Name: measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria
Uploaded: 2022-01-07T12:30:00
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저자는 맥길 대학의 박사 G.C 쇼어, 워싱턴 의과 대학의 A. 스트라우스 박사, 그리고 라 트로브 대학의 박사.M.T. 라이언이 이 연구에 사용 된 표현 플라스미드의 원래 기부에 감사드립니다. 이 작품은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC)에서 D. A. Hood에 대한 자금 지원을 받았습니다. D. A. 후드는 또한 세포 생리학에 있는 캐나다 연구 의자의 홀더입니다.

이 실험에 사용된 모든 동물은 요크 대학의 동물 보호 시설에서 유지됩니다. 실험은 요크 대학 동물 관리 위원회의 승인을 받아 캐나다 동물 관리 위원회 지침에 따라 수행됩니다 (허가: 2017-08).
1. 골격 근육에서 서브사콜렘말과 내미오피릴라 미토콘드리아의 기능적 격리
<ol><li>시약 준비:<ol>
<li>표 1에 언급된 모든 버퍼와 미디어를 준비합니다.</li>
		<li>버퍼를 pH...

<ol>
	<li>Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reticulum+in+limb+skeletal+muscle.">Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle.</a> The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).</li><li>Glancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+grid+protection+of+the+muscle+mitochondrial+reticulum.">Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum.</a> Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).</li><li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+mapping+of+the+human+skeletal+muscle+mitochondrial+network.">Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network.</a> Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).</li><li>Ogata, T., Yamasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-resolution+scanning+electron+microscopy+of+mitochondria+and+sarcoplasmic+reticulum+arrangement+in+human+red,+white,+and+intermediate+muscle+fibers.">Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers.</a> Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).</li><li>Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+mechanisms+regulating+muscle+mitochondrial+biogenesis.">Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis.</a> Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).</li><li>Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).</li><li>Holloszy, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+in+muscle.">Biochemical adaptations in muscle.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).</li><li>Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+skeletal+muscle+mitochondria+from+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+isolated+regions.">Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions.</a> The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).</li><li>Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria+play+distinct+roles+in+regulating+skeletal+muscle+fatty+acid+metabolism.">Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).</li><li>Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+to+endurance+training+in+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria.">Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).</li><li>Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCarta2.0:+An+updated+inventory+of+mammalian+mitochondrial+proteins.">MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).</li><li>Backes, S., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+the+intermembrane+space+and+matrix+of+mitochondria:+mechanisms+and+driving+forces.">Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).</li><li>Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+import+machinery+of+mitochondria+-+A+regulatory+hub+in+metabolism,+stress,+and+disease.">The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).</li><li>Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+regulates+PINK1+import+and+proteolytic+destabilization+by+PARL.">Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+ATF5+mediates+a+mammalian+mitochondrial+UPR.">The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR.</a> Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).</li><li>Quiros, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+analysis+identifies+ATF4+as+a+key+regulator+of+the+mitochondrial+stress+response+in+mammals.">Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).</li><li>Takahashi, M., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+skeletal+muscle+mitochondria.+Differential+import+regulation+in+distinct+subcellular+regions.">Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).</li><li>Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+skeletal+muscle+mitochondria+in+health,+exercise,+and+aging.">Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging.</a> Annual Review of Physiology. 81, (2019).</li><li>Joseph, A., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion+plasticity+of+TOM+complex+assembly+in+skeletal+muscle+mitochondria+in+response+to+chronic+contractile+activity.">Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity.</a> Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).</li><li>Singh, K., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+denervation-induced+muscle+disuse+on+mitochondrial+protein+import.">Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+morphology+and+defective+protein+import+reveal+novel+roles+for+Bax+and/or+Bak+in+skeletal+muscle.">Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).</li><li>Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).</li><li>Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+efficiency+of+ATFS-1+regulates+mitochondrial+UPR+activation.">Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation.</a> Science. 337 (6094), 587-590 (2012).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: Isolation, structure and function.</a> Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+mitochondria+isolated+with+the+proteolytic+enzyme+nagarse+exhibit+greater+protein+specific+activities+and+functional+coupling.">Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).</li><li>S&#225;nchez-Duarte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicorandil+affects+mitochondrial+respiratory+chain+function+by+increasing+complex+III+activity+and+ROS+production+in+skeletal+muscle+mitochondria.">Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria.</a> Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).</li><li>I&#241;igo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-&#945;+in+female+skeletal+muscle+is+not+required+for+regulation+of+muscle+insulin+sensitivity+and+mitochondrial+regulation.">Estrogen receptor-&#945; in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation.</a> Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).</li><li>Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-specific+respiration+of+isolated+skeletal+muscle+mitochondria+after+1+h+of+moderate+cycling+in+sedentary+adults.">Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).</li><li>Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+activity-induced+adaptations+in+the+mitochondrial+protein+import+system.">Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system.</a> The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).</li><li>Kravic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+mammalian+skeletal+muscle,+phosphorylation+of+TOMM22+by+protein+kinase+CSNK2/CK2+controls+mitophagy.">In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy.</a> Autophagy. 8627, 01-65 (2017).</li><li>Opali&#324;ska, M., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+via+the+mitochondrial+protein+import+machinery.">Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery.</a> Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).</li><li>Gerbeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+regulation+of+protein+import+receptor+tom22+by+cytosolic+and+mitochondria-bound+kinases.">Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).</li></ol>

