Name: screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance
Uploaded: 2022-04-15T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Denna forskning finansierades av National Natural Science Foundation of China (31571738) och Agricultural Science and Technology Innovation Program of China (ASTIP-TRIC01).

1. Material
<ol><li>Få tobakssorter. OBS: För detta experiment erhölls "Beinhart1000-1" (ett urval av Beinhart 1000) (BH) och "Xiaohuangjin1025" (XHJ) från National Medium-term Genbank of the Tobacco Germplasm Resource of China. BH är resistent, medan XHJ är mottaglig för P. nicotianae infektion16. En fältisolat av P. nicotianae race 0, som bevarades i Tobacco Research Institute vid Chinese Academy of Agricultural Sciences, användes för alla vaccin...

<ol>
	<li>Antonopoulos, D. F., Melton, T., Mila, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+chemical+control,+cultivar+resistance,+and+structure+of+cultivar+root+system+on+black+shank+incidence+of+tobacco.">Effects of chemical control, cultivar resistance, and structure of cultivar root system on black shank incidence of tobacco.</a> Plant Disease. 94 (5), 613-620 (2010).</li><li>Taylor, R. J., Pasche, J. S., Gallup, C. A., Shew, H. D., Gudmestad, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+foliar+blight+and+tuber+rot+of+potato+caused+by+Phytophthora+nicotianae:+New+occurrences+and+characterization+of+isolates.">A foliar blight and tuber rot of potato caused by Phytophthora nicotianae: New occurrences and characterization of isolates.</a> Plant Disease. 92 (4), 492-503 (2008).</li><li>Amalia, B. R., Jos&#233;, I. M. G., Miguel, D. C. G., Francisco, C. F., Julio, C. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenicity+of+plant+and+soil+isolates+of+Phytophthora+parasitica+on+tomato+and+pepper.">Pathogenicity of plant and soil isolates of Phytophthora parasitica on tomato and pepper.</a> European Journal of Plant Pathology. 148 (3), 607-615 (2017).</li><li>Corrado, C., Annamari, M., Leonardo, S., Antonio, I., Simona, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=First+report+of+collar+and+root+rot+caused+by+Phytophthora+nicotianae+on+Lycium+barbarum.">First report of collar and root rot caused by Phytophthora nicotianae on Lycium barbarum.</a> Journal of Plant Pathology. 100 (2), (2018).</li><li>Meng, Y. L., Zhang, Q., Ding, W., Shan, W. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+parasitica.:+a+model+oomycete+plant+pathogen.">Phytophthora parasitica.: a model oomycete plant pathogen.</a> Mycology. 5 (2), 43-51 (2014).</li><li>Biasi, A., Martin, F. N., Cacciola, S. O., Lio, G. M., Grunwald, N. J., Schena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+Phytophthora+nicotianae+populations+from+different+hosts+using+microsatellite+markers.">Genetic analysis of Phytophthora nicotianae populations from different hosts using microsatellite markers.</a> Phytopathology. 106 (9), 1006-1014 (2016).</li><li>Sullivan, M. J., Melton, T. A., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+of+races+0+and+1+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae.">Fitness of races 0 and 1 of Phytophthora parasitica var. nicotianae.</a> Plant Disease. 89 (11), 1220-1228 (2005).</li><li>Carlson, S. R., Wolff, M. A. F., Shew, H. D., Wernsman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Race+0+of+Phytophthora+parasitica+var.+nicotianae+from+the+flue-cured+tobacco+cultivar+Coker+371-Gold.">Inheritance of resistance to Race 0 of Phytophthora parasitica var. nicotianae from the flue-cured tobacco cultivar Coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 81 (11), 1269-1274 (1997).</li><li>Csinos, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+root+resistance+to+tobacco+black+shank.">Stem and root resistance to tobacco black shank.</a> Plant Disease. 83 (8), 777-780 (1999).</li><li>Johnson, E. S., Wolff, M. F., Wernsman, E. A., Atchley, W. R., Shew, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+black+shank+resistance+gene,+Ph,+in+tobacco+cultivar+coker+371-Gold.">Origin of the black shank resistance gene, Ph, in tobacco cultivar coker 371-Gold.</a> Plant Disease. 86 (10), 1080-1084 (2002).</li><li>Osmany, C., Ingrid, H., Roxana, P., Yunior, L., Merardo, P., Orlando, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 177 (3), 175-180 (2009).</li><li>Hern&#225;ndez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistant+tobacco+by+silencing+of+glutathione+S-transferase.">Black shank resistant tobacco by silencing of glutathione S-transferase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 300-304 (2009).</li><li>Vontimitta, V., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+chamber+evaluation+of+a+tobacco+'Beinhart+1000'+&#215;+'Hicks'+mapping+population+for+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+multiple+races+of+Phytophthora+nicotianae.">Growth chamber evaluation of a tobacco 'Beinhart 1000' &#215; 'Hicks' mapping population for quantitative trait loci affecting resistance to multiple races of Phytophthora nicotianae.