Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (31571738) e pelo Programa de Inovação em Ciência e Tecnologia Agrícola da China (ASTIP-TRIC01).

1. Materiais
<ol><li>Obter variedades de tabaco. NOTA: Para este experimento "Beinhart1000-1" (uma seleção de Beinhart 1000) (BH) e "Xiaohuangjin1025" (XHJ) foram obtidos do Genbank Nacional de Médio Prazo do Recurso de Germplasma do Tabaco da China. BH é resistente, enquanto XHJ é suscetível à infecção por P. nicotianae16. Um isolamento de campo da P. nicotianae race 0, que foi preservada no Instituto de Pesquisa do Tabaco da Academia Chinesa de Ci...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

Múltiplas fontes de resistência têm sido usadas para melhorar a resistência à P. nicotianae no tabaco cultivado. Os genes R dominantes únicos, Php e Phl, foram introgressados de Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, respectivamente10. A variedade de tabaco de charuto Beinhart 1000 tem o maior nível de resistência quantitativa relatado a P. nicotianae13. Experimentos de mapeamento de intervalo múltipl...

P. nicotianae é destrutivo para muitas culturas solanáceas. Pode causar tabaco "pernil preto"1, batata foliar e tuber rot2, tomate e pimenta doce coroa e raiz rot3, e goji colar e raiz rot4. P. nicotianae pode atacar todas as partes das plantas de tabaco, incluindo as raízes, caules e folhas em qualquer estágio de crescimento5. O sintoma mais comum da doença é a base negra do talo. As raízes são inicialmente visíveis como encharcadas de água e depois tornam-se necrosadas, e as folhas apresentam grandes lesões circulares5. Essa doença pode ser devastadora para uma planta de tabaco na estufa, bem como no campo6. O método mais prático e econômico para controlar p. nicotianae é o uso de variedades resistentes7. No entanto, é necessário um protocolo de triagem eficaz para a identificação de adesões resistentes à P. nicotianae a partir de coleções de germoplasma de tabaco.
Vários métodos de identificação foram descritos para avaliar a resistência à P. nicotianae no tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Em geral, três abordagens importantes têm sido utilizadas para a identificação de genótipos de tabaco resistentes à P. nicotianae. O primeiro inclui a mistura de micélia com meio de ágar em placas de Petri contendo P. nicotianae. As micélias são então cultivadas no escuro à temperatura ambiente por 2 semanas. 1 L de água deionizada é adicionado à micélia e homogeneizado para 30 s. O inóculo é mantido no gelo até que seja necessário. Dois orifícios (1 cm de diâmetro e 4-5 cm de profundidade) são feitos em cada lado da planta, e 10 mL do inóculo são derramados em cada orifício. Os buracos são então preenchidos com o solo circundante, e o desenvolvimento de doenças é monitorado diariamente por 2 semanas8,10.
No segundo método, as plantas são inoculadas com palitos infestados de patógenos. Para esta abordagem, as plantas devem ser utilizadas aproximadamente 6 semanas após o transplante e devem ter uma altura mínima de 30 cm. Palitos de dente autoclavados são colocados na superfície de culturas que contêm P. nicotianae mycelia. Os pratos de cultura são então armazenados sob a luz à temperatura ambiente por 7 dias. Então, palitos colonizados são usados para vacinar as plantas. Palitos de dente são inseridos nas hastes de tabaco entre o quarto e o quinto nós. As plantas são monitoradas diariamente durante 5 dias9,15. Este método não é aplicável para pequenas mudas. Como o inóculo é um palito infestado de patógenos, a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
A abordagem mais utilizada envolve grãos de aveia para inoculação. Neste caso, os grãos de aveia são preparados por autoclaving 500 mL de aveia e 300 mL de água deionizada a 121 °C por 1h uma vez por dia durante 3 dias. Em seguida, os grãos de aveia são adicionados ao meio de cultura colonizada por patógenos. Os pratos são selados com filme de parafina e incubados a 25 °C em luz por 7-12 dias. Quatro buracos de 5 cm de profundidade separados são feitos no solo de vasos, 4 cm de cada planta, e um grão de aveia infestado de patógenos é colocado em cada orifício. O período de incubação é determinado com base em quando o primeiro sintoma acima do solo ocorre7,11,12,13,14,15,16. Este método é eficiente e aplicável para a triagem de resistência em larga escala. No entanto, uma limitação dessa abordagem é que o inóculo é de grãos de aveia infestados de patógenos, portanto a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.
No entanto, aqui apresentado é um método mais preciso que é aplicável à avaliação da resistência da câmara de crescimento. Em comparação com as outras abordagens, o inóculo é a suspensão do zoospore, portanto a intensidade da inoculação é controlável e ajustável. Como as plantas de tabaco neste estudo são cultivadas sem solo, os resultados são mais fáceis de observar. Além disso, a amostragem das raízes vegetais do solo sempre causa danos às raízes, o que induz uma série de respostas fisiológicas17. Neste método, como as plantas são cultivadas sem solo, a interferência no dano radicular pode ser eliminada. Em conclusão, este método é mais prático para pesquisa de mecanismos moleculares e criação de precisão. Usando este protocolo, os dados são normalmente obtidos dentro de 5 dias, com mais de 200 plantas avaliadas em um único experimento.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