미토콘드리아는 세포 내의 합성 및 확장을 위해 핵과 미토콘드리아 게놈의 발현과 조정에 유일히 의존한다. 그러나, 핵게놈은 미토콘드리아 프로테아메의 대다수(99%)를 인코딩하고, 이것은 미토콘드리아 생물 발생을 지원하는 단백질 수입 기계류의 중요성을 강조한다. 수입은 또한 수입 실패가 전개된 단백질 반응 및/또는 mitophagy15,16,26의 개시를 촉진할 수 있기 때문에 중요한<s...

미토콘드리아는 다른 세포 모형에 있는 복잡한 형태학에 존재하는 세포기관이고 세포 건강에 중요한 기능의 증가 배열을 가지고 있는 것을 인식됩니다. 따라서, 그들은 더 이상 단지 에너지 생산 세포기관에 휘청해질 수 없습니다. 미토콘드리아는 주요 신진 대사 조절제, 세포 운명의 결정요인 및 신호 허브이며, 그 기능은 전반적인 세포 건강의 유용한 지표로 작용할 수 있습니다. 골격 근육 세포에서 전자 현미경 연구는 지리적으로 구별되는 subsarcolemmal (SS) 및 intermyofibrillar (IMF) 미토콘드리아의 존재를 밝혀, 이는 연결의 정도를 나타내는 1,2,3,4 이는 지금 매우 역동적이고 변화 골격 근육 활동 수준에 적응할 수 있음을 인식, 뿐만 아니라 나이와 질병. 미토콘드리아 함량과 근육의 기능은 여러 가지 방법으로 평가될 수 있으며, 세포기질의 영향과 구별되는 미토콘드리아의 호흡기 및 효소 용량(Vmax)을 더 잘 이해하기 위해 기존의 세포 간 절연 방법이 적용되었다. 특히, 이러한 전통적인 방법은 서브사콜렘말과 인터미오피릴라 부위로부터 분리된 미토콘드리아 사이의 미묘한 생화학적 구별을 밝혀왔으며, 이러한 세포외 지역에서 대사에 대한 가능한 기능적 의미를 갖는다8,9,10,11.
미토콘드리아의 생물 발생은 핵과 미토콘드리아 DNA 모두에서 유전자 제품의 기여를 요구하는 데 독특합니다. 그러나, 이들 중 대다수는 mtDNA 전사가 13개의 단백질의 합성으로 만 이어지기 때문에 핵으로부터 유래된다. 미토콘드리아는 일반적으로 다양한 대사 경로에 관여하는 >1000단백질을 포함하기 때문에, 세포기관의 생체발생은 시토솔에서 전구체 단백질의 수입 및 조립을 엄격하게 조절하여 적절한 스토이치오메트리및 기능을 유지하기 위해 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 한다. 미토콘드리아로 향하는 핵으로 구분된 단백질은 일반적으로 세포기관을 대상으로 하는 미토콘드리아 표적 시퀀스(MTS)를 운반하고 하위 구획 국소화를 용이하게 합니다. 대부분의 매트릭스 결합 단백질은 경화 N 단자 MTS를 포함하고, 그 외또는 내부 미토콘드리아 막을 위해 향하는 사람들은 일반적으로 내부 표적 도메인14가 있는 동안. 수입 프로세스는 organelle13에 진입하기 위한 여러 경로를 제공하는 다양한 채널 집합에 의해 수행됩니다. 외부 멤브레인(TOM)의 연막은 사이토솔에서 막 간 공간으로 전구체를 선구체로 이동하여 내부 멤브레인(TIM) 복합체의 트랜스로케이스에 의해 인식된다. 이 단지는 핵으로 인코딩된 전구체를 매트릭스로 수입하여 N 단말 타겟팅 프리시퀀스를 절단하는 작업을 담당합니다. 외부 막을 향한 단백질은 TOM 복합체를 통해 이 막에 직접 삽입될 수 있으며, 내부 막으로 향하는 단백질은 TIM 단백질, 특히 TIM22에 의해 삽입됩니다. 그들의 수입에 따라, 단백질은 상주 proteases 및 chaperones에 의해 추가 처리되고 수시로 전자 수송 사슬에서 찾아낸 것과 같은 더 큰 복합체를 형성하기 위하여 결합합니다.
미토콘드리아 단백질 수입 자체는 또한 미토콘드리아 건강의 측정 역할을 하며, 이 과정은 ATP15 의 형태로 막 잠재력과 에너지원의 존재에 의존하기 때문이다. 예를 들어, 막 전위가 소멸되면, 단백질 키나아제 PINK1은 세포기관에 의해 채택될 수 없으며, 이는 미토파기16,17이라는 경로를 통해 세포기관의 분해의 개시를 유발하는 인산화 신호로 이어집니다. 유사한 상황에서, 수입이 방해될 때, 단백질 ATF5는 세포기관을 입력할 수 없고, 이어서 UPR 유전자 발현의 업 조절을 위한 전사 인자 역할을 하는 핵으로 전염된다18,19. 따라서, 단백질 수입 효율을 측정하는 것은 세포기관의 건강에 대한 포괄적인 통찰력을 제공할 수 있으며, 유전자 발현 반응은 핵에 대한 역행 신호의 정도를 나타내는 데 사용될 수 있다.
미토콘드리아의 생물 발생과 일반적으로 세포 건강에 대한 명백한 중요성에도 불구하고, 포유류 미토콘드리아의 수입 경로는 현저하게 과소 연구. 본 보고서에서는 전구체 단백질의 수입을 골격 근육 미토콘드리아로 측정하는 데 관련된 구체적인 단계를 설명하고 근육 및 사용의 변화에 대한 수입 시스템의 적응 반응을 설명하기 위한 데이터를 제공하여 골격 근육의 적응가성에 대한 단백질 수입의 기여를 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35S-methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td>Purchase requires a valid radioisotope permit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette for film</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>Kodak Xomatic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C298-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Drying Kit</td>
			<td>Sigma or BioRad</td>
			<td>Z377570-1PAK or OW-GDF-10</td>
			<td>Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>5350-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>T25 Digital Ultra Turrex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>POA301.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M7G</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>S1404S</td>
			<td>Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM4Z/hTom40 Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGMDH Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td>Can also be made with the ratio provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus Film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP MS 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit reticulocyte lysate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4960</td>
			<td>Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor for High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA-25.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001.500</td>
			<td>Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA 304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium salicylate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>106601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AccuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A322-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria

미토콘드리아는 에너지 공급뿐만 아니라 세포의 전반적인 건강을 결정하는 주요 대사 및 조절 세포기관입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아는 작은 타원형 세포기관에서 부터 광범위하고 망상과 같은 네트워크에 이르기까지 일련의 복잡한 형태에 존재합니다. 미토콘드리아 망상이 에너지 수요의 변경과 같은 다양한 자극에 대응하여 어떻게 확장되고 발전하는지 이해하는 것은 오랫동안 연구의 주제였습니다. 이러한 성장 또는 생물 발생의 주요 측면은 원래 핵 게놈에 의해 인코딩되고, 사이토솔에서 합성되고, 다양한 미토콘드리아 하위 구획으로 전이되는 전구체 단백질의 수입이다. 미토콘드리아는 단백질 수입 기계(PIM)로 알려진 많은 선택적 내측 및 외부 멤브레인 채널을 포함하는 이러한 수입 공정을 위한 정교한 메커니즘을 개발했습니다. 미토콘드리온으로 수입하는 것은 산화 인산화를 통해 세포기관에서 파생된 ATP의 가용성과 실행 가능한 멤브레인 잠재력및 가용성에 달려 있습니다. 따라서 그 측정은 세포구 건강의 척도로 작용할 수 있습니다. PIM은 또한 세포의 에너지 상태에 단단히 결합되는 골격 근육에 적응가성의 높은 수준을 전시한다. 예를 들어, 운동 훈련은 수입 용량을 증가시키는 것으로 나타났으며, 근육 사용은 미토콘드리아 함량의 마커의 변화와 일치하여 이를 감소시킵니다. 단백질 수입은 미토콘드리아의 생물 발생 및 확장에 있는 중요한 단계이지만, 프로세스는 골격 근육에서 널리 공부되지 않습니다. 따라서, 이 논문은 운동, 건강 및 질병에 있는 세포기관 회전율에 대한 통로의 중요성을 더 잘 이해하고 관련시키는 방법을 촉진하기 위하여 단백질 수입 용량을 측정하기 위하여 골격 근육에서 고립되고 완전하게 기능하는 미토콘드리아를 사용하는 방법을 설명합니다.

우리는 광범위하게이 프로토콜이 기능적이고 그대로 고립 된 골격 근육 미토콘드리아로 수입의 속도를 결정하기위한 유효한 분석이라고 설명했다. 처리되지 않은 조건에 비해, 매트릭스내의 말린 탈수소효소(MDH)와 같은 전형적인 전구체 단백질의 수입은 발리노마이신, 호흡기 사슬 비커플러 (도 2A)에 의해 억제될 수 있기 때문에 멤브레인 전위에 민감하다. 미?...

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Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

미토콘드리아는 골격 근육에서 높은 수준의 페노티픽 가소성을 나타내는 주요 대사 세포기관입니다. 사이토솔에서 단백질의 수입은 세포기관 생물 발생을 위한 중요한 통로입니다, 망상의 확장 및 미토콘드리아 기능의 유지에 필수적입니다. 따라서, 단백질 수입은 세포 건강의 기압계 역할을 한다.

