Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (31571738)과 중국의 농업 과학 기술 혁신 프로그램 (ASTIP-TRIC01)이 자금을 지원했습니다.

1. 재료
<ol><li>담배 품종을 얻으십시오. 참고 :이 실험을 위해 "Beinhart1000-1"(Beinhart 1000의 선택) (BH) 및 "Xiaohuangjin1025"(XHJ)는 중국의 담배 생식 플라스마 자원의 국립 중기 Genbank로부터 얻어졌습니다. BH는 내성이 있는 반면, XHJ는 P. 니코티아 나 감염에 취약하다16. 중국 농업 과학 아카데미의 담배 연구소에서 보존 된 P. nicotianae race 0의 현장 격리가 연구 ?...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

재배 담배에서 P. nicotianae 저항성을 향상시키기 위해 여러 저항 소스가 사용되었습니다. 단일 지배적 인 R 유전자 인 Php와 Phl은 각각 Nicotiana plumbaginifolia와 Nicotiana longiflora에서 내성을 보였습니다10. 시가 담배 품종 Beinhart 1000은 P. nicotianae13에 대한 양적 저항성의 가장 높은 수준을보고했습니다. 다중 간격 매핑 실험은 적어...

P. nicotianae는 많은 solanaceous 작물에 파괴적입니다. 그것은 담배 "검은 생크"1, 감자 잎과 괴경 썩음2, 토마토와 달콤한 고추 크라운과 뿌리 rot3, Goji 칼라와 뿌리 썩음4을 일으킬 수 있습니다. P. nicotianae는 성장하는 단계에서 뿌리, 줄기 및 잎을 포함하여 담배 식물의 모든 부분을 공격 할 수 있습니다5. 이 질병의 가장 흔한 증상은 줄기의 검은 색 기저부입니다. 뿌리는 처음에는 물에 젖은 다음 괴사가되어 잎이 큰 원형 병변을 보입니다5. 이 질병은 온실과 현장의 담배 공장에 치명적일 수 있습니다6. P. nicotianae 를 통제하는 가장 실용적이고 경제적 인 방법은 내성 품종의 사용입니다7. 그러나, 담배 생식 플라스마 수집물로부터의 P. nicotianae-resistant accessions의 확인을 위해 효과적인 스크리닝 프로토콜이 요구된다.
 담배 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16에서 P. nicotianae 내성을 평가하기 위해 다양한 동정 방법이 기술되었다. 일반적으로, P. nicotianae-resistant 담배 유전자형의 동정을 위해 세 가지 주요 접근법이 사용되었다. 첫 번째는 P. nicotianae를 함유 한 Petri 플레이트에 균사체와 한천 배지를 혼합하는 것을 포함합니다. 균사체는 실온에서 어둠 속에서 2 주 동안 재배됩니다. 1 L의 탈이온수를 균사체에 첨가하고 30 초 동안 균질화시킨다. 접종물은 필요할 때까지 얼음 위에 보관됩니다. 식물의 양쪽에 두 개의 구멍 (직경 1cm, 깊이 4-5cm)이 만들어지고 접종물 10mL를 각 구멍에 붓습니다. 그런 다음 구멍이 주변 토양으로 채워지고 질병 발생은 2 주 동안 매일 모니터링됩니다8,10.
두 번째 방법에서, 식물은 병원균에 감염된 이쑤시개로 접종됩니다. 이 접근법을 위해 식물은 이식 후 약 6 주 후에 사용되어야하며 최소 높이는 30cm이어야합니다. 오토클레이브 된 이쑤시개는 P. nicotianae mycelia를 함유 한 문화의 표면에 배치됩니다. 그런 다음 배양 접시를 실온에서 7 일 동안 빛 아래에 보관합니다. 그런 다음 식민지화 된 이쑤시개를 사용하여 식물을 접종합니다. 이쑤시개는 네 번째와 다섯 번째 노드 사이의 담배 줄기에 삽입됩니다. 식물은 5 일 동안 매일 모니터링됩니다.9,15. 이 방법은 작은 묘목에는 적용되지 않습니다. 접종액은 병원균에 감염된 이쑤시개이기 때문에 접종 강도를 정확하게 제어 할 수 없습니다.
가장 자주 사용되는 접근법은 접종을 위해 귀리 곡물을 포함합니다. 이 경우, 귀리 곡물은 귀리 500 mL와 탈이온수 300 mL를 121 °C에서 3 일 동안 1 일 동안 1 시간 동안 오토 클레이빙하여 제조한다. 이어서, 귀리 곡물은 병원체-콜로니화된 배양 배지에 첨가된다. 접시를 파라핀 필름으로 밀봉하고 7-12일 동안 광에서 25°C에서 인큐베이션한다. 포팅 토양에 4cm, 각 식물에서 4cm의 4cm 깊이의 구멍이 만들어지고 병원균에 감염된 귀리 곡물 하나가 각 구멍에 배치됩니다. 잠복기는 제1 지상 증상이 언제 발생했는지에 기초하여 결정된다7,11,12,13,14,15,16. 이 방법은 효율적이고 대규모 저항 스크리닝에 적용 할 수 있습니다. 그러나이 접근법의 한 가지 한계는 접종물이 병원균에 감염된 귀리 곡물이므로 접종 강도를 정확하게 제어 할 수 없다는 것입니다.
그러나, 여기에 제시된 것은 성장 챔버 저항 평가에 적용 가능한 보다 정확한 방법이다. 다른 접근법과 비교하여, 접종물은 동물원 포자 현탁액이며, 따라서 접종 강도는 조절가능하고 조절가능하다. 이 연구에서 담배 식물은 토양없이 재배되기 때문에 결과를 관찰하기가 더 쉽습니다. 또한, 토양에서 식물 뿌리를 샘플링하면 항상 뿌리에 손상을 입히고 일련의 생리적 반응을 유도합니다17. 이 방법에서는 식물이 토양없이 재배되기 때문에 뿌리 손상에 대한 간섭을 제거 할 수 있습니다. 결론적으로,이 방법은 분자 메커니즘 연구 및 정밀 육종에 더 실용적입니다. 이 프로토콜을 사용하여 데이터는 일반적으로 5 일 이내에 얻어지며 단일 실험에서 200 개 이상의 식물이 평가됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