A haste preta, causada pelos oomycetes Phytophthora nicotianae, é destrutiva para o tabaco, e este patógeno é altamente patogênico para muitas culturas solanáceos. P. nicotianae é bem adaptado a altas temperaturas; portanto, a pesquisa sobre esse patógeno está ganhando importância na agricultura mundial por causa do aquecimento global. As variedades resistentes à p. nicotianae de plantas de tabaco são comumente rastreadas pela inoculação com grãos de aveia colonizados por P. nicotianae e monitoramento dos sintomas da doença. No entanto, é difícil quantificar a intensidade da inoculação, uma vez que a inoculação precisa é crucial neste caso. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção com P. nicotianae. Este método tem sido usado com sucesso para identificar variedades resistentes, e a eficiência da inoculação foi confirmada por PCR em tempo real. O método de avaliação de resistência apresentado neste estudo é eficiente e prático para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.

Plantas de 4 semanas de idade da variedade resistente BH e variedade suscetível XHJ foram desafiadas com P. nicotianae utilizando o método apresentado neste artigo. O experimento foi projetado com três réplicas, cada uma com 8 plantas por grupo. A infecção por P. nicotianae das duas variedades de tabaco, BH e XHJ, é apresentada na Figura 2. Aos 3 dias após a inoculação, para XHJ, as lesões do caule cobriram aproximadamente metade da cintura do caule, e metade da...

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Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. Trata-se de uma abordagem prática para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.

