Name: measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria
Uploaded: 2022-01-07T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria at JoVE.com

Författarna vill tacka Dr. G.C. Shore of McGill University, Dr. A. Strauss från Washington School of Medicine och Dr.M.T. Ryan från La Trobe University för de ursprungliga donationerna av uttrycksplasmider som användes för denna forskning. Detta arbete stöddes av finansiering från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) till D. A. Hood. D. A. Hood är också innehavare av en kanadensisk forskningsstol i cellfysiologi.

Alla djur som används i dessa experiment underhålls i djurvårdsanläggningen vid York University. Försöken utförs i enlighet med Canadian Council on Animal Cares riktlinjer med godkännande från York University Animal Care Committee (Tillstånd: 2017-08).
1. Funktionell isolering av subsarkolemmal och intermyofibrillär mitokondrier från skelettmuskulaturen
<ol><li>Reagensberedning:<ol>
<li>Förbered alla buffertar och media enligt tabell 1.</li>
		<li>Ställ in buff...

<ol>
	<li>Kirkwood, S. P., Munn, E. A., Brooks, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+reticulum+in+limb+skeletal+muscle.">Mitochondrial reticulum in limb skeletal muscle.</a> The American Journal of Physiology. 251 (3), 395-402 (1986).</li><li>Glancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Power+grid+protection+of+the+muscle+mitochondrial+reticulum.">Power grid protection of the muscle mitochondrial reticulum.</a> Cell Reports. 19 (3), 487-496 (2017).</li><li>Vincent, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+3D+mapping+of+the+human+skeletal+muscle+mitochondrial+network.">Quantitative 3D mapping of the human skeletal muscle mitochondrial network.</a> Cell Reports. 26 (4), 996-1009 (2019).</li><li>Ogata, T., Yamasaki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high-resolution+scanning+electron+microscopy+of+mitochondria+and+sarcoplasmic+reticulum+arrangement+in+human+red,+white,+and+intermediate+muscle+fibers.">Ultra-high-resolution scanning electron microscopy of mitochondria and sarcoplasmic reticulum arrangement in human red, white, and intermediate muscle fibers.</a> Anatomical Record. 248 (2), 214-223 (1997).</li><li>Hood, D. A., Tryon, L. D., Carter, H. N., Kim, Y., Chen, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unravelling+the+mechanisms+regulating+muscle+mitochondrial+biogenesis.">Unravelling the mechanisms regulating muscle mitochondrial biogenesis.</a> Biochemical Journal. 473, 2295-2314 (2016).</li><li>Perry, C. G. R., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes.">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1032-1036 (2013).</li><li>Holloszy, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+adaptations+in+muscle.">Biochemical adaptations in muscle.</a> The Journal of Biological Chemistry. 242 (9), 2278-2282 (1967).</li><li>Cogswell, A. M., Stevens, R. J., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+skeletal+muscle+mitochondria+from+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+isolated+regions.">Properties of skeletal muscle mitochondria from subsarcolemmal and intermyofibrillar isolated regions.</a> The American Journal of Physiology. 264, 383-389 (1993).</li><li>Koves, T. R., Noland, R. C., Bates, A. L., Henes, S. T., Muoio, D. M., Cortright, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria+play+distinct+roles+in+regulating+skeletal+muscle+fatty+acid+metabolism.">Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria play distinct roles in regulating skeletal muscle fatty acid metabolism.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 288, 1074-1082 (2005).</li><li>Bizeau, M. E., Willis, W. T., Hazel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+responses+to+endurance+training+in+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+mitochondria.">Differential responses to endurance training in subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria.</a> Journal of Applied Physiology. 85 (4), 1279-1284 (1998).</li><li>Krieger, D. A., Tate, C. A., McMillin-Wood, J., Booth, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+rat+skeletal+muscle+mitochondria+after+exercise+and+immobilization.">Populations of rat skeletal muscle mitochondria after exercise and immobilization.