oomycetes Phytophthora nicotianae에 의해 야기 된 검은 생크는 담배에 파괴적이며,이 병원균은 많은 solanaceous 작물에 매우 병원성이 있습니다. P. nicotianae는 고온에 잘 적응합니다. 따라서이 병원균에 대한 연구는 지구 온난화로 인해 전 세계 농업에서 중요성이 커지고 있습니다. P. nicotianae 내성 품종의 담배 식물은 일반적으로 P. nicotianae에 의해 식민지화 된 귀리 곡물로 접종하고 질병 증상을 모니터링함으로써 선별됩니다. 그러나, 이 경우 정확한 접종이 중요하기 때문에 접종 강도를 정량화하는 것은 어렵다. 이 연구는 P. nicotianae 감염에 대한 담배의 내성을 평가하기위한 효율적이고 신뢰할 수있는 방법을 개발하는 것을 목표로했습니다. 이 방법은 내성 품종을 식별하는 데 성공적으로 사용되었으며, 접종 효율은 실시간 PCR로 확인되었습니다. 이 연구에서 제시된 저항 평가 방법은 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 정밀 육종에 효율적이고 실용적입니다.

내성 품종 BH 및 감수성 품종 XHJ의 4주령 식물은 본 기사에서 제시된 방법을 사용하여 P. nicotianae 로 도전하였다. 실험은 세 번의 반복실험으로 설계되었으며, 각각 그룹당 8개의 식물이 있었다. P. 두 담배 품종, BH 및 XHJ의 니코티아나 감염은 도 2에 제시되어 있다. 접종 후 3 일 후, XHJ의 경우, 줄기 병변은 줄기 둘레의 약 절반을 덮었고 잎의 절반은 약간 시들게되...

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Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

여기에서, 묘목에서 Phytophthora nicotianae 저항성에 대한 담배 유전자형의 효율적이고 정확한 스크리닝을위한 프로토콜이 제시됩니다. 이것은 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 정밀 번식을위한 실용적인 접근 방식입니다.

