Name: measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria
Uploaded: 2022-01-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss fra Washington School of Medicine og Dr.M.T. Ryan fra La Trobe University for de oprindelige donationer af udtryksplasmider, der blev brugt til denne forskning. Dette arbejde blev støttet af midler fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) til D. A. Hood. D. A. Hood er også indehaver af en Canada Research Chair i Cell Fysiologi.

Alle dyr, der anvendes i disse forsøg, opretholdes i dyreplejefaciliteten på York University. Forsøgene udføres i overensstemmelse med canadian Council on Animal Care retningslinjer med godkendelse fra York University Animal Care Committee (Tilladelse: 2017-08).
1. Funktionel isolering af subsarcolemmal og intermyofibrillar mitokondrier fra skeletmuskulatur
<ol><li>Reagenspræparat:<ol>
<li>Forbered alle buffere og medier som nævnt i tabel 1.</li>
		<li>Indstil bufferne...

<ol>
	<li>Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reticulum+in+limb+skeletal+muscle.">Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle.</a> The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).</li><li>Glancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+grid+protection+of+the+muscle+mitochondrial+reticulum.">Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum.</a> Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).</li><li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+mapping+of+the+human+skeletal+muscle+mitochondrial+network.">Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network.</a> Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).</li><li>Ogata, T., Yamasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-resolution+scanning+electron+microscopy+of+mitochondria+and+sarcoplasmic+reticulum+arrangement+in+human+red,+white,+and+intermediate+muscle+fibers.">Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers.</a> Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).</li><li>Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+mechanisms+regulating+muscle+mitochondrial+biogenesis.">Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis.</a> Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).</li><li>Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).</li><li>Holloszy, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+in+muscle.">Biochemical adaptations in muscle.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).</li><li>Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+skeletal+muscle+mitochondria+from+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+isolated+regions.">Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions.</a> The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).</li><li>Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria+play+distinct+roles+in+regulating+skeletal+muscle+fatty+acid+metabolism.">Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).</li><li>Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+to+endurance+training+in+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria.">Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).</li><li>Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCarta2.0:+An+updated+inventory+of+mammalian+mitochondrial+proteins.">MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).</li><li>Backes, S., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+the+intermembrane+space+and+matrix+of+mitochondria:+mechanisms+and+driving+forces.">Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).</li><li>Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+import+machinery+of+mitochondria+-+A+regulatory+hub+in+metabolism,+stress,+and+disease.">The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).</li><li>Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+regulates+PINK1+import+and+proteolytic+destabilization+by+PARL.">Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+ATF5+mediates+a+mammalian+mitochondrial+UPR.">The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR.</a> Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).</li><li>Quiros, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+analysis+identifies+ATF4+as+a+key+regulator+of+the+mitochondrial+stress+response+in+mammals.">Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).</li><li>Takahashi, M., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+skeletal+muscle+mitochondria.+Differential+import+regulation+in+distinct+subcellular+regions.">Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).</li><li>Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+skeletal+muscle+mitochondria+in+health,+exercise,+and+aging.">Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging.</a> Annual Review of Physiology. 81, (2019).</li><li>Joseph, A., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion+plasticity+of+TOM+complex+assembly+in+skeletal+muscle+mitochondria+in+response+to+chronic+contractile+activity.">Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity.</a> Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).</li><li>Singh, K., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+denervation-induced+muscle+disuse+on+mitochondrial+protein+import.">Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+morphology+and+defective+protein+import+reveal+novel+roles+for+Bax+and/or+Bak+in+skeletal+muscle.">Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).</li><li>Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).</li><li>Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+efficiency+of+ATFS-1+regulates+mitochondrial+UPR+activation.">Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation.</a> Science. 337 (6094), 587-590 (2012).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: Isolation, structure and function.</a> Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+mitochondria+isolated+with+the+proteolytic+enzyme+nagarse+exhibit+greater+protein+specific+activities+and+functional+coupling.">Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).</li><li>S&#225;nchez-Duarte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicorandil+affects+mitochondrial+respiratory+chain+function+by+increasing+complex+III+activity+and+ROS+production+in+skeletal+muscle+mitochondria.">Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria.</a> Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).</li><li>I&#241;igo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-&#945;+in+female+skeletal+muscle+is+not+required+for+regulation+of+muscle+insulin+sensitivity+and+mitochondrial+regulation.">Estrogen receptor-&#945; in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation.</a> Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).</li><li>Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-specific+respiration+of+isolated+skeletal+muscle+mitochondria+after+1+h+of+moderate+cycling+in+sedentary+adults.">Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).</li><li>Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+activity-induced+adaptations+in+the+mitochondrial+protein+import+system.">Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system.</a> The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).</li><li>Kravic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+mammalian+skeletal+muscle,+phosphorylation+of+TOMM22+by+protein+kinase+CSNK2/CK2+controls+mitophagy.">In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy.</a> Autophagy. 8627, 01-65 (2017).</li><li>Opali&#324;ska, M., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+via+the+mitochondrial+protein+import+machinery.">Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery.</a> Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).</li><li>Gerbeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+regulation+of+protein+import+receptor+tom22+by+cytosolic+and+mitochondria-bound+kinases.">Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).</li></ol>

Mitokondrier er entydigt afhængige af udtryk og koordinering af både de nukleare og mitokondrie genomer for deres syntese og ekspansion i celler. Det nukleare genom koder imidlertid langt størstedelen (99%) af mitokondrieprotomet, og dette understreger proteinimportmaskinernes betydning for at støtte mitokondriebiogenese. Import fungerer også som en vigtig signalbegivenhed, da manglende import kan fremme indledningen af det udfoldede proteinrespons og / eller mitophagy15,16,26.<sup...