</a> Crop Science. 52 (1), 91-98 (2012).</li><li>Xiao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+genomic+regions+contributing+to+Phytophthora+nicotianae+resistance+in+tobacco+cultivar+florida+301.">Location of genomic regions contributing to Phytophthora nicotianae resistance in tobacco cultivar florida 301.</a> Crop Science. 53 (2), 473-481 (2013).</li><li>McCorkle, K., Lewis, R., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+breeding+lines+derived+from+variety+Beinhart+1000.">Resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco breeding lines derived from variety Beinhart 1000.</a> Plant Disease. 97 (2), 252-258 (2013).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+stably+expressed+QTL+for+resistance+to+black+shank+disease+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart+1000-1.">Identification of stably expressed QTL for resistance to black shank disease in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart 1000-1.</a> The Crop Journal. 6 (3), 282-290 (2018).</li><li>Yu, X., Feng, B., He, P., Shan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+chaos+to+harmony:+responses+and+signaling+upon+microbial+pattern+recognition.">From chaos to harmony: responses and signaling upon microbial pattern recognition.</a> Annual Review of Phytopathology. 55, 109-137 (2017).</li><li>Ren, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> GB/T 23222 Grade and Investigation Method of Tobacco Diseases and Insect Pests. , (2008).</li><li>Doyle, J. J., Doyle, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+DNA+isolation+procedure+for+small+quantities+of+fresh+leaf+tissue.">A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue.</a> Phytochemical Bulletin. 19 (11), 11-15 (1987).</li><li>Yan, H. Z., Liou, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+internal+control+genes+for+real-time+quantitative+RT-PCR+assays+in+the+oomycete+plant+pathogen+Phytophthora+parasitica.">Selection of internal control genes for real-time quantitative RT-PCR assays in the oomycete plant pathogen Phytophthora parasitica.</a> Fungal Genetics and Biology. 43, 430-438 (2006).</li><li>Chac&#243;n, O., Hern&#225;ndez, I., Portieles, R., L&#243;pez, Y., Pujol, M., Borr&#225;s-Hidalgo, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+defense-related+genes+in+tobacco+responding+to+black+shank+disease.">Identification of defense-related genes in tobacco responding to black shank disease.</a> Plant Science. 117 (3), 175-180 (2009).</li><li>Vijay, V., Ramsey, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+quantitative+trait+loci+affecting+resistance+to+Phytophthora+nicotianae+in+tobacco+(Nicotiana+tabacum+L.)+line+Beinhart-1000.">Mapping of quantitative trait loci affecting resistance to Phytophthora nicotianae in tobacco (Nicotiana tabacum L.) line Beinhart-1000.</a> Molecular Breeding. 29 (1), 89-98 (2012).</li><li>McCorkle, K. L., Drake-Stowe, K., Lewis, R. S., Shew, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+nicotianae+resistance+conferred+by+the+introgressed+Nicotiana+rustica+region,+Wz,+in+flue-cured+tobacco.">Characterization of Phytophthora nicotianae resistance conferred by the introgressed Nicotiana rustica region, Wz, in flue-cured tobacco.</a> Plant Disease. 102 (2), 309-317 (2018).</li><li>Drake, K. E., Moore, J. M., Bertrand, P., Fortnum, B., Peterson, P., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Black+shank+resistance+and+agronomic+performance+of+flue-cured+tobacco+lines+and+hybrids+carrying+the+introgressed+Nicotiana+rustica+Region.">Black shank resistance and agronomic performance of flue-cured tobacco lines and hybrids carrying the introgressed Nicotiana rustica Region.</a> Wz. Crop Science. 55 (1), 79-86 (2015).</li><li>Kebdani, N., Pieuchot, L., Deleury, E., Panabi&#232;res, F., Berre, J. -. Y. L., Gourgues, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+characterization+of+Phytophthora+parasitica+appressorium-mediated+penetration.">Cellular and molecular characterization of Phytophthora parasitica appressorium-mediated penetration.</a> New Phytologist. 185 (1), 248-257 (2010).</li><li>Huang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+RXLR+effector+secreted+by+Phytophthora+parasitica+is+a+virulence+factor+and+triggers+cell+death+in+various+plants.">An RXLR effector secreted by Phytophthora parasitica is a virulence factor and triggers cell death in various plants.</a> Molecular Plant Pathology. 20 (3), 1-16 (2019).</li><li>Agn&#232;s, A., Mathieu, G., Nicolas, C. -. T., Harald, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immediate+activation+of+defense+responses+in+Arabidopsis+roots+is+not+sufficient+to+prevent+Phytophthora+parasitica+infection.">The immediate activation of defense responses in Arabidopsis roots is not sufficient to prevent Phytophthora parasitica infection.</a> New Phytologist. 187 (2), 229 (2010).</li></ol>