Phytophthora nicotianae 저항성에 대한 담배 유전자형의 스크리닝

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

여기에서, 묘목에서 Phytophthora nicotianae 저항성에 대한 담배 유전자형의 효율적이고 정확한 스크리닝을위한 프로토콜이 제시됩니다. 그것은 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 정밀 번식에도 실용적입니다. 자료. 담배 품종 Beinhart1000-1, Beinhart1000 BH 및 Xiaohuangjin1025 XHJ를 중국 담배 생식 생물 자원의 국가 중기 제네백에서 얻으십시오.BH는 내성이 있는 반면, XHJ는 피토프토라 니코티아나 감염에 취약하다. Phytophthora nicotianae 저항성 평가를위한 담배 유전자형 심기. 담배 씨앗을 질석과 섞어서 살균 된 화분 토양에 부드럽게 씨앗을 방송하십시오.냄비를 성장 챔버에 넣으십시오. 16 시간의 빛 / 8 시간의 어두운 사진 기간 동안 섭씨 25 도의 일정한 온도를 유지하십시오. 트레이와 폼 시트가있는 수경 재배 장치를 준비하십시오.씨앗이 발아 한 후, 화분 토양에서 묘목을 찌른다. 멸균 탈이온수로 뿌리를 부드럽게 씻고 수경 장치에 이식하십시오. 장치를 섭씨 25도의 기후 챔버에 놓고 6 시간 빛 / 여덟 시간의 어두운 사진 기간 동안 24 시간 동안 보관하십시오.Hoagland 영양 용액을 미리 준비하십시오. Hoagland 영양 용액으로 수경 재배 장치에 묘목을 이식하십시오. 장치를 섭씨 25도의 기후 챔버에 16 시간 빛 / 8 시간의 어두운 사진 기간 동안 2 주 동안 두십시오.Phytophthora nicotianae zoospore suspension의 제조. 오트밀 한천 배지의 제조. 33 그램의 오트밀을 속이 빈 그릇에 넣고 1, 000 밀리리터의 멸균수를 넣으십시오.전자기 오븐에 끓입니다. 오트밀이 끈적 거리면 멸균 거즈 조각을 통해 액체를 변형시킵니다. 액체를 1, 000 밀리리터 점진적 실린더에 붓고 멸균수로 부피를 1, 000 밀리리터로 조정하십시오.액체를 유리 시약 병에 붓고 18 그램의 한천을 넣으십시오. 잘 흔들어 혼합물 오트밀 한천 배지를 섭씨 121도에서 15분 동안 오토클레이브한다. 실온에서 30 분 동안 그대로 두십시오.약 20 밀리리터의 멸균 된 오트밀 한천 배지를 각 페트리 접시에 붓습니다. 균사 재배 전에 페트리 접시를 실온에서 완전히 식히십시오. 균사체 재배.직경 1cm의 펀치와 이쑤시개를 섭씨 121도의 오토클레이브에서 15분 동안 오토클레이빙하여 미리 준비합니다. Phytophthora nicotianae 균사 한천 문화에 구멍을 뚫어 둥근 균사 매트를 만듭니다. 균사 매트를 골라 오트밀 한천 배지에 균사체 측면을 내려 놓고 14 일 동안 어둠 속에서 섭씨 25도에서 균사체를 배양하십시오.Phytophthora nicotianae zoospore suspension의 제조. 각 균사체 재배에 0.1% 질산칼륨 용액을 접시당 15밀리리터씩 첨가한 다음, 섭씨 4도에서 20분간 배양하여 스포란지움을 유도하였다. 동물원 포자를 방출하기 위해 접시를 섭씨 25도에서 25 분 동안 유지하십시오.동물원 포자 현탁액을 비이커에 수집하고 현미경 및 혈구계로 동물원 포자 농도를 측정하십시오. 멸균 된 물로 밀리리터 당 네 번째 동물원 포자에 동물원 포자 농도를 10 배로 조정하십시오. 질병 저항성 담배 품종의 확인.Hoagland 영양 용액에서 묘목을 가져 와서 Phytophthora nicotianae zoospore 현탁액 20 밀리리터에 뿌리를 섭씨 25도에서 90 밀리미터의 페트리 접시에 담그고 어둠 속에서 3 시간 동안 접종하십시오. 예방 접종 후, 담배 묘목을 10 밀리리터의 멸균수로 새로운 페트리 요리에 넣고 뿌리를 담그십시오. 두 장의 여과지로 덮어서 뿌리를 촉촉하게 유지하십시오.