Mitokondrier er organeller, der findes i komplekse morfologier i forskellige celletyper og er anerkendt for at besidde et stigende udvalg af funktioner, der er afgørende for cellulær sundhed. Som sådan kan de ikke længere skæres ned til energiproducerende organeller. Mitokondrier er vigtige metaboliske regulatorer, determinanter for celle skæbne, og signalering hubs, hvis funktioner kan tjene som nyttige indikatorer for den samlede cellulære sundhed. I skeletmuskulaturceller afslører elektronmikroskopiundersøgelser tilstedeværelsen af geografisk forskellige subsarcolemmale (SS) og intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som udviser en grad af tilslutningsmuligheder1,2,3,4, der nu anerkendes at være meget dynamisk og tilpasningsdygtig til ændringer i skeletmuskulaturaktivitetsniveauer samt med alder og sygdom. Mitokondrie indhold og funktion i muskel kan vurderes på mange måder5,6, og traditionelle metoder til organelle isolation er blevet anvendt til bedre at forstå respiratoriske og enzymatiske kapaciteter (Vmax) af mitokondrier adskiller sig fra indflydelsen af cellu 7,8. Disse traditionelle metoder har navnlig afsløret subtile biokemiske sondringer mellem mitokondrier isoleret fra subsarcolemmale og intermyofibrillar regioner, belying mulige funktionelle konsekvenser for stofskiftet i disse subcellulære regioner8,9,10,11.
Biogenesen af mitokondrier er unik i at kræve bidrag fra genprodukter fra både nukleare og mitokondrie DNA. Langt de fleste af disse er imidlertid afledt af kernen, da mtDNA transskription kun fører til syntesen af 13 proteiner. Da mitokondrier normalt omfatter >1000 proteiner, der er involveret i forskellige metaboliske veje, kræver biogenese af organelle et stramt reguleret middel til import og samling af prækursorproteiner fra cytosolen i de forskellige mitokondrieunderrum for at opretholde korrekt stoichimetri og funktion12,13. Atomkodede proteiner bestemt til mitokondrier normalt bære en mitokondrie målretning sekvens (MTS), der er rettet mod dem til organelle og letter deres sub-opdeling lokalisering. De fleste matrix-bundne proteiner indeholder en kløvelig N-terminal MTS, mens de bestemt til den ydre eller indre mitokondriemembran normalt har interne målretning domæner14. Importprocessen udføres af et sæt forskellige kanaler, der giver flere muligheder for at komme ind i organelle13. Translocase af den ydre membran (TOM) komplekse shuttles forstadier fra cytosol ind i intermembrane rummet, hvor de er anerkendt af translocase af den indre membran (TIM) kompleks. Dette kompleks er ansvarlig for at importere atomkodede prækursorer til matrixen, hvor proteaser kløve N-terminalen rettet mod presequence. Proteiner bestemt til den ydre membran kan indsættes direkte i denne membran gennem TOM-komplekset, mens de, der er bestemt til den indre membran, indsættes af et TIM-protein, specielt TIM22. Efter deres import behandles proteiner yderligere af residente proteaser og chaperoner og kombineres ofte for at danne større komplekser, som dem, der findes i elektrontransportkæden.