</a> Journal of Applied Physiology: Respiratory, Environmental and Exercise Physiology. 48 (1), 23-28 (1980).</li><li>Calvo, S. E., Clauser, K. R., Mootha, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoCarta2.0:+An+updated+inventory+of+mammalian+mitochondrial+proteins.">MitoCarta2.0: An updated inventory of mammalian mitochondrial proteins.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 1251-1257 (2016).</li><li>Wiedemann, N., Pfanner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+machineries+for+protein+import+and+assembly.">Mitochondrial machineries for protein import and assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 685-714 (2017).</li><li>Backes, S., Herrmann, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+translocation+into+the+intermembrane+space+and+matrix+of+mitochondria:+mechanisms+and+driving+forces.">Protein translocation into the intermembrane space and matrix of mitochondria: mechanisms and driving forces.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 4, 83 (2017).</li><li>Harbauer, A. B., Zahedi, R. P., Sickmann, A., Pfanner, N., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+import+machinery+of+mitochondria+-+A+regulatory+hub+in+metabolism,+stress,+and+disease.">The protein import machinery of mitochondria - A regulatory hub in metabolism, stress, and disease.</a> Cell Metabolism. 19 (3), 357-372 (2014).</li><li>Jin, S. M., Lazarou, M., Wang, C., Kane, L. A., Narendra, D. P., Youle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+potential+regulates+PINK1+import+and+proteolytic+destabilization+by+PARL.">Mitochondrial membrane potential regulates PINK1 import and proteolytic destabilization by PARL.</a> The Journal of Cell Biology. 191 (5), 933-942 (2010).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PINK1+stabilized+by+mitochondrial+depolarization+recruits+Parkin+to+damaged+mitochondria+and+activates+latent+Parkin+for+mitophagy.">PINK1 stabilized by mitochondrial depolarization recruits Parkin to damaged mitochondria and activates latent Parkin for mitophagy.</a> The Journal of Cell Biology. 189 (2), 211-221 (2010).</li><li>Fiorese, C. J., Schulz, A. M., Lin, Y. -. F., Rosin, N., Pellegrino, M. W., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+ATF5+mediates+a+mammalian+mitochondrial+UPR.">The transcription factor ATF5 mediates a mammalian mitochondrial UPR.</a> Current biology. 26 (15), 2037-2043 (2016).</li><li>Quiros, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-omics+analysis+identifies+ATF4+as+a+key+regulator+of+the+mitochondrial+stress+response+in+mammals.">Multi-omics analysis identifies ATF4 as a key regulator of the mitochondrial stress response in mammals.</a> The Journal of Cell Biology. 216 (7), 2027-2045 (2017).</li><li>Takahashi, M., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+import+into+subsarcolemmal+and+intermyofibrillar+skeletal+muscle+mitochondria.+Differential+import+regulation+in+distinct+subcellular+regions.">Protein import into subsarcolemmal and intermyofibrillar skeletal muscle mitochondria. Differential import regulation in distinct subcellular regions.</a> The Journal of Biological Chemistry. 271 (44), 27285-27291 (1996).</li><li>Hood, D. A., Memme, J. M., Oliveira, A. N., Triolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+skeletal+muscle+mitochondria+in+health,+exercise,+and+aging.">Maintenance of skeletal muscle mitochondria in health, exercise, and aging.</a> Annual Review of Physiology. 81, (2019).</li><li>Joseph, A., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrion+plasticity+of+TOM+complex+assembly+in+skeletal+muscle+mitochondria+in+response+to+chronic+contractile+activity.">Mitochondrion plasticity of TOM complex assembly in skeletal muscle mitochondria in response to chronic contractile activity.</a> Mitochondrion. 12 (2), 305-312 (2012).</li><li>Singh, K., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+denervation-induced+muscle+disuse+on+mitochondrial+protein+import.">Effect of denervation-induced muscle disuse on mitochondrial protein import.