접시를 섭씨 25도 16 시간 빛 / 8 시간의 어두운 사진 촬영 기간에 보관하십시오. 이삼 일 후에 질병의 중증도를 관찰하십시오. 제어 처리를 위해 담배 묘목을 10 밀리리터의 멸균 수로 페트리 접시에 직접 넣고 뿌리를 담그고 뿌리를 여과지 두 조각으로 덮으십시오.Phytophthora nicotianae 감염의 평가. 접종 후 사흘에서 오일 사이에 질병 중증도를 평가합니다. 중국 국가 표준에 따라 개별 식물 질병 심각도를 0에서 아홉 개까지의 척도로 채점하십시오.등급 0은 전체 식물에 증상이 없음을 의미합니다. 1등급은 줄기 둘레의 1/3 미만 또는 시들게 하는 잎의 1/3 미만의 줄기 병변을 의미합니다. 3 등급은 줄기 둘레의 1/3과 1/2 사이 또는 잎의 1/3과 1/2 사이의 줄기 병변을 약간 시들게합니다.5 등급은 줄기 둘레의 1/2보다 큰 줄기 병변을 의미하지만 둘레 주위 또는 잎의 1/2와 2/3 사이가 시들지는 않습니다. 7 등급은 전체 줄기 둘레 또는 시들게하는 잎의 2/3 이상 주위의 줄기 병변을 의미합니다. 9 학년은 식물이 죽은 것처럼 보인다는 것을 의미합니다.다음 공식을 사용하여 질병 지수를 계산하십시오. 질병 중증도는 여섯 등급으로 나뉘어졌다. 대표적인 결과.내성 품종 BH 및 감수성 품종 XHJ의 사주령 식물은 이 기사에 제시된 방법을 사용하여 Phytophthora nicotianae에 도전하였다. 접종 후 사흘 후, XHJ에서는 줄기 둘레의 약 1/2를 덮고 잎의 1/2을 약간 시들게했습니다. 내성 다양성 BH에서는, 어떠한 증상도 관찰되지 않았다.접종 후 나흘 후, XHJ에서 잎 시들음과 심한 줄기 병변이 발생했지만 이러한 증상은 접종 후 오일 BH.At 에는 나타나지 않았지만 개별 식물 질병 중증도는 담배 질병 및 곤충 해충의 등급 및 조사 방법에 대한 중국 국가 표준을 기반으로 기록되고 계산되었습니다. BH의 평균 질병 지수는 6.48이었으며, 이는 표준에 따른 내성 R을 나타내고, XHJ의 평균 질병 지수는 76.85였으며, 이는 표준에 따른 감수성 S를 나타낸다. 접종 효율을 확인하기 위해, 상대적 병원체 바이오매스를 실시간 PCR로 정량화하였다.실시간 PCR의 결과는 표현형 관찰을 확인한다. BH와 XHJ 사이의 교차의 BC4 F2 집단으로부터의 5개의 자손, 두 개의 중간 내성 품종, K326 및 Yunyan87은 동물원 포자 현탁 접종법 및 귀리 곡물 접종 방법에 의해 평가되었다. 동물원 포자 현탁법은 작은 묘목에 대해 수행되었고, 귀리 곡물 접종 방법은 성인 식물에 대해 수행되었다.BC4 F2 집단의 5 자손의 경우, 질병 지수는 동물원 포자 현탁 법에 의해 16.49에서 77.60까지의 범위였으며 귀리 곡물 방법에 의해 10.33에서 83.08 사이였습니다. 두 감염 방법 사이의 저항 분류는 대부분 서로 일치합니다. 두 가지 중간 저항 품종 K326과 Yunyan87을 사용하여 평가는 두 가지 방법 모두에서 내성을 나타 냈습니다.이들 데이터는 서로 다른 성장 기간에 담배에 대해 수행되었음에도 불구하고 두 접종 방법 사이의 상관관계를 예시한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 P.nicotianae 묘목 단계에 의한 감염에 대한 담배의 내성을 평가하는 효율적이고 신뢰할 수있는 방법입니다. 이 프로토콜은 귀리 곡물 방법이 성인 식물의 대규모 내성 스크리닝에 적용 가능하기 때문에 분자 메커니즘 연구뿐만 아니라 육종에도 실용적입니다.이 두 가지 방법은 보완적인 방법을 사용할 수 있습니다. 시청해 주셔서 감사합니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

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연구

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