Flera resistenskällor har använts för att förbättra P. nicotianae resistensen i odlad tobak. Endominerande R gener, Php och Phl, har introgressed från Nicotiana plumbaginifolia respektive Nicotiana longiflora, respektive10. Cigarrtobakssorten Beinhart 1000 har den högsta rapporterade nivån av kvantitativ resistens mot P. nicotianae13. Flera intervall mappning experiment har föreslagit att minst sex kvantitativa ...

P. nicotianae är destruktiv för många solanaceous grödor. Det kan orsaka tobak "svart skaft"1, potatisfoliering och knölrot2, tomat- och paprikakrona och rotrot3 och Goji krage och rotrot4. P. nicotianae kan attackera alla delar av tobaksplantor, inklusive rötter, stjälkar och löv i alla odlingsstadier5. Det vanligaste symptomet på sjukdomen är stjälkens svarta bas. Rötterna är initialt synliga som vattendränkta och blir sedan nekrotiska, och bladen visar stora cirkulära lesioner5. Denna sjukdom kan vara förödande för en tobaksväxt i växthuset, liksom i fältet6. Den mest praktiska och ekonomiska metoden för att kontrollera P. nicotianae är användningen av resistenta sorter7. Det krävs dock ett effektivt screeningprotokoll för identifiering av P. nicotianae-resistenta anslutningar från tobaksgroddsplasma samlingar.
Olika identifieringsmetoder har beskrivits för att bedöma P. nicotianaresistens hos tobak7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. I allmänhet har tre huvudsakliga metoder använts för identifiering av P. nicotianae-resistenta tobaks genotyper. Den första inkluderar blandning av mycelia med agarmedium på Petri-plattor som innehåller P. nicotianae. Mycelia odlas sedan i mörkret vid rumstemperatur i 2 veckor. 1 L avjoniserat vatten tillsätts mycelia och homogeniseras i 30 s. Inokulat hålls på is tills det behövs. Två hål (1 cm i diameter och 4-5 cm djupa) görs på varje sida av växten, och 10 ml inokulat hälls i varje hål. Hålen fylls sedan med den omgivande jorden och sjukdomsutvecklingen övervakas dagligen i 2 veckor8,10.
I den andra metoden inokuleras växterna med patogeninfekterade tandpetare. För detta tillvägagångssätt bör växterna användas cirka 6 veckor efter transplantation och bör ha en minimihöjd på 30 cm. Autoklaverade tandpetare placeras på ytan av kulturer som innehåller P. nicotianae mycelia. Odlingsfaten förvaras sedan under ljuset i rumstemperatur i 7 dagar. Sedan används koloniserade tandpetare för att inokulera växterna. Tandpetare sätts in i tobaksstammarna mellan den fjärde och femte noderna. Växterna övervakas dagligen i 5 dagar9,15. Denna metod är inte tillämplig för små plantor. Eftersom inokulat är patogeninfekterade tandpetare kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Det vanligaste tillvägagångssättet involverar havrekorn för inokulering. I detta fall bereds havrekorn genom autoklavering 500 ml havre och 300 ml avjoniserat vatten vid 121 °C i 1 timme en gång per dag i 3 dagar. Sedan läggs havrekorn till det patogenkoloniserade odlingsmediet. Rätterna förseglas med paraffinfilm och inkuberas vid 25 °C i ljus i 7-12 dagar. Fyra separata 5 cm djupa hål görs på pottingjorden, 4 cm från varje växt, och en patogeninfekterad havrekorn placeras i varje hål. Inkubationstiden bestäms baserat på när det första symptomet ovan jord inträffar7,11,12,13,14,15,16. Denna metod är effektiv och tillämplig för storskalig resistensscreening. En begränsning av detta tillvägagångssätt är dock att inokulat är patogeninfekterade havrekorn, därför kan inokuleringsintensiteten inte kontrolleras exakt.
Presenteras här är dock en mer exakt metod som är tillämplig på tillväxtkammare motstånd utvärdering. Jämfört med de andra metoderna är inokulat zoospore suspension, därför är inokuleringsintensiteten kontrollerbar och justerbar. Eftersom tobaksplantorna i denna studie odlas utan jord är resultaten lättare att observera. Dessutom orsakar provtagning av växtrötter från jorden alltid skador på rötterna, vilket inducerar en serie fysiologiska svar17. I denna metod, eftersom växter odlas utan jord, kan störningen i rotskador elimineras. Sammanfattningsvis är denna metod mer praktisk för molekylär mekanismforskning och precisionsuppfödning. Med hjälp av det här protokollet erhålls data vanligtvis inom 5 dagar, med mer än 200 växter utvärderade i ett enda experiment.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002917</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6 Mo7O24&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>XW131067681</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120086</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30120094</td>
			<td>Used for Sample Extarction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>MDBio, Inc</td>
			<td>9002-18-0</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical Balance</td>
			<td>AOHAOSI</td>
			<td>AX2202ZH</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Yamatuo</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>YAMATUO</td>
			<td>SQ510C</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beaker</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHSB-2L</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biological Incubator</td>
			<td>JINGHONG</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>80029062</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10005817</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4&#8226;5 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10008218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electromagnetic Oven</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDCL</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FeSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10002918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHLZ-9CM</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Ration PCR Instrument</td>
			<td>Roche</td>
			<td>LightCycler96</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>17071202</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>Phytotechnology</td>
			<td>B210-500G</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>17072801</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2SO4</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017918</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10017218</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KT Foam Sheet</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHKTB</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Constant Incubator</td>
			<td>Jinghong</td>
			<td>SHP-250</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring Cylinder</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHBLLT-1000ML</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10013080</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>ECHO</td>
			<td>RVL-100-G</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2&#8226;4 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G5468154</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-EDTA</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>G21410-250</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#8226;2 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>20040717</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4NO3</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>B64586-100g</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oatmeal</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMP-1.5KG</td>
			<td>Materials of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHPYM-9CM</td>
			<td>Material for disease-resistant&#160; identification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor</td>
			<td>THERMO</td>
			<td>S1</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYCXHP-12CM</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potting Soil</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMJZ-50L</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHDKW</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
			<td>Monad</td>
			<td>MQ50401S</td>
			<td>qRT-PCR Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR&#160;Green Premix&#160;Pro Taq&#160;HS qPCR Kit</td>
			<td>Accurate Biology</td>
			<td>AG11718</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothpick</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYQ-900</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA Kit II</td>
			<td>Omega</td>
			<td>R6934-01</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TransScript&#174;&#160;II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix</td>
			<td>Transgen</td>
			<td>AH311-02</td>
			<td>PCR Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trays</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHYMTP-90G</td>
			<td>Material for Seedling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite</td>
			<td>Bio Best</td>
			<td>DHZS</td>
			<td>Seedling Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Purification System</td>
			<td>HEAL FORCE</td>
			<td>HSE68-2</td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4&#8226;7 H2O</td>
			<td>Sinopharm</td>
			<td>10024018</td>
			<td>Analytical Reagent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening of tobacco genotypes for phytophthora nicotianae resistance