Mitokondrieproteinimport i sig selv fungerer også som en måling af mitokondriesundhed, da denne proces er afhængig af tilstedeværelsen af membranpotentiale og en energikilde i form af ATP15. For eksempel, når membranpotentialet spredes, kan proteinkinaase PINK1 ikke tages op af organelle, og dette fører til fosforylationssignaler, der udløser begyndelsen af nedbrydningen af organelle gennem en vej kaldet mitophagy16,17. Under lignende omstændigheder, når importen hindres, kan proteinet ATF5 ikke komme ind i organelle, og det translokerer efterfølgende til kernen, hvor det tjener som transskription faktor for up-regulering af UPR genekspression18,19. Således kan måling af proteinimporteffektivitet give omfattende indsigt i organellens sundhed, mens genekspressionsvaret kan bruges til at angive graden af retrograd signalering til kernen.
På trods af sin åbenlyse betydning for biogenese af mitokondrier og for cellulær sundhed generelt er importvejen i pattedyr mitokondrier bemærkelsesværdigt understudiet. I denne rapport beskriver vi de specifikke trin, der er involveret i målingen af import af prækursorproteiner til skeletmuskulatur mitokondrier og giver data til at illustrere importsystemets adaptive reaktion på ændringer i muskler og disuse, hvilket illustrerer proteinimportens bidrag til skeletmuskulaturens adaptive plasticitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35S-methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td>Purchase requires a valid radioisotope permit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette for film</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>Kodak Xomatic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C298-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Drying Kit</td>
			<td>Sigma or BioRad</td>
			<td>Z377570-1PAK or OW-GDF-10</td>
			<td>Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>5350-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>T25 Digital Ultra Turrex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>POA301.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M7G</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>S1404S</td>
			<td>Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM4Z/hTom40 Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGMDH Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td>Can also be made with the ratio provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus Film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP MS 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit reticulocyte lysate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4960</td>
			<td>Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor for High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA-25.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001.500</td>
			<td>Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA 304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium salicylate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>106601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AccuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A322-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria

Mitokondrier er vigtige metaboliske og lovgivningsmæssige organeller, der bestemmer energiforsyningen samt cellens generelle sundhed. I skeletmuskulatur findes mitokondrier i en række komplekse morfologier, der spænder fra små ovale organeller til et bredt, reticulum-lignende netværk. At forstå, hvordan mitokondrie reticulum udvider sig og udvikler sig som reaktion på forskellige stimuli som ændringer i energiefterspørgslen, har længe været et forskningsemne. Et centralt aspekt af denne vækst, eller biogenese, er import af prækursor proteiner, oprindeligt kodet af det nukleare genom, syntetiseret i cytosol, og translokeret i forskellige mitokondrie sub-rum. Mitokondrier har udviklet en sofistikeret mekanisme til denne importproces, der involverer mange selektive indre og ydre membrankanaler, kendt som proteinimportmaskineriet (PIM). Import til mitokondrie er afhængig af levedygtige membran potentiale og tilgængeligheden af organelle-afledte ATP gennem oxidativ fosforylering. Derfor kan dens måling tjene som et mål for organelle sundhed. PIM udviser også et højt niveau af adaptiv plasticitet i skeletmuskulaturen, der er tæt koblet til cellens energistatus. For eksempel har træningstræning vist sig at øge importkapaciteten, mens muskelbrug reducerer det, sammenfaldende med ændringer i markører for mitokondrieindhold. Selvom proteinimport er et kritisk skridt i biogenese og udvidelse af mitokondrier, undersøges processen ikke bredt i skeletmuskulaturen. Således skitserer dette papir, hvordan man bruger isolerede og fuldt funktionelle mitokondrier fra skeletmuskulatur til at måle proteinimportkapacitet for at fremme en større forståelse af de involverede metoder og en forståelse af betydningen af vejen for organelleomsætning i motion, sundhed og sygdom.