Triagem de Genótipos de Tabaco para Resistência de Phytophthora nicotianae

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. É prático para a reprodução de precisão, bem como para pesquisa de mecanismos moleculares. Materiais. Obter as variedades de tabaco Beinhart1000-1, uma seleção de Beinhart1000 BH, e Xiaohuangjin1025 XHJ do National Medium-term Geneback do Recurso de Germoplasma do Tabaco da China.BH é resistente, enquanto XHJ é suscetível à infecção por Phytophthora nicotianae. Plantio de genótipos de tabaco para avaliação da resistência de Phytophthora nicotianae. Misture as sementes de tabaco com vermiculite e transmita as sementes suavemente no solo esterilizado.Coloque os potes na câmara de crescimento. Mantenha uma temperatura constante de 25 graus Celsius sob um período de 16 horas de luz/oito horas de foto escura. Prepare dispositivos hidropônicos com bandejas e folhas de espuma.Depois que as sementes germinam, as mudas espinhosas saem do solo de vasos. Lave as raízes suavemente com água deionizada estéril e transplante-as nos dispositivos hidropônicos. Coloque os dispositivos em câmaras climáticas a 25 graus Celsius sob um período de seis horas de luz/oito horas de foto escura durante 24 horas.Prepare a solução de nutrientes Hoagland com antecedência. Transplante das mudas para dispositivos hidropônicos com solução de nutrientes Hoagland. Coloque os dispositivos na câmara climática a 25 graus Celsius sob período de 16 horas de luz/oito horas de foto escura durante duas semanas.Preparação da suspensão do zoológico Phytophthora nicotianae. Preparação do ágar médio de aveia. Pesar 33 gramas de aveia em um oco e adicionar 1.000 mililitros de água estéril.Ferva em um forno eletromagnético. Depois que a aveia ficar pegajosa, coe o líquido através de um pedaço de gaze estéril. Despeje o líquido em um cilindro graduado de 1.000 mililitros e ajuste o volume para 1.000 mililitros com água estéril.Despeje o líquido em uma garrafa de reagente de vidro e adicione 18 gramas de ágar. Agite bem e autoclave a mistura de aveia ágar médio a 121 graus Celsius por 15 minutos. Deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.Despeje cerca de 20 mililitros de ágar de aveia esterilizado médio para cada placa de Petri. Deixe as placas de Petri à temperatura ambiente para esfriar bem antes do cultivo micelial. Cultivo micelial.Prepare socos de um centímetro de diâmetro e palitos de dente de antemão, autoclavando-os em uma autoclave a 121 graus Celsius por 15 minutos. Furos em Phytophthora nicotianae mycelial culturas de ágar para fazer tapetes de micélio redondos. Escolha tapetes de micrúbio, coloque o lado mycelial no meio de ágar de aveia e incuba o micélio a 25 graus Celsius no escuro por 14 dias.Preparação da suspensão do zoológico Phytophthora nicotianae. Adicione 0,1% solução de nitrato de potássio a cada cultivo micelial 15 mililitros por prato, seguido de cultivo a quatro graus Celsius por 20 minutos para induzir o esporangium. Mantenha os pratos a 25 graus Celsius por 25 minutos para liberar zoospores.Colete a suspensão do zoospore a um béquer e meça a concentração de zoospore por microscópio e hemócito. Ajuste a concentração do zoospore para uma vez 10 para o quarto zoospore por mililitro com água estéril. Identificação de variedades de tabaco resistentes a doenças.Pegue as mudas da solução de nutrientes hoagland e inocula-as imergindo as raízes em 20 mililitros de suspensão zoospora Phytophthora nicotianae em uma placa de Petri de 90 milímetros a 25 graus Celsius por três horas no escuro. Após a inoculação, coloque as mudas de tabaco em novas placas de Petri com 10 mililitros de água estéril, imergindo as raízes. Mantenha as raízes úmidas cobrindo com dois pedaços de papel filtro.Mantenha os pratos em 25 graus Celsius 16 horas de luz/período de oito horas de foto escura. Após dois a três dias, observe a gravidade da doença. Para o tratamento de controle, coloque as mudas de tabaco diretamente nas placas de Petri com 10 mililitros de água estéril, imergindo as raízes e cobrindo as raízes por dois pedaços de papel filtro.Avaliação da infecção por Phytophthora nicotianae. Avalie a gravidade da doença de quatro a cinco dias após a inoculação. Com base no padrão nacional chinês, escore a gravidade da doença vegetal individual em uma escala de zero a nove.Grau 0 significa que não há sintomas em toda a planta. Grau 1 significa lesões de haste inferiores a 1/3 da cintura-tronco ou 1/3 de folhas murchando. Grau 3 significa lesões de haste entre 1/3 e 1/2 de cintura-tronco ou entre 1/3 e 1/2 de folhas ligeiramente murchas.Grau 5 significa lesões de haste maiores que 1/2 de cintura de haste, mas não completamente ao redor da cintura ou entre 1/2 e 2/3 de folhas murchando. Grau 7 significa lesões de haste em torno de toda a cintura da haste ou maior que 2/3 de folhas murchando. Grau 9 significa que as plantas parecem mortas.Calcule o índice da doença usando a seguinte fórmula. A gravidade da doença foi dividida em seis graus. Resultados representativos.Plantas de quatro semanas de idade da variedade resistente BH e variedade suscetível XHJ foram desafiadas com Phytophthora nicotianae usando o método apresentado neste artigo. Em três dias após a inoculação, em XHJ, as lesões do caule cobriram aproximadamente 1/2 da cintura da haste e 1/2 das folhas foram ligeiramente murchas. Na variedade resistente BH, não foram observados sintomas.Aos quatro dias após a inoculação, o murcho da folha e as lesões graves do caule ocorreram no XHJ, enquanto esses sintomas não apareceram em BH.At cinco dias após a inoculação, a gravidade da doença vegetal individual foi registrada e calculada com base no padrão nacional chinês para o método de grau e investigação de doenças do tabaco e pragas de insetos. O índice médio da doença de BH foi de 6,48, o que mostra resistência R de acordo com a norma, e o índice médio de doença de XHJ foi de 76,85, o que mostra suscetibilidade S de acordo com a norma. Para confirmar a eficiência da inoculação, a biomassa relativa do patógeno foi quantificada por PCR em tempo real.O resultado do PCR em tempo real confirma as observações fenotípicas. Cinco progênios da população BC4 F2 de um cruzamento entre BH e XHJ, duas variedades de resistência intermediária, K326 e Yunyan87, foram avaliados pelo método de inoculação de suspensão do zoospore e método de inoculação de grãos de aveia. O método de suspensão do zoospore foi realizado em pequenas mudas e foi realizado método de inoculação de grãos de aveia em plantas adultas.Para os cinco progens da população BC4 F2, o índice da doença variou de 16,49 a 77,60 pelo método de suspensão do zoospore e variou de 10,33 a 83,08 pelo método de grãos de aveia. As classificações de resistência entre dois métodos de infecção são em sua maioria consistentes entre si. Com as duas variedades de resistência intermediária K326 e Yunyan87, a avaliação mostrou-se resistente em ambos os métodos.Esses dados ilustram a correlação entre dois métodos de inoculação, apesar de terem sido realizados no tabaco em diferentes períodos de crescimento. O protocolo descrito aqui é um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção pelo estágio de muda de P.nicotianae. Este protocolo é prático para a reprodução, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares, uma vez que o método de grãos de aveia é aplicável para o rastreamento de resistência em larga escala de plantas adultas.Estes dois métodos podem usar complementar. Obrigado por assistir.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Escolha e No-Choice ensaios para testar a resistência de A. thaliana para Insetos Chewing

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

Biologia

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

EsiRNA MISSÃO para a seleção RNAi em células de mamíferos

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Bioensaios de Resistência a Inseticidas Monitoramento

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Mecanismos Herbívoro caracterizando Resistance: Spittlebugs em Brachiaria Spp. como Exemplo

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

Um ensaio de rastreio fluorescente para identificação Moduladores de Canais GIRK

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA Secundária Previsão Estrutura Usando SHAPE de alta capacidade

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Avaliando Murino Resistência Função Usando Miografia Pressão Arterial

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Rastreio de alto rendimento para moduladores químicos de Genes Post-transcriptionally Regulamentados

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imagiologia reorganização espacial de uma via de sinalização MAPK Utilizar o sistema de expressão transitória do Tabaco

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Comparação de tabaco métodos de remoção de células hospedeiras de proteínas por descascamento plantas intactas ou por tratamento térmico de extratos

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...