Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية لمنح الصحة R01 HL114940 (Biesiadecki) و R01 AG060542 (Ziolo) و T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).

تمت الموافقة على جميع الإجراءات التي أجريت في هذه الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في جامعة ولاية أوهايو وفقا لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة.
1. إعداد الحل
ملاحظة: يرجى الاطلاع على الجدول 2 لمعرفة تركيزات المخزن المؤقت....

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

الميزة الرئيسية لتقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff هي أنها تحد من نقص الأكسجة ووقت نقص تروية الدم من خلال عدم الحاجة إلى قنية لجهاز Langendorff. بدلا من تقنيات Langendorff الكلاسيكية التي تستغرق عدة دقائق لإزالة القلب وتنظيفه وتعليقه ، مما يؤدي غالبا إلى تلف نقص تروية الخلية العضلية ، تتضم...

لعقود من الزمان ، كانت الفكرة الأساسية في أدبيات بيولوجيا القلب هي الآلية الجزيئية للعمل. يجب إنشاء آلية العمل من أجل نشر دراسات موثوقة. هناك استراتيجية راسخة لتحديد الآلية الجزيئية وهي دراسات خلايا عضلة القلب المعزولة ، والتي تتطلب خلايا عضلية قلبية عالية الجودة لتحقيق بيانات موثوقة. التجارب الخلوية والجزيئية التي أجريت على خلايا عضلة القلب لتحديد آلية العمل هي المعيار الذهبي للتحقيق في الانكماش1 ، الفيزيولوجيا الكهربية2 ، الكالسيوم (Ca 2+) ركوب الدراجات3 ، الشعيرات العضلية حساسية الكالسيوم2+ 4 ، الهيكل الخلوي5 ، التمثيل الغذائي6 ، تأثيرات الهرمونات7 ، جزيئات الإشارة8 ، دراسات الأدوية9 الخ. أصبح الفأر هو النوع المفضل لمعظم تجارب بيولوجيا القلب نظرا لسهولة التلاعب الجيني ، وصغر حجمه ، وعمره القصير نسبيا ، وتكلفته المنخفضة ، وما إلى ذلك10. ومع ذلك ، فإن العزلة الموثوقة لخلايا عضلة القلب عالية الجودة للفأر ليست تافهة مع التقنيات الحالية.
تقوم المختبرات بعزل خلايا عضلة القلب منذ ما يقرب من 70 عاما11. تعتمد جميع تقنيات عزل خلايا عضلة القلب تقريبا على هضم القلب عبر إنزيمات مختلفة (كولاجيناز ، بروتياز ، تربسين ، إلخ). في الفترات المبكرة (خمسينيات القرن العشرين-ستينيات القرن العشرين) ، تم استخدام طريقة قطعة ، والتي تضمنت إزالة القلب ، وقطع إلى قطع أصغر بكثير واحتضان في محلول مع كولاجيناز / بروتياز / تربسين12. في سبعينيات القرن العشرين نفذت مختبرات "Langendorff" المحسن طريقة13 ، والتي عزل خلايا عضلة القلب باستخدام تقنية العزل القائمة على نضح الشريان التاجي (التروية الرجعية مع الإنزيم عبر جهاز Langendorff) ؛ لا تزال هذه التقنية هي الطريقة السائدة لعزل الخلايا العضلية في الحقل اليوم ، ~ بعد 50 عاما14،15،16. تحول العمل الأخير إلى تقليب القلب في الجسم الحي للحد من وقت نقص الأكسجة والضرر الإقفاري مما أدى