Svart skaft, orsakad av oomycetes Phytophthora nicotianae, är destruktiv för tobak, och denna patogen är högpatogen för många solanaceous grödor. P. nicotianae är väl anpassad till höga temperaturer; Därför blir forskningen om denna patogen allt viktigare inom jordbruket över hela världen på grund av den globala uppvärmningen. P. nicotianae-resistenta sorter av tobaksplantor screenas ofta genom inokulering med havrekorn koloniserade av P. nicotianae och övervakning för sjukdomssymptomen. Det är dock svårt att kvantifiera inokuleringsintensiteten eftersom korrekt inokulering är avgörande i detta fall. Denna studie syftade till att utveckla en effektiv och tillförlitlig metod för att utvärdera tobakens motståndskraft mot infektion med P. nicotianae. Denna metod har framgångsrikt använts för att identifiera resistenta sorter, och inokuleringseffektiviteten bekräftades av PCR i realtid. Den resistensutvärderingsmetod som presenteras i denna studie är effektiv och praktisk för precisionsuppfödning, samt molekylär mekanismforskning.

4 veckor gamla växter av den resistenta sorten BH och mottagliga sorten XHJ utmanades med P. nicotianae med hjälp av metoden som presenteras i denna artikel. Experimentet utformades med tre replikat, var och en med 8 växter per grupp. P. nicotianae infektion av de två tobakssorterna, BH och XHJ, presenteras i figur 2. Vid 3 dagar post inokulering, för XHJ, stamskador täckte ungefär hälften av stjälk omkretsen, och hälften av bladen var något vissna. i den resist...

Watch this Scientific Journal Video about Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance at JoVE.com

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Här presenteras ett protokoll för effektiv och korrekt screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae motstånd i plantor. Detta är ett praktiskt tillvägagångssätt för precisionsuppfödning, liksom molekylär mekanismforskning.

Screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae Resistance

Black shank, caused by the oomycetes Phytophthora nicotianae, is destructive to tobacco, and this pathogen is highly pathogenic to many solanaceous crops. ...

