Name: measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria
Uploaded: 2022-01-07T12:30:00
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著者らは、マギル大学のG.Cショア博士、ワシントン医学部のA.シュトラウス博士、ラ・トローブ大学の.M T.ライアン博士に対し、この研究に使用された発現プラスミドの当初の寄付に感謝したいと考えています。この研究は、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)からD.A.フッドへの資金提供によって支えられた。D. A. フッドは、細胞生理学のカナダ研究委員長の保有者でもあります。

これらの実験で使用されるすべての動物は、ヨーク大学の動物ケア施設で維持されています。実験は、ヨーク大学動物ケア委員会(許可:2017-08)の承認を得て、カナダ動物ケア評議会のガイドラインに従って行われます。
1. 骨格筋からのサブサルコレムとミトコンドリア間の機能的分離
<ol><li>試薬の準備:<ol>
<li>表 1 に示すように、すべてのバッファーとメデ?...

<ol>
	<li>Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reticulum+in+limb+skeletal+muscle.">Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle.</a> The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).</li><li>Glancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+grid+protection+of+the+muscle+mitochondrial+reticulum.">Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum.</a> Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).</li><li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+mapping+of+the+human+skeletal+muscle+mitochondrial+network.">Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network.</a> Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).</li><li>Ogata, T., Yamasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-resolution+scanning+electron+microscopy+of+mitochondria+and+sarcoplasmic+reticulum+arrangement+in+human+red,+white,+and+intermediate+muscle+fibers.">Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers.</a> Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).</li><li>Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+mechanisms+regulating+muscle+mitochondrial+biogenesis.">Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis.</a> Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).</li><li>Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).</li><li>Holloszy, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+in+muscle.">Biochemical adaptations in muscle.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).</li><li>Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+skeletal+muscle+mitochondria+from+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+isolated+regions.">Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions.</a> The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).</li><li>Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria+play+distinct+roles+in+regulating+skeletal+muscle+fatty+acid+metabolism.">Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).</li><li>Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+to+endurance+training+in+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria.">Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).</li><li>Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCarta2.0:+An+updated+inventory+of+mammalian+mitochondrial+proteins.">MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).</li><li>Backes, S., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+the+intermembrane+space+and+matrix+of+mitochondria:+mechanisms+and+driving+forces.">Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).</li><li>Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+import+machinery+of+mitochondria+-+A+regulatory+hub+in+metabolism,+stress,+and+disease.">The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).</li><li>Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+regulates+PINK1+import+and+proteolytic+destabilization+by+PARL.">Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+skeletal+muscle+mitochondria.+Differential+import+regulation+in+distinct+subcellular+regions.">Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).</li><li>Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+skeletal+muscle+mitochondria+in+health,+exercise,+and+aging.">Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging.</a> Annual Review of Physiology. 81, (2019).</li><li>Joseph, A., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion+plasticity+of+TOM+complex+assembly+in+skeletal+muscle+mitochondria+in+response+to+chronic+contractile+activity.">Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity.</a> Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).</li><li>Singh, K., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+denervation-induced+muscle+disuse+on+mitochondrial+protein+import.">Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+morphology+and+defective+protein+import+reveal+novel+roles+for+Bax+and/or+Bak+in+skeletal+muscle.">Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).</li><li>Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).</li><li>Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+efficiency+of+ATFS-1+regulates+mitochondrial+UPR+activation.">Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation.</a> Science. 337 (6094), 587-590 (2012).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: Isolation, structure and function.</a> Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+mitochondria+isolated+with+the+proteolytic+enzyme+nagarse+exhibit+greater+protein+specific+activities+and+functional+coupling.">Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).</li><li>S&#225;nchez-Duarte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicorandil+affects+mitochondrial+respiratory+chain+function+by+increasing+complex+III+activity+and+ROS+production+in+skeletal+muscle+mitochondria.">Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria.</a> Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).</li><li>I&#241;igo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-&#945;+in+female+skeletal+muscle+is+not+required+for+regulation+of+muscle+insulin+sensitivity+and+mitochondrial+regulation.">Estrogen receptor-&#945; in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation.</a> Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).</li><li>Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-specific+respiration+of+isolated+skeletal+muscle+mitochondria+after+1+h+of+moderate+cycling+in+sedentary+adults.">Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).</li><li>Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+activity-induced+adaptations+in+the+mitochondrial+protein+import+system.">Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system.</a> The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).</li><li>Kravic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+mammalian+skeletal+muscle,+phosphorylation+of+TOMM22+by+protein+kinase+CSNK2/CK2+controls+mitophagy.">In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy.</a> Autophagy. 8627, 01-65 (2017).</li><li>Opali&#324;ska, M., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+via+the+mitochondrial+protein+import+machinery.">Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery.</a> Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).</li><li>Gerbeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+regulation+of+protein+import+receptor+tom22+by+cytosolic+and+mitochondria-bound+kinases.">Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).</li></ol>