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 138-145 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mitochondrial+morphology+and+defective+protein+import+reveal+novel+roles+for+Bax+and/or+Bak+in+skeletal+muscle.">Altered mitochondrial morphology and defective protein import reveal novel roles for Bax and/or Bak in skeletal muscle.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 305 (5), 502-511 (2013).</li><li>Lai, N., Kummitha, C., Rosca, M., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle:+optimizing+recovery+and+preserving+integrity.">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiologica. 25 (2), 13182 (2019).</li><li>Nargund, A. M., Pellegrino, M. W., Fiorese, C. J., Baker, B. M., Haynes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+import+efficiency+of+ATFS-1+regulates+mitochondrial+UPR+activation.">Mitochondrial import efficiency of ATFS-1 regulates mitochondrial UPR activation.</a> Science. 337 (6094), 587-590 (2012).</li><li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria:+Isolation,+structure+and+function.">Mitochondria: Isolation, structure and function.</a> Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li><li>Kras, K. A., Willis, W. T., Barker, N., Czyzyk, T., Langlais, P. R., Katsanos, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subsarcolemmal+mitochondria+isolated+with+the+proteolytic+enzyme+nagarse+exhibit+greater+protein+specific+activities+and+functional+coupling.">Subsarcolemmal mitochondria isolated with the proteolytic enzyme nagarse exhibit greater protein specific activities and functional coupling.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 6, 101-107 (2016).</li><li>S&#225;nchez-Duarte, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicorandil+affects+mitochondrial+respiratory+chain+function+by+increasing+complex+III+activity+and+ROS+production+in+skeletal+muscle+mitochondria.">Nicorandil affects mitochondrial respiratory chain function by increasing complex III activity and ROS production in skeletal muscle mitochondria.</a> Journal of Membrane Biology. 253 (4), 309-318 (2020).</li><li>I&#241;igo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-&#945;+in+female+skeletal+muscle+is+not+required+for+regulation+of+muscle+insulin+sensitivity+and+mitochondrial+regulation.">Estrogen receptor-&#945; in female skeletal muscle is not required for regulation of muscle insulin sensitivity and mitochondrial regulation.</a> Molecular Metabolism. 34 (2020), 1-15 (2020).</li><li>Newsom, S. A., Stierwalt, H. D., Ehrlicher, S. E., Robinson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substrate-specific+respiration+of+isolated+skeletal+muscle+mitochondria+after+1+h+of+moderate+cycling+in+sedentary+adults.">Substrate-specific respiration of isolated skeletal muscle mitochondria after 1 h of moderate cycling in sedentary adults.</a> Medicine and Science in Sports and Exercise. 53 (7), 1375-1384 (2021).</li><li>Takahashi, M., Chesley, A., Freyssenet, D., Hood, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+activity-induced+adaptations+in+the+mitochondrial+protein+import+system.">Contractile activity-induced adaptations in the mitochondrial protein import system.</a> The American Journal of Physiology. 274 (5), 1380-1387 (1998).</li><li>Kravic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+mammalian+skeletal+muscle,+phosphorylation+of+TOMM22+by+protein+kinase+CSNK2/CK2+controls+mitophagy.">In mammalian skeletal muscle, phosphorylation of TOMM22 by protein kinase CSNK2/CK2 controls mitophagy.</a> Autophagy. 8627, 01-65 (2017).</li><li>Opali&#324;ska, M., Meisinger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+control+via+the+mitochondrial+protein+import+machinery.">Metabolic control via the mitochondrial protein import machinery.</a> Current Opinion in Cell Biology. 33, 42-48 (2015).</li><li>Gerbeth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+regulation+of+protein+import+receptor+tom22+by+cytosolic+and+mitochondria-bound+kinases.">Glucose-induced regulation of protein import receptor tom22 by cytosolic and mitochondria-bound kinases.</a> Cell Metabolism. 18 (4), 578-587 (2013).</li></ol>