Vi har udførligt illustreret, at denne protokol er en gyldig analyse til bestemmelse af importhastigheden til funktionelle og intakte isolerede skeletmuskulatur mitokondrier. Sammenlignet med ubehandlede tilstande er importen af typiske prækursorproteiner som malat dehydrogenase (MDH) i matrixen følsom over for membranpotentiale, fordi det kan hæmmes af valinomycin, en respiratorisk kæde uncoupler (Figur 2A). Import hæmmes også, når mitokondrie indre og ydre membrane...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria at JoVE.com

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitokondrier er vigtige metaboliske organeller, der udviser et højt niveau af fænotypisk plasticitet i skeletmuskulaturen. Import af proteiner fra cytosolen er en kritisk vej for organellebiogenese, der er afgørende for udvidelsen af reticulum og vedligeholdelse af mitokondriefunktion. Derfor tjener proteinimport som et barometer for cellulær sundhed.

Måling af proteinimportkapacitet af skeletmuskulatur mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Mitokondrier er stærkt afhængige af det nukleare genom, på trods af at de har deres eget DNA. Der er således behov for en stærkt reguleret importmekanisme. Denne metode hjælper med at studere processen, og hvordan den kan tilpasse sig eksterne stimuli.Dette er den eneste biokemiske teknik, der er tilgængelig til kvantitativt at evaluere proteinimport til de forskellige underrum i mitokondrier. Mitokondriers levedygtighed er impliceret i forskellige sygdomstilstande, så forståelse af, hvordan proteinimport reguleres, kan bidrage til nye terapeutiske tilgange, der er rettet mod mitokondrier. Ekstra pleje er påkrævet under isolationen for at sikre mitokondrierens levedygtighed og integritet.Grundig hakken af vævet og forsigtigt genoplivning af alle efterfølgende pellets er nødvendig. Ashley Oliveira, ph.d.-studerende i mit laboratorium, demonstrerer proceduren. For at begynde isolering af mitokondrier fra skeletmuskulaturen skal du fjerne fedt og bindevæv fra musklerne og hakke vævene på et forkølet urglas, indtil det er en homogen gylle.Placer hakket væv i en pre-kølet 50-milliliter plast centrifugering rør og registrere den nøjagtige vægt. Fortynd derefter det hakkede væv tidoblet med buffer 1 indeholdende ATP. Brug en otte millimeter twin-blade homogenisator til at homogenisere muskelprøven ved en effekt på 9,8 Hertz i 10 sekunder, hvilket sikrer ingen synlige bidder af muskler tilbage.Efter at have drejet prøven ved 9.000x G i 10 minutter ved fire grader Celsius, genbruges pellet omhyggeligt i ca. 95 mikroliter af resuspensionsmediet. Prøven centrifugeres, inden supernatanten kasseres, og bærd forsigtigt pelleten med ca. 180 mikroliter resuspension medium ved hjælp af en P-200 pipette. For in vitro oversættelse, forberede nok oversættelse reaktion mix til at levere 20 mikroliter pr prøve af mitokondrier, der skal anvendes i import eksperiment og for en oversættelse lane.Placer reaktionen til inkubation ved 30 grader Celsius i 30 minutter. 15 minutter efter starten af oversættelsesreaktionen, aliquot 90 mikrogram mitokondrier i sterile 1,5 milliliter rør og præ-inkubere ved 30 grader Celsius i 10 minutter. I et frisk sæt sterile 1,5 milliliterrør kombineres 75 mikrogram mitokondrier med 18 mikroliter af oversættelsesreaktionen og inkuberer røret ved 30 grader Celsius i den ønskede tid.Hold det resterende bind af oversættelsesreaktionen på is. For at afslutte importreaktionen efter den passende inkubationstid skal du fjerne røret fra 30 grader Celsius for at placere det på is og derefter forsigtigt overføre importreaktion oven på røret med saccharosepuden. Centrifuge prøverne med saccharose pude på 17,000x G i 15 minutter ved fire grader Celsius.Brug en P-1000 pipette, fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre pellet. For at importere til den ydre membran skal du udføre reaktionen ved hjælp af Tom40 og genbruge pelleten i 50 mikroliter af frisklavet 0,1 molar natriumcarbonat og inkubere på is i 30 minutter. Efter inkubationen centrifugere prøven ved 14.000x G i fem minutter ved fire grader Celsius.Derefter forberede prøverne til SDS-PAGE elektroforese som beskrevet i manuskriptet. Forbered kontroloversættelsesbanen ved at blande tre mikroliter af den resterende oversættelsesreaktion med 37 mikroliter lysisbuffer og fem mikroliter af prøvefarve. Kog prøverne i fem minutter ved 