Här presenteras ett protokoll för effektiv och korrekt screening av tobaksgenotyper för Phytophthora nicotianae motstånd i plantor. Det är praktiskt för precisionsuppfödning, liksom molekylär mekanismforskning. Material. Få tobakssorter Beinhart1000-1, ett urval av Beinhart1000 BH och Xiaohuangjin1025 XHJ från National Medium-term Geneback of the Tobacco Germplasm Resource of China.BH är resistent, medan XHJ är mottaglig för Phytophthora nicotianae infektion. Plantering tobak genotyper för Phytophthora nicotianae resistens utvärdering. Blanda tobaksfrön med vermikulit och sänd fröna försiktigt på den steriliserade pottingjorden.Placera krukorna i tillväxtkammaren. Håll en konstant temperatur på 25 grader Celsius under en 16-timmars ljus / åtta timmars mörk fotoperiod. Förbered hydroponiska enheter med brickor och skumplåtar.Efter frön gror, prickplantor ut från potting jorden. Tvätta rötterna försiktigt med sterilt avjoniserat vatten och transplantera dem till de hydroponiska enheterna. Placera enheterna i klimatkammare på 25 grader Celsius under en sex timmars ljus/ åtta timmars mörk fotoperiod i 24 timmar.Förbered Hoagland näringslösning i förväg. Transplantera plantorna till hydroponiska enheter med Hoagland näringslösning. Placera enheterna i klimatkammaren vid 25 grader Celsius under 16-timmars ljus / åtta timmars mörk fotoperiod i två veckor.Beredning av Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Beredning av havregryn agar medium. Väg 33 gram havregryn i en ihåliga material och tillsätt 1 000 milliliter sterilt vatten.Koka på en elektromagnetisk ugn. När havregrynet blir klibbigt, spänn vätskan genom en bit steril gasväv. Häll vätskan i en 1 000 milliliter graderad cylinder och justera volymen till 1 000 milliliter med sterilt vatten.Häll vätskan i en glasreagensflaska och tillsätt 18 gram agar. Skaka väl och autoklav blandningen havregryn agar medium vid 121 grader Celsius i 15 minuter. Låt det vara i rumstemperatur i 30 minuter.Häll cirka 20 ml steriliserat havregrynsatgarmedel till varje Petri-maträtt. Låt Petri-disken svalna i rumstemperatur för att svalna ordentligt före mycelial odling. Mycelial odling.Förbered en centimeter diameter stansar och tandpetare i förväg genom att autoklavera dem i en autoklav vid 121 grader Celsius i 15 minuter. Stansa hål i Phytophthora nicotianae mycelial agar kulturer för att göra runt mycelial mattor. Välj ut mycelialmattor, placera mycelialsidan ner på havregryns agarmedium och inkubera myceliet vid 25 grader Celsius i mörkret i 14 dagar.Beredning av Phytophthora nicotianae zoospore suspension. Tillsätt 0,1% kaliumnitratlösning till varje mycelial odling 15 milliliter per maträtt, följt av odling vid fyra grader Celsius i 20 minuter för att inducera sporangium. Håll disken på 25 grader Celsius i 25 minuter för att släppa zoosporer.Samla zoospore suspension till en bägare och mäta zoospore koncentrationen genom mikroskop och hemocytometer. Justera zoosporkoncentrationen till en gång 10 till den fjärde zoosporen per milliliter med sterilt vatten. Identifiering av sjukdomsresistenta tobakssorter.Ta plantor från Hoagland näringslösning och vaccinera dem genom att nedsänka rötterna i 20 milliliter Phytophthora nicotianae zoospore suspension i en Petri-maträtt 90 millimeter vid 25 grader Celsius i tre timmar i mörkret. Efter inokulering, sätt tobaksplantor till nya Petri-rätter med 10 milliliter sterilt vatten, nedsänk rötterna. Håll rötterna fuktiga genom att täcka med två