchi d'avena. Il metodo di sospensione delle zoospore è stato eseguito su piccole piantine e il metodo di inoculazione dei chicchi d'avena è stato eseguito su piante adulte.Per le cinque progenie della popolazione BC4 F2, l'indice di malattia variava da 16,49 a 77,60 con il metodo di sospensione delle zoospore e variava da 10,33 a 83,08 con il metodo dei chicchi d'avena. Le classificazioni di resistenza tra due metodi di infezione sono per lo più coerenti tra loro. Con le due varietà di resistenza intermedia K326 e Yunyan87, la valutazione ha mostrato resistenza in entrambi i metodi.Questi dati illustrano la correlazione tra due metodi di inoculazione nonostante siano stati eseguiti sul tabacco in diversi periodi di crescita. Il protocollo qui descritto è un metodo efficiente e affidabile per valutare la resistenza del tabacco all'infezione da parte dello stadio di piantina di P.nicotianae. Questo protocollo è pratico per l'allevamento e per la ricerca sui meccanismi molecolari in quanto il metodo del grano d'avena è applicabile per lo screening di resistenza su larga scala di piante adulte.Questi due metodi possono essere utilizzati in modo complementare. Grazie per l'attenzione.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

I dosaggi scelta e No-scelta per il test della resistenza di Arabidopsis thaliana per Insetti da masticare

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Ricerca

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSIONE per lo screening RNAi in cellule di mammifero

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Saggi biologici per la resistenza di monitoraggio Insetticida

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Caratterizzano Erbivoro meccanismi di resistenza: Spittlebugs su Brachiaria Spp. come esempio

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Un test di screening a fluorescenza per l&#39;identificazione di modulatori Canali GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA Secondaria previsione della struttura utilizzando la forma di alta velocità

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Valutare Murino Resistenza Funzione Arteria Utilizzando myography Pressione

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Screening ad alto rendimento per i modulatori chimici di Genes post-trascrizionale regolamentati

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Riorganizzazione spaziale di una via di segnalazione MAPK Utilizzando il sistema transitorio Expression Tabacco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...