95 grader Celsius og drej forsigtigt ned ved lav hastighed for at undgå pelleting mitokondrier.Efter påføring af prøver på SDS polyacrylamidgel koges gelen i 5% trichloreddikesyre eller TCA i en røghætte i fem minutter med kontinuerlig omrøring. Derefter placeres gelen i dobbeltdestilleret vand på en roterende plade i et minut ved 50 rotationer i minuttet. Vask gelen i 10-millimolar Tris på en roterende plade i fem minutter ved 50 rotationer i minuttet.For at bundfælde proteinet skal gelen vaskes i nok volumen af en molar salicytisk syre til at dække gelen på en roterende plade i 30 minutter. For at dehydrere gelen skal du placere et stort ark blottingpapir ned på geltørrerens porøse seng og et ark papirhåndklæde i det område, hvor gelen vil blive påført. Skær derefter 11 centimeter med 9 centimeter stykke blotting papir og læg papiret på papirhåndklædet.Brug et andet stykke på 11 centimeter med 9 centimeter blotting papir til at scoop ud gelen fra beholderen og lægge gelen ned fladt oven på det første stykke. Placer et lidt større stykke plastik ned på gelen, hvilket sikrer ingen folder eller bobler under wrap. Læg derefter plastdækslet af geltørreren over toppen af wrap.Tænd for vakuumet. Sørg for, at plastdækslet har dannet en forsegling ved at løfte hjørnet af plastdækslet og vente på, at dækslet forsegles igen. Luk geltørreren for at køre i 90 minutter, startende ved 30 grader Celsius for at nå 80 grader Celsius gradvist og vende tilbage til 30 grader Celsius i slutningen af løbet.Wrap gelen i plastfolie, der anvendes i tørringsprocessen. Når den er dehydreret, vil gelen størkne og føles papirtynde. Placer den dehydrerede gel i en kassette med en fosforfilm ovenpå.Udsæt filmen i 24 timer, før du visualiserer gelen ved hjælp af autoradiografi med en passende billeddannelse, der er i stand til fosforbilleddannelse. Den repræsentative analyse viser de normale importrater for malate dehydrogenase, eller MDH, i subsarcolemmal og intermyofibrillar mitokondrier, og oversættelse produkt af prækursor MDH. Tilsætning af valinomycin hæmmet MDH protein import i matrix af SS og IMF mitokondrier.På samme måde hæmmede vaskemiddel Triton X MDH-import i begge delfraktioner på grund af opløselighed af den indre membran. Vurderingen af proteinimporten blev udført i stigende tid, og de deraf følgende data viste, at import er en tidsafhængig proces, og SS og IMF mitokondrier har forskellige satser eller kapacitet til import. Når rotter blev udsat for elektrisk stimulation, Tom 40 import i den ydre membran var højere i muskler fra kronisk stimuleret dyr i forhold til kontrol.Ornithine transcarbamylase, eller OLT import, i mitokondrie matrix blev øget på hvert tidspunkt af inkubation, hvilket resulterer i en 1,4-fold stigning i mitokondrier fra kronisk stimuleret muskel. Proteinimporten var positivt korreleret med et indeks over mitokondrieindhold og vurderet af COX's aktivitet. I undersøgelsen mitokondrie-medieret apoptose, Bax og Bak dobbelt-knockout dyr udstillet reduceret protein import i mitokondrie matrix.Seks ugers frivillig hjulkørsel reddede importfejlen hos dobbelt-knockout dyr. Det er vigtigt at overveje variabler såsom varigheden af importreaktionen, og hvilket protein der skal importeres. Cytosolic fraktioner kan indarbejdes i reaktionen for at forstå, hvordan cytosolic faktorer kan påvirke importhastigheden.Alternativt kan proteiner ændres før inkubation for at forstå, hvordan proteiner kan importeres selektivt. Denne teknik kan hjælpe med at forstå de komplekse ætiologier af mitokondrie myopatier, der kan præsentere i forskellige sygdomstilstande.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaseret metode til fremstilling af højkvalitetsnuclei fra tværbundet skeletsmuskel til chromatinimmunpræcipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Forbedret protokol for kromatin Immunoprecipitation fra mus skeletmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser af mitokondrie Calcium tilstrømning i isolerede mitochondrier og kulturperler celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Oprettelse af meget specifikke kemisk induceret protein Dimerization systemer ved trinvis Phage udvælgelse af en kombinatorisk enkelt domæne antistof bibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantificering af subcellulær glykogenfordeling i skeletmuskelfibre ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...