골격 근육 미토콘드리아의 단백질 수입 능력 측정

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

미토콘드리아는 자신의 DNA를 가지고 있음에도 불구하고 핵 게놈에 크게 의존합니다. 따라서, 수입의 고도로 규제 된 메커니즘이 필요합니다. 이 방법은 프로세스와 외부 자극에 적응하는 방법을 연구하는 데 도움이됩니다.이것은 미토콘드리아의 다양한 하위 구획으로 단백질 수입을 정량적으로 평가하는 데 사용할 수있는 유일한 생화학 기술입니다. 미토콘드리아의 생존력은 다양한 질병 상태에 연루되어 있으므로 단백질 수입이 어떻게 규제되는지 이해하는 것이 미토콘드리아를 대상으로 하는 새로운 치료 접근법에 기여하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미토콘드리아의 생존력과 무결성을 보장하기 위해 격리 중에 추가주의가 필요합니다.조직의 철저한 다진 및 모든 후속 펠릿을 부드럽게 재중단하는 것이 필요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 과정 학생 인 애슐리 올리베이라 (Ashley Oliveira)가 될 것입니다. 골격 근육에서 미토콘드리아의 격리를 시작하려면 근육에서 지방 및 결합 조직을 제거하고 균일 한 슬러리가 될 때까지 미리 냉각 된 시계 유리에 조직을 다진다.다진 조직을 미리 냉각된 50밀리리터 플라스틱 원심분리 튜브에 놓고 정확한 무게를 기록합니다. 그런 다음, ATP를 포함하는 완충제 1로 다진 조직을 10배 희석시켰다. 8mm 트윈 블레이드 균질화기를 사용하여 9.8 Hertz의 출력에서 근육 샘플을 10초 동안 균질화하여 눈에 띄는 근육 덩어리가 남지 않도록 합니다.9, 000x G에서 샘플을 섭씨 4도에서 10분 동안 회전한 후, 환액 배지의 약 95 마이크로리터에서 펠릿을 조심스럽게 재연한다. 상체를 폐기하기 전에 샘플을 원심 분리하고 P-200 파이펫을 사용하여 약 180 마이크로리터의 재서스펜션 배지로 펠릿을 부드럽게 재중단합니다. 체외 번역의 경우, 수입 실험과 번역 레인에 사용할 미토콘드리아 샘플 당 20 마이크로 리터를 공급하기에 충분한 번역 반응 믹스를 준비하십시오.인큐베이션에 대한 반응을 섭씨 30도에서 30분간 배치합니다. 번역 반응이 시작된 후 15분 후, 10분 동안 30도에서 멸균 튜브 1.5밀리리터 튜브에 미토콘드리아 90 마이크로그램을 알리쿼트하고 사전 배양합니다. 멸균 1.5 밀리리터 튜브의 신선한 세트에서, 번역 반응의 18 마이크로 리터와 미토콘드리아의 75 마이크로 그램을 결합하고 원하는 시간 동안 섭씨 30도에서 튜브를 배양.번역 반응의 나머지 볼륨을 얼음에 보관합니다. 적절한 인큐베이션 시간 후에 수입 반응을 종료하려면 튜브를 섭씨 30도에서 제거하여 얼음 위에 놓고 자당 쿠션으로 튜브 위에 수입 반응을 조심스럽게 옮겨냅니다. 17, 000x G의 자당 쿠션으로 샘플을 섭씨 4도에서 15분간 원심분리합니다.P-1000 파이펫을 사용하여 펠릿을 방해하지 않고 상체를 조심스럽게 제거하십시오. 외부 멤브레인으로 수입하려면 Tom40에 사용하여 반응을 수행하고, 새로 준비된 0.1-대구 나트륨 탄산나트륨의 50 마이크로리터로 펠릿을 재보중단하고 30분 동안 얼음에 배양한다. 인큐베이션에 따라 샘플을 섭씨 4도에서 5분간 14, 000x G에서 원심분리합니다.다음으로, 원고에 설명된 대로 SDS-PAGE 전기전에 대한 샘플을 준비한다. 잔류 번역 반응의 마이크로리터 3개와 리시스 버퍼 37마이크로리터 및 5개의 미세리터의 시료 염료를 혼합하여 제어 번역 차선을 준비한다. 샘플을 섭씨 95도에서 5분간 끓이고, 미토콘드리아펠을 피하기 위해 저속으로 부드럽게 회전합니다.SDS 폴리아크릴아미드 젤에 샘플을 적용한 후, 젤을 5%트리클로로아세트산 또는 TCA로 끓여 서 서지속적으로 교반하여 5분간 연기 후드에 넣고 끓입니다. 그런 다음 젤을 회전 판에 분당 50회전시 1분간 이중 증류수로 놓습니다. 젤을 10밀리머 트리스로 회전 플레이트에 분당 50회전으로 5분간 세척합니다.단백질을 침전시키기 위해 젤을 한 해금 살리Cytic 산의 충분한 양으로 씻어 30 분 동안 회전 판에 젤을 덮습니다. 젤을 탈수하려면 젤 건조기의 다공성 침대에 큰 얼룩진 종이를 놓고 젤이 적용되는 지역에 종이 타월 1 장을 놓습니다. 그런 다음 11센티미터를 9센티미터씩 잘라서 종이 타월에 종이를 놓습니다.11센티미터 x 9센티미터 의 두 번째 조각을 사용하여 용기에서 젤을 떠서 첫 번째 조각 위에 평평하게 올려 놓습니다. 