Mitokondrier är unikt beroende av uttryck och samordning av både nukleära och mitokondriella genom för deras syntes och expansion inom celler. Det nukleära genomet kodar dock den stora majoriteten (99%) av mitokondriellt proteom, och detta understryker vikten av proteinimportmaskineriet för att stödja mitokondriell biogenes. Import fungerar också som en viktig signaleringshändelse, eftersom underlåtenhet att importera kan främja initieringen av det utfällda proteinsvaret och/eller mitophagy15,16,26.<sup class...

Mitokondrier är organeller som finns i komplexa morfologier i olika celltyper och är erkända för att ha ett ökande utbud av funktioner som är kritiska för cellulär hälsa. Som sådan kan de inte längre täljas ner bara till energiproducerande organeller. Mitokondrier är viktiga metaboliska regulatorer, bestämningsfaktorer för cellens öde och signalnav, vars funktioner kan fungera som användbara indikatorer på övergripande cellulär hälsa. I skelettmuskulaturceller visar elektronmikroskopistudier förekomsten av geografiskt distinkt subsarkolemmal (SS) och intermyofibrillar (IMF) mitokondrier, som uppvisar en grad av anslutning1,2,3,4 som nu är erkänd för att vara mycket dynamisk och anpassningsbar till förändringar i skelettmuskulaturaktivitetsnivåer, liksom med ålder och sjukdom. Mitokondriellt innehåll och funktion i muskler kan bedömas på många sätt5,6, och traditionella metoder för organell isolering har tillämpats för att bättre förstå andningsorganen och enzymatiska kapaciteter (Vmax) av mitokondrier skiljer sig från påverkan av cellulära miljön7,8. I synnerhet har dessa traditionella metoder avslöjat subtila biokemiska skillnader mellan mitokondrier isolerade från subsarkolemmala och intermyofibrillar regioner, belysning möjliga funktionella konsekvenser för metabolism i dessa subcellulära regioner8,9,10,11.
Mitokondriernas biogenes är unik för att kräva bidrag från genprodukter från både nukleärt och mitokondriellt DNA. De allra flesta av dessa härrör dock från kärnan eftersom mtDNA-transkription endast leder till syntesen av 13 proteiner. Eftersom mitokondrier normalt består av >1000 proteiner som är involverade i olika metaboliska vägar, kräver biogenes av organellen ett tätt reglerat import- och monteringsmedel för prekursorproteiner från cytosolen i de olika mitokondriella delfacken för att upprätthålla korrekt stökiometri och funktion12,13. Kärnkodade proteiner avsedda för mitokondrier bär normalt en mitokondriell målsekvens (MTS) som riktar dem mot organellen och underlättar deras sub-compartmental lokalisering. De flesta matrisbundna proteiner innehåller en klyvbar N-terminal MTS, medan de som är avsedda för det yttre eller inre mitokondriella membranet vanligtvis har interna måldomäner14. Importprocessen utförs av en uppsättning olika kanaler som ger flera vägar för inträde i organelle13. Translocasen av det yttre membranet (TOM) komplex shuttles prekursorer från cytosolen in i intermembrane utrymme, där de känns igen av translocase av det inre membranet (TIM) komplex. Detta komplex är ansvarigt för import av kärnkodade prekursorer till matrisen, där proteaser klyver N-terminalen som riktar sig till presequence. Proteiner avsedda för det yttre membranet kan sättas in direkt i detta membran genom TOM-komplexet, medan de som är avsedda för det inre membranet sätts in av ett TIM-protein, särskilt TIM22. Efter deras import bearbetas proteiner vidare av bosatta proteaser och förkläden och kombineras ofta för att bilda större komplex, såsom de som finns i elektrontransportkedjan.
Mitokondriell proteinimport i sig fungerar också som ett mått på mitokondriell hälsa, eftersom denna process förlitar sig på närvaron av membranpotential och en energikälla i form av ATP15. Till exempel, när membranpotentialen försvinner, kan proteinkinas PINK1 inte tas upp av organellen, vilket leder till fosforyleringssignaler som utlöser uppkomsten av nedbrytningen av organellen genom en väg som kallas mitophagy16,17. Under liknande omständigheter, när importen hindras, kan proteinet ATF5 inte komma in i organellen, och det omplacerar därefter till kärnan, där det fungerar som en transkriptionsfaktor för uppreglering av UPR-genuttryck18,19. Således kan mätning av proteinimport effektivitet ge omfattande inblick i organellens hälsa, medan genuttryckssvaret kan användas för att indikera graden av bakåtsträvande signalering till kärnan.
Trots dess uppenbara betydelse för biogenes av mitokondrier och för cellulär hälsa i allmänhet, importvägen i däggdjur mitokondrier är anmärkningsvärt understudied. I denna rapport beskriver vi de specifika stegen i mätningen av prekursorproteiner till skelettmuskulatur mitokondrier och tillhandahåller data för att illustrera importsystemets adaptiva svar på förändringar i muskler och oanvända, vilket illustrerar proteinimportens bidrag till skelettmuskulaturens adaptiva plasticitet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2% BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35S-methionine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEG709A500UC</td>
			<td>Purchase requires a valid radioisotope permit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blotting paper; Whatman 3MM CHR Paper</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>05-714-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cassette for film</td>
			<td>Kodak</td>
			<td>Kodak Xomatic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugation Tube</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3138-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C298-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9779-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>EDT002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E4378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Dryer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Model 583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Drying Kit</td>
			<td>Sigma or BioRad</td>
			<td>Z377570-1PAK or OW-GDF-10</td>
			<td>Various options are commercially available through many companies, these are just as few examples.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Caledon Laboratory Chemicals</td>
			<td>5350-1-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-25 Centrifuge</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer</td>
			<td>IKA</td>
			<td>T25 Digital Ultra Turrex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoamylalcohol, or 3-methylbutanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I9392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAc</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>POA301.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M7G</td>
			<td>New England Biolab</td>
			<td>S1404S</td>
			<td>Dilute with 1000ul 20mM HEPES to make 1mM stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MAG510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>M65-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MOPS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>MOP001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SOD001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NTP</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R0191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OCT Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. G. C. Shore, McGill University, Montreal, Canada; alternative available through Addgene, plasmid #71877</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGEM4Z/hTom40 Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. M. T. Ryan, La Trobe University, Melbourne, Australia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pGMDH Plasmid</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Donated from Dr. A. Strauss, Washington University School of Medicine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:Chloroform:Isoamyalcohol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3803</td>
			<td>Can also be made with the ratio provided</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphorus Film</td>
			<td>Fujifilm</td>
			<td>BAS-IP MS 2025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit reticulocyte lysate</td>
			<td>Promega</td>
			<td>L4960</td>
			<td>Avoid freeze-thaw; aliquot lysate upon arrival; amino acids are provided in the kit as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotor for High Speed Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>JA-25.50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SDS001.500</td>
			<td>Caution: harmful if ingested or inhaled, wear a mask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate</td>
			<td>Bioshop</td>
			<td>SAA 304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium salicylate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>106601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP6 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P1085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spermidine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S-2626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>SUC507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 RNA Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>P2075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AccuSpin Micro 17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A322-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>BioShop</td>
			<td>TRS001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M6250-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of protein import capacity of skeletal muscle mitochondria

Mitokondrier är viktiga metaboliska och regulatoriska organeller som bestämmer energiförsörjning samt cellens allmänna hälsa. I skelettmuskulaturen finns mitokondrier i en serie komplexa morfologier, allt från små ovala organeller till ett brett, reticulumliknande nätverk. Att förstå hur mitokondriellt retikulum expanderar och utvecklas som svar på olika stimuli som förändringar i energiefterfrågan har länge varit ett forskningsämne. En viktig aspekt av denna tillväxt, eller biogenes, är importen av prekursorproteiner, ursprungligen kodade av det nukleära genomet, syntetiserat i cytosolen och omlokaliserat till olika mitokondriella delfack. Mitokondrier har utvecklat en sofistikerad mekanism för denna importprocess, som involverar många selektiva inre och yttre membrankanaler, så kallade proteinimportmaskineriet (PIM). Import till mitokondrion är beroende av livskraftig membranpotential och tillgången på organell-härledd ATP genom oxidativ fosforylering. Därför kan dess mätning fungera som ett mått på organellhälsa. PIM uppvisar också en hög nivå av adaptiv plasticitet i skelettmuskulaturen som är tätt kopplad till cellens energistatus. Till exempel har träning visat sig öka importkapaciteten, medan muskelavanvändning minskar den, sammanfaller med förändringar i markörer för mitokondriellt innehåll. Även om proteinimport är ett kritiskt steg i biogenes och expansion av mitokondrier, studeras processen inte allmänt i skelettmuskulaturen. Således beskriver detta dokument hur man använder isolerade och fullt fungerande mitokondrier från skelettmuskulaturen för att mäta proteinimportkapacitet för att främja en större förståelse för de metoder som är inblandade och en uppskattning av vikten av vägen för organell omsättning i motion, hälsa och sjukdom.

Vi har utförligt illustrerat att detta protokoll är en giltig analys för att bestämma importhastigheten till funktionella och intakta isolerade skelettmuskulatur mitokondrier. I jämförelse med obehandlade förhållanden är importen av typiska prekursorproteiner som malatedehydrogenas (MDH) till matrisen känslig för membranpotential eftersom den kan hämmas av valinomycin, en andningskedja som inte motsvarar systemet (figur 2A). Importen hindras också när mitokondr...

Watch this Scientific Journal Video about Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria at JoVE.com

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Mitokondrier är viktiga metaboliska organeller som uppvisar en hög nivå av fenotypisk plasticitet i skelettmuskulaturen. Importen av proteiner från cytosolen är en kritisk väg för organelle biogenesis, avgörande för expansionen av retikulum och upprätthållandet av mitokondriell funktion. Därför fungerar proteinimport som en barometer för cellulär hälsa.

Mätning av proteinimportkapacitet av skelettmuskulatur mitokondrier

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Mitokondrier är starkt beroende av det nukleära genomet, trots att de har sitt eget DNA. Det krävs alltså en starkt reglerad importmekanism. Denna metod hjälper till att studera processen och hur den kan anpassa sig till yttre stimuli.Detta är den enda biokemiska teknik som finns tillgänglig för att kvantitativt utvärdera proteinimport till de olika delfacken i mitokondrierna. Mitokondriernas livskraft är inblandad i olika sjukdomstillstånd, så att förstå hur proteinimport regleras kan bidra till nya terapeutiska metoder som riktar sig mot mitokondrier. Extra försiktighet krävs under isoleringen för att säkerställa mitokondriernas livskraft och integritet.Noggrann malning av vävnaden och försiktigt återanvändning av alla efterföljande pellets är nödvändigt. Ashley Oliveira, doktorand i mitt laboratorium, demonstrerar proceduren. För att börja isolering av mitokondrier från skelettmuskulaturen, ta bort fett och bindväv från musklerna och färs vävnaderna på ett förkylt klockglas tills det är en homogen slam.Placera den malda vävnaden i ett förkylt 50-milliliter plastcentrifugeringsrör och registrera den exakta vikten. Späd sedan ut den malda vävnaden tiofaldigt med buffert 1 som innehåller ATP. Använd en åtta millimeters tvåbladig homogenisator för att homogenisera muskelprovet vid en effekt på 9,8 Hertz i 10 sekunder, vilket säkerställer att inga synliga bitar av muskler återstår.Efter att ha snurrat provet vid 9 000x G i 10 minuter vid fyra grader Celsius, återanvänd pelleten försiktigt i ungefär 95 mikroliter av resuspension-mediet. Centrifugera provet innan du kasserar supernatanten och återanvänd pelleten försiktigt med ungefär 180 mikroliter resuspension medium med hjälp av en P-200 pipetter. För in vitro-översättning, förbered tillräckligt med översättningsreaktionsblandning för att leverera 20 mikroliter per prov av mitokondrier som ska användas i importexperiment och för en översättningsfil.Placera reaktionen för inkubation vid 30 grader Celsius i 30 minuter. 15 minuter efter att översättningsreaktionen inleddes, alikvot 90 mikrogram mitokondrier i sterila 1,5-milliliterrör och förinkuberas vid 30 grader Celsius i 10 minuter. Kombinera 75 mikrogram mitokondrier med 18 mikroliter av översättningsreaktionen i en ny uppsättning sterila 1,5-milliliterrör och inkubera röret vid 30 grader Celsius under önskad tid.Håll den återstående volymen av översättningsreaktionen på is. För att avsluta importreaktionen efter lämplig inkubationstid, ta bort röret från 30 grader Celsius för att placera det på is och överför sedan försiktigt importreaktionen ovanpå röret med sackaroskudden. Centrifugera proverna med sackaroskudde vid 17 000x G i 15 minuter vid fyra grader Celsius.Använd en P-1000 pipett och ta försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. För att importera till det yttre membranet, utför reaktionen med hjälp av Tom40 och återanvänd pelleten i 50 mikroliter nyberedd 0,1-molar natriumkarbonat och inkubera på is i 30 minuter. Efter inkubationen centrifugerar du provet vid 14 000x G i fem minuter vid fyra grader Celsius.Förbered sedan proverna för SDS-PAGE elektrofores enligt beskrivningen i manuskriptet. Förbered kontrollöversättningsfilen genom att blanda tre mikroliter av den återstående översättningsreaktionen med 37 mikroliter lysbuffert och fem mikroliter provfärg. Koka proverna i fem minuter vid 95 grader Celsius och snurra försiktigt ner i låg hastighet för att undvika pelletering av mitokondrier.Efter applicering av prover på SDS polyakrylamidgel, koka gelén i 5% trikloreättiksyra, eller TCA, i en rökhuv i fem minuter med kontinuerlig omrörning. Placera sedan gelén i dubbeldestillerat vatten på en roterande platta i en minut vid 50 rotationer per minut. Tvätta gelén i 10-millimolar Tris på en roterande platta i fem minuter vid 50 rotationer per minut.För att fälla ut proteinet, tvätta gelén i tillräckligt med volym av en molar salicytic syra för att täcka gelén på en roterande tallrik i 30 minuter. För att dehydrera gelén, placera ett stort ark blottingpapper ner på geltorkens porösa säng och ett ark av en pappershandduk i det område där gelén kommer att appliceras. Skär sedan 11 centimeter med 9 centimeter papper och placera papperet på pappershandduken.Använd en andra bit av 11 centimeter med 9 centimeter blottningspapper för att skopa ut gelén från behållaren och lägg gelén platt ovanpå den första biten. Placera en något större plastbit på gelén, vilket säkerställer att inga veck eller bubblor under omslaget. Lägg sedan ner geltorkens plasthölje över toppen av omslaget.Sätt på vakuumet. Se till att plasthöljet har bildat en tätning genom att lyfta hörnet av plasthöljet och vänta på att locket ska återförslutas. Stäng geltorken för att köra i 90 minuter, från 30 grader Celsius för att nå 80 grader Celsius gradvis och återgå till 30 grader Celsius i slutet av körningen.Linda gelén i plastfolien som används i torkningsprocessen. När gelén är uttorkad stelnar den och känns papperstunn. Lägg den uttorkade gelén i en kassett med en fosforfilm ovanpå.Exponera filmen i 24 timmar innan du visualiserar gelén med hjälp av autoradiografi med någon lämplig bildspelare som kan avbilda fosfor. Den representativa analysen visar de normala importhastigheterna för malatedehydrogenas, eller MDH, i subsarkolemmal och intermyofibrillär mitokondrierna och översättningsprodukten av föregångaren MDH. Tillsatsen av valinomycin hämmade MDH protein import i matrisen av SS och IMF mitokondrier.På samma sätt hämmade tvättmedlet Triton X MDH-import till båda delfraktionerna på grund av solubilisering av det inre membranet. Uppskattningen av proteinimporten gjordes för att öka varaktigheten, och de uppgifter som följer av detta visade att importen är en tidsberoende process, och SS och IMF:s mitokondrier har olika importtakt eller importkapacitet. När råttor utsattes för elektrisk stimulering var Tom 40-importen till det yttre membranet högre i muskler från kroniskt stimulerade djur jämfört med kontroller.Ornitin transkarbamylas, eller OCT import, i mitokondriell matrisen ökades vid varje tidpunkt av inkubation, vilket resulterar i en 1,4-faldig ökning av mitokondrier från kroniskt stimulerade muskeln. Proteinimporten var positivt korrelerad med ett index över mitokondriellt innehåll och bedömdes av COX-aktivitet. Vid undersökning mitokondriellt medierad apoptos uppvisade Bax och Bak dubbel-knockout djur minskad proteinimport till mitokondriell matris.Sex veckors frivillig hjulkörning räddade importfelet hos dubbel-knockout djur. Det är viktigt att beakta variabler som importreaktionens varaktighet och vilket protein som ska importeras. Cytosoliska fraktioner kan införlivas i reaktionen för att förstå hur cytosoliska faktorer kan påverka importhastigheten.Alternativt kan proteiner modifieras före inkubation för att förstå hur proteiner kan importeras selektivt. Denna teknik kan hjälpa till att förstå komplexa etiologier av mitokondriell myopathies som kan förekomma i olika sjukdom stater.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Intracellular Compartments and Protein Sorting

SCIENTISTS IN ACTION

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

En filtreringsbaserad metod för att förbereda högkvalitativ nukleär från tvärbunden skelettmuskel för kromatinimmunutfällning

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Förbättrat protokoll för kromatin Immunoprecipitation från mus skelettmuskulatur

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Analyses of Mitochondrial Calcium Influx in Isolated Mitochondria and Cultured Cells

Analyser av mitokondrie kalcium tillströmningen i isolerade mitokondrier och odlade celler

Ca2+ handling by mitochondria is a critical function regulating both physiological and pathophysiological processes in a broad spectrum of cells. The ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studera Protein Import till kloroplaster som använder Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med och membran permeabilisering av hjärnans Mitokona av amyloid fibriller

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Att skapa mycket specifika kemiskt inducerad Proteindimeriseringssystem genom stegvis val av ett kombinatoriskt Endomänsantikroppsbibliotek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Kvantifiering av subcellulär glykogenfördelning i skelettmuskelfibrer med hjälp av transmissionselektronmikroskopi

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...