bitar filterpapper.Håll disken i 25 grader Celsius 16-timmars ljus / åtta timmars mörk fotoperiod. Efter två till tre dagar, observera sjukdomens svårighetsgrad. För kontrollbehandlingen, lägg tobaksplantorna direkt i Petri-disken med 10 ml sterilt vatten, nedsänk rötterna och täck rötterna med två bitar filterpapper.Utvärdering av Phytophthora nicotianae infektion. Utvärdera sjukdomens svårighetsgrad fyra till fem dagar efter inokulering. Baserat på den kinesiska nationella standarden, poäng individuell växtsjukdom allvarlighetsgrad på en skala från noll till nio.Grad 0 betyder inga symtom på hela växten. Grad 1 innebär stamskador mindre än 1/3 av stjälkomkrets eller 1/3 av bladen vissnande. Grad 3 betyder stamskador mellan 1/3 och 1/2 av stjälkomkrets eller mellan 1/3 och 1/2 av bladen något vissnande.Grad 5 betyder stamskador större än 1/2 av stjälkomkrets, men inte helt runt omkretsen eller mellan 1/2 och 2/3 av bladen vissnande. Grad 7 betyder stamskador runt hela stjälkomkretsen eller större än 2/3 av bladen vissnande. Grad 9 betyder att växter ser döda ut.Beräkna sjukdomsindexet med hjälp av följande formel. Sjukdomens svårighetsgrad delades in i sex grader. Representativa resultat.Fyra veckor gamla växter av den resistenta sorten BH och mottagliga sorten XHJ utmanades med Phytophthora nicotianae med den metod som presenteras i denna artikel. Vid tre dagar post inokulering, i XHJ, stam skador täckt cirka 1/2 av stjälk omkrets och 1/2 av bladen var något vissna. I den resistenta sorten BH observerades inga symtom.Vid fyra dagar efter inokulering, blad vissning och allvarliga stamskador inträffade i XHJ medan dessa symtom inte uppträdde i BH.At fem dagar efter inokulering, registrerades individuell växtsjukdom allvarlighetsgrad och beräknades baserat på den kinesiska nationella standarden för kvalitet och undersökningsmetod för tobakssjukdomar och insektsskadegörare. Medelvärdet för sjukdom index för BH var 6,48, vilket visar resistens R enligt standarden, och medelvärdet sjukdom index för XHJ var 76,85, vilket visar mottaglighet S enligt standarden. För att bekräfta inokuleringseffektiviteten kvantifierades relativ patogen biomassa genom PCR i realtid.Resultatet av realtid PCR bekräftar fenotypiska observationer. Fem avkommor från BC4 F2-populationen av en korsning mellan BH och XHJ, två mellanliggande resistenssorter, K326 och Yunyan87, utvärderades med zoospore suspension inokuleringsmetod och havre korn inokuleringsmetod. Zoospore suspensionsmetod utfördes på små plantor och havrekorn inokuleringsmetod utfördes på vuxna växter.För de fem avkomman från BC4 F2-populationen varierade sjukdomsindexet från 16,49 till 77,60 med zoospore suspensionsmetod och varierade från 10,33 till 83,08 med havrekornsmetod. Resistensklassificeringarna mellan två infektionsmetoder är oftast förenliga med varandra. Med de två mellanliggande resistanssorterna K326 och Yunyan87 visade utvärderingen resistenta i båda metoderna.Dessa data illustrerar korrelationen mellan två inokuleringsmetod trots att de utfördes på tobak under olika tillväxtperiod. Protokollet som beskrivs här är en effektiv och tillförlitlig metod för att utvärdera tobakens motståndskraft mot infektion genom P.nicotianae plantstadiet. Detta protokoll är praktiskt för avel såväl som för molekylär mekanismforskning eftersom havrekornsmetoden är tillämplig för storskalig resistensscreening av vuxna växter.Dessa två metoder kan använda komplement. Tack för att du tittade.