약간 더 큰 플라스틱 조각을 젤에 내려 놓고 주름이나 거품이 없는 것을 방지합니다. 그런 다음 젤 건조기의 플라스틱 커버를 랩 상단위에 놓습니다.진공을 켭니다. 플라스틱 커버의 모서리를 들어 올리고 덮개가 다시 밀봉되기를 기다리며 플라스틱 덮개가 씰을 형성했는지 확인하십시오. 젤 드라이어를 닫고 90분간 달릴 수 있으며, 섭씨 30도에서 시작하여 점차 섭씨 80도에 도달하고 달리기가 끝나면 섭씨 30도까지 돌아갑니다.건조 공정에 사용되는 플라스틱 랩에 젤을 감쌉니다. 탈수되면 젤은 고화되어 종이처럼 얇습니다. 탈수된 젤을 카세트에 인 필름을 얹습니다.인 이미징이 가능한 적합한 글리저로 사인 방사선 촬영을 사용하여 젤을 시각화하기 전에 24 시간 동안 필름을 노출하십시오. 대표적인 분석은 말산 탈수소 효소, 또는 MDH에 대한 수입의 정상적인 비율을 보여 주며, 서브사콜렘말 및 인터미오피브릴라 미토콘드리아, 및 전구체 MDH의 번역 산물이다. 발리노마이신의 첨가는 SS와 IMF 미토콘드리아의 매트릭스로 MDH 단백질 수입을 억제하였다.마찬가지로, 세제 트리톤 X는 내부 막의 용해성으로 인해 두 하위 분획으로 MDH 수입을 억제하였다. 단백질 수입의 추정은 시간 지속 시간을 증가시키기 위해 수행되었으며, 그 결과 데이터는 수입이 시간 의존적 과정이며, SS 및 IMF 미토콘드리아는 수입에 대해 서로 다른 속도 또는 용량을 가지고 있음을 보여 주었다. 쥐가 전기 자극을 받았을 때, 톰 40은 대조군과 비교하여 만성 자극된 동물로부터 근육이 더 높았다.Ornithine transcarbamylase, 또는 OCT 가져오기, 미토콘드리아 매트릭스로, 인큐베이션의 매 시점에서 증가, 만성 자극 근육에서 미토콘드리아의 1.4 배 증가의 결과. 단백질 수입은 미토콘드리아 함량의 지수와 긍정적으로 상관관계가 있었고 COX 활성에 의해 평가되었다. 미토콘드리아 매개 세포사멸을 조사하는 과정에서, 박병과 박이중 녹아웃 동물은 미토콘드리아 매트릭스로 단백질 수입을 감소시켰다.6주 간의 자발적 인 바퀴 가실행은 이중 녹아웃 동물의 수입 결함을 구출했습니다. 수입 반응의 지속 기간 및 어떤 단백질을 수입할 지 와 같은 변수를 고려하는 것이 중요합니다. 세포분획은 세포성 요인이 수입 속도에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하기 위해 반응에 통합될 수 있다.대안적으로, 단백질은 단백질이 선택적으로 수입될 수 있는 방법을 이해하기 위하여 잠복하기 전에 변형될 수 있습니다. 이 기술은 각종 질병 국가에 나타날 수 있는 미토콘드리아 근병증의 복잡한 병리를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation을위한 Cross-linked Skeletal Musculus로부터 고품질 핵을 준비하기위한 Filtration 기반 방법

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

연구

생화학

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

마우스 골격 근육에서 Chromatin Immunoprecipitation에 대 한 향상 된 프로토콜

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

절연 및 호흡 측정의 미토 콘 드리 아 애기 thaliana 에서

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Protoplasts를 사용 하 여 엽록체로 공부 단백질 가져오기

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

경쟁 적정 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 녹음 방송 요인 DNA 바인딩 선호도의 높은 감도 측정

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

단백질 폴딩, 전송, 및 방사성 펄스 체이스 하 여 살아있는 세포의 저하의 분석

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

아밀로이드 피브릴스뇌 미토콘드리아의 상호 작용 및 막 관과화

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...