ミトコンドリアは、核ゲノムとミトコンドリアゲノムの両方の発現と協調性に依存し、細胞内での合成と拡張に対して独自に依存しています。しかし、核ゲノムはミトコンドリアプロテオームの大部分(99%)をコードしており、ミトコンドリア生物新生をサポートするタンパク質輸入機械の重要性を強調しています。インポートは、インポートの失敗が展開されたタンパク質応答および/またはm...

ミトコンドリアは、異なる細胞型の複雑な形態に存在するオルガネラであり、細胞の健康に不可欠な機能の増加配列を有すると認識されている。したがって、彼らはもはやエネルギーを生み出すオルガネラに打ちのめすることはできません。ミトコンドリアは、主要な代謝調節因子であり、細胞運命の決定因子であり、シグナルハブであり、その機能は全体的な細胞の健康の有用な指標として役立つ可能性がある。骨格筋細胞では、電子顕微鏡検査研究は、地理的に異なる皮質下(SS)およびミトコンドリア間(IMF)ミトコンドリアの存在を明らかにし、現在は非常にダイナミックで、骨格筋活動レベルの変化に適応可能であると認識されている。ミトコンドリアの筋肉の含有量および機能は、多くの方法で評価することができます5,6、および細胞milieu7,8の影響とは異なるミトコンドリアの呼吸および酵素能力(Vmax)をよりよく理解するためにオルガネラ分離の伝統的な方法が適用されています。特に、これらの伝統的な方法は、サブサルコレム領域とミノフィブリラー領域から単離されたミトコンドリアの微妙な生化学的区別を明らかにし、これらの細胞下領域における代謝に対する機能的な影響の可能性を示唆している8,9,10,11。
ミトコンドリアの生物形成は、核およびミトコンドリアDNAの両方からの遺伝子産物の寄与を必要とする唯一の特徴である。しかし、mtDNAの転写は13個のタンパク質の合成につながるだけなので、これらの大部分は核に由来しています。ミトコンドリアは通常、多様な代謝経路に関与する>1000タンパク質を含むため、オルガネラの生物形成は、適切な化学測定および機能を維持するために、細胞質ゾルから様々なミトコンドリアサブコンパートメントへの前駆体タンパク質の輸入および組み立ての厳重に調節された手段を必要とする12,13。ミトコンドリアに向かう核コード化タンパク質は、通常、ミトコンドリアターゲティング配列(MTS)を運び、それらを標的とし、そのサブ区画局在化を促進する。ほとんどのマトリックス結合タンパク質はクレアブルN末端MTSを含み、外側または内側のミトコンドリア膜に向かうタンパク質は通常、内部標的ドメイン14を有する。インポートプロセスは、オルガネル13に入るための複数の道を提供する多様なチャネルのセットによって行われます。外膜(TOM)のトランスロケースは、細胞質ゾルから膜間空間に前駆体をシャトルし、そこで内膜(TIM)複合体のトランスロケースによって認識される。この複合体は、核コード化された前駆体をマトリックスにインポートし、プロテアーゼがN末端ターゲティング前配列を切断する役割を担う。外膜に向かうタンパク質は、TOM複合体を介してこの膜に直接挿入することができ、内膜に向かうタンパク質はTIMタンパク質、特にTIM22によって挿入される。タンパク質は、インポート後に、共存プロテアーゼとシャペロンによってさらに処理され、しばしば結合して電子輸送鎖に見られるようなより大きな複合体を形成します。
ミトコンドリアタンパク質のインポート自体は、このプロセスは、膜電位とATP15の形でエネルギー源の存在に依存しているので、ミトコンドリアの健康の測定としても機能します。例えば、膜電位が消滅すると、プロテインキナーゼPINK1はオルガネラによって取り込むことができず、これはmitophagy16,17と呼ばれる経路を介して小器官の分解の発症を引き起こすリン酸化シグナルにつながります。同様の状況下では、インポートが妨げられると、タンパク質ATF5はオルガネラに入ることができず、その後核に移り変え、UPR遺伝子発現のアップレギュレーションの転写因子として機能します18,19。したがって、タンパク質のインポート効率を測定することで、オルガネラの健康に関する包括的な洞察を提供することができ、一方、遺伝子発現応答は、核への逆行シグナル伝達の程度を示すために使用することができる。
ミトコンドリアの生物形成と一般的な細胞の健康にとって明らかな重要性にもかかわらず、哺乳類ミトコンドリアの輸入経路は著しく研究されている。本報告では、骨格筋ミトコンドリアへの前駆体タンパク質のインポート測定に関わる具体的なステップを説明し、筋肉や使用の変化に対する輸入系の適応応答を示すデータを提供し、骨格筋の適応可塑性に対するタンパク質のインポートの寄与を示す。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35S-methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td>Purchase requires a valid radioisotope permit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette for film</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>Kodak Xomatic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C298-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Drying Kit</td>
			<td>Sigma or BioRad</td>
			<td>Z377570-1PAK or OW-GDF-10</td>
			<td>Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>5350-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>T25 Digital Ultra Turrex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>POA301.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M7G</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>S1404S</td>
			<td>Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM4Z/hTom40 Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGMDH Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td>Can also be made with the ratio provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus Film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP MS 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit reticulocyte lysate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4960</td>
			<td>Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor for High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA-25.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001.500</td>
			<td>Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA 304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium salicylate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>106601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AccuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A322-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria

ミトコンドリアは、細胞の全体的な健康と同様にエネルギー供給を決定する主要な代謝および調節オルガネラである。骨格筋では、ミトコンドリアは、小さな楕円形のオルガネラから広いレチクルムのようなネットワークに至るまで、一連の複雑な形態に存在する。 ミトコンドリアレチクルムがエネルギー需要の変化などの多様な刺激に対応してどのように拡大し発展するかを理解することは、長い間研究のトピックとなっています。 この成長の重要な側面、または生物形成は、核ゲノムによって元々コードされた前駆体タンパク質の輸入であり、サイトゾルで合成され、様々なミトコンドリアサブコンパートメントに転位する。ミトコンドリアは、タンパク質輸入機械(PIM)として知られている多くの選択的な内膜および外膜チャネルを含む、この輸入プロセスのための洗練されたメカニズムを開発しました。ミトコンドリアへの輸入は、酸化リン酸化による生存可能な膜電位およびオルガネラ由来ATPの利用可能性に依存する。したがって、その測定はオルガネラの健康の尺度として役立ちます。PIMはまた細胞のエネルギー状態に密接に結合される骨格筋の適応可塑性の高レベルを示す。 例えば, 運動訓練は、輸入能力を高めるために示されています, 筋肉の使用が減少しながら, ミトコンドリアの含有量のマーカーの変化と一致.タンパク質のインポートは、ミトコンドリアの生物形成と拡張の重要なステップであるが、このプロセスは骨格筋で広く研究されていません。 本稿では、骨格筋から孤立した完全機能ミトコンドリアを使用してタンパク質の輸入能力を測定し、運動、健康、疾患におけるオルガネラターンオーバー経路の重要性をより深く理解する方法を概説する。

我々は、このプロトコルが機能的で無傷の骨格筋ミトコンドリアへの輸入率を決定するための有効なアッセイであることを広く示している。未処置の状態と比較して、マレートデヒドロゲナーゼ(MDH)などの典型的な前駆体タンパク質をマトリックスにインポートすると、気相鎖アンカプラであるバリノマイシンによって阻害され得るため、膜電位に敏感である (図2A</strong...

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Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

ミトコンドリアは、骨格筋の表皮形成性の高いレベルを示す重要な代謝小器官です。細胞質ゾルからのタンパク質のインポートは、レチクルムの拡張とミトコンドリア機能の維持に不可欠なオルガネラ生物形成のための重要な経路です。 したがって、タンパク質のインポートは、細胞の健康のバロメーターとして機能します。

骨格筋ミトコンドリアのタンパク質輸入能の測定

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

ミトコンドリアは、独自のDNAを持っているにもかかわらず、核ゲノムに大きく依存しています。したがって、高度に規制された輸入メカニズムが必要です。この方法は、プロセスを研究し、それが外部刺激にどのように適応することができるかを研究するのに役立ちます。これは、ミトコンドリアの様々なサブコンパートメントへのタンパク質の輸入を定量的に評価するために利用可能な唯一の生化学的技術です。ミトコンドリアの生存率は様々な疾患状態に関係しているため、タンパク質の輸入がどのように調節されているかを理解することは、ミトコンドリアを標的とする新しい治療アプローチに寄与する可能性がある。ミトコンドリアの生存率と完全性を確保するために、分離中に特別な注意が必要です。組織を徹底的に細かく切り、その後のすべてのペレットを穏やかに再懸濁させる必要があります。この手順をデモンストレーションすることは、私の研究室の博士課程の学生であるアシュリー・オリベイラです。骨格筋からミトコンドリアを分離するには、筋肉から脂肪と結合組織を取り除き、均質なスラリーになるまで冷やされた時計ガラスの組織をミンチします。細切り組織を冷やした50ミリリットルのプラスチック遠心チューブに入れ、正確な重量を記録します。次いで、ATPを含む緩衝液1で細かく組織を10倍に希釈する。8ミリメートルの双刃ホモジナイザーを使用して、9.8ヘルツの出力で筋肉サンプルを10秒間均質化し、筋肉の目に見える塊が残らないようにします。9,000x Gで試料を摂氏4度で10分間回転させた後、ペレットを約95マイクロリットルの再懸濁液培地中に慎重に再懸濁する。上清を捨てる前にサンプルを遠心分離し、P-200ピペットを用いて約180マイクロリットルの再懸濁液を用いてペレットを穏やかに再懸濁した。in vitro翻訳では、ミトコンドリアのサンプルあたり20マイクロリットルを供給し、インポート実験や翻訳レーンに使用するのに十分な翻訳反応ミックスを準備します。インキュベーションの反応を摂氏30度で30分間置きます。翻訳反応開始から15分後、90マイクログラムのミトコンドリアを無菌1.5ミリリットルチューブにアリコートし、摂氏30度で10分間予めインキュベートする。無菌1.5ミリリットルチューブの新鮮なセットでは、ミトコンドリアの75マイクログラムと18マイクロリットルの翻訳反応を組み合わせ、所望の時間のために摂氏30度でチューブをインキュベートします。翻訳反応の残量を氷の上に保管してください。適切なインキュベーション時間後にインポート反応を終了するには、30°Cからチューブを取り出して氷の上に置き、スクロースクッションでチューブの上に慎重に輸入反応を移します。スクロースクッションを17,000x Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。P-1000ピペットを使用して、ペレットを邪魔することなく上清を慎重に除去します。外膜にインポートするには、Tom40に使用して反応を行い、調製したての0.1モル炭酸ナトリウムの50マイクロリットルでペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、摂氏4度で5分間14,000xGでサンプルを遠心分離する。次に、原稿に記載されているとおりにSDS-PAGE電気泳動用のサンプルを調製する。残りの翻訳反応の3マイクロリットルを37マイクロリットルのリシスバッファーと5マイクロリットルのサンプル色素と混合して、制御翻訳レーンを準備します。サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させ、ミトコンドリアをペレット化しないように低速で軽く回転させます。サンプルをSDSポリアクリルアミドゲルに塗布した後、5%トリクロロ酢酸(TCA)でヒュームフードでゲルを沸騰させ、連続撹拌しながら5分間煮ます。次に、ゲルを回転板の上に2倍蒸留水に入れ、毎分50回転で1分間置きます。回転板の10ミリモルトリスでゲルを毎分50回転で5分間洗います。タンパク質を沈殿させるには、ゲルを回転板で30分間覆うのに十分な量の1モルサリシン酸でゲルを洗います。ゲルを脱水するには、ゲルドライヤーの多孔質ベッドに大きなブロッティングペーパーを置き、ゲルを塗布する領域にペーパータオルを1枚置きます。その後、11センチを9センチのブロッティング紙で切り、ペーパータオルの上に置きます。11センチメートル×9センチメートルのブロッティング紙の2番目の部分を使用して、容器からゲルをすくい取り、ゲルを最初の部分の上に平らに置きます。少し大きなプラスチックをゲルの上に置き、ラップの下に折り目や泡を入れないようにします。次に、ゲルドライヤーのプラスチックカバーをラップの上に置きます。真空をオンにします。プラスチックカバーの角を持ち上げ、カバーが再シールするのを待つことにより、プラスチックカバーがシールを形成していることを確認します。ゲルドライヤーを閉じて90分間、摂氏30度から徐々に摂氏80度に達し、ラン終了時に摂氏30度に戻ります。乾燥工程で使用したラップでゲルを包みます。脱水するとゲルが固まり、紙が薄く感じるようにします。脱水ゲルを上にリンフィルムを付けたカセットに入れる。リンイメージングが可能な任意の適切なイメージャーでオートラジオグラフィーを使用してゲルを可視化する前に、24時間フィルムを露出させます。代表的な分析は、サブサルコレムおよびミトコンドリアのマレートデヒドロゲナーゼ(MDH)の正常な輸入速度と前駆体MDHの翻訳産物を示す。バリノマイシンの添加は、SSおよびIMFミトコンドリアのマトリックスへのMDHタンパク質のインポートを阻害した。同様に、洗浄剤Triton Xは、内膜の可溶化のために両方のサブ画分へのMDH輸入を阻害した。タンパク質のインポートの推定は、時間の持続時間の増加のために行われ、その結果のデータは、インポートは時間依存のプロセスであり、SSとIMFミトコンドリアは、インポートのための異なるレートまたは容量を持っていることを示しました。ラットが電気刺激を受けたとき、Tom 40は、コントロールと比較して慢性的に刺激された動物からの筋肉中に外膜にインポートした。オルニチントランスカルバミラーゼ、またはOCTインポートは、ミトコンドリアマトリックスへのインキュベーションの各時点で増加し、慢性的に刺激された筋肉からのミトコンドリアの1.4倍の増加をもたらした。タンパク質のインポートは、ミトコンドリア含有量の指標と正の相関を持ち、COX活性によって評価された。ミトコンドリア介在アポトーシスの調査において、BaxとBakダブルノックアウト動物はミトコンドリアマトリックスへのタンパク質輸入を減少させた。6週間の自主的な車輪の走行は、二重ノックアウト動物の輸入欠陥を救出しました。インポート反応の持続時間やインポートするタンパク質などの変数を考慮することが重要です。細胞種分画は、細胞細胞の要因が輸入速度に影響を与える可能性を理解するために反応に組み込むことができます。あるいは、タンパク質が選択的にインポートされる方法を理解するために、インキュベーションの前にタンパク質を改変してもよい。この技術は、様々な疾患状態で存在し得るミトコンドリアミオパチーの複雑な病因を理解するのに役立つ。

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A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

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分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

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Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

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High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

タンパク質の折り畳み、トランスポート、および放射性パルス追跡による生体細胞の劣化の解析

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Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

アミロイドフィブリルスによる脳ミトコンドリアの相互作用と膜透過性

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Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

組み合わせ単一ドメイン抗体ライブラリーの段階的ファージ選択による高特異的化学的誘起タンパク質二量体化システムの作成

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

透過型電子顕微鏡による骨格筋線維の細胞内グリコーゲン分布の定量化

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...