Research

JoVE Journal

Biology

Screening of Tobacco Genotypes for Phytophthora nicotianae Resistance

Choice and No-Choice Assays for Testing the Resistance of A. thaliana to Chewing Insects

Valfrihet och No-val analyser för att testa Resistance A. thaliana att tugga Insekter

Larvae of the small white cabbage butterfly are a pest in agricultural settings. This caterpillar species feeds from plants in the cabbage family, which ...

MISSION esiRNA for RNAi Screening in Mammalian Cells

UPPDRAG esiRNA för RNAi screening i däggdjursceller

RNA interference (RNAi) is a basic cellular mechanism for the control of gene expression. RNAi is induced by short double-stranded RNAs also known as ...

Bioassays for Monitoring Insecticide Resistance

Biologiska testsystem för övervakning Insektsmedel Resistance

Pest resistance to pesticides is an increasing problem because pesticides are an integral part of high-yielding production agriculture. When few products ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Kännetecknar Herbivore resistensmekanismer: Spittlebugs på Brachiaria SPP. Som ett exempel

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

A Fluorescent Screening Assay for Identifying Modulators of GIRK Channels

En fluorescerande screeningsanalys för att identifiera modulatorer av GIRK kanaler

G protein-gated inward rectifier K+ (GIRK) channels function as cellular mediators of a wide range of hormones and neurotransmitters and are expressed in ...

RNA Secondary Structure Prediction Using High-throughput SHAPE

RNA förutsägelser av sekundär struktur med high-throughput SHAPE

Understanding the function of RNA involved in biological processes requires a thorough knowledge of RNA structure. Toward this end, the methodology dubbed ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Bedöma Murint Funktion Resistance Artery Använda Pressure Myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Hög kapacitet Screening för kemiska modulatorer av Post-transkription Reglerade Gener

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Avbildning Rumslig Reorganisation av ett MAPK-signalvägen Använda Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Comparison of Tobacco Host Cell Protein Removal Methods by Blanching Intact Plants or by Heat Treatment of Extracts

Jämförelse av tobak värdcell Protein borttagning metoder genom Blanche Intakta växter eller genom värmebehandling av extrakt

Plants not only provide food, feed and raw materials for humans, but have also been developed as an economical production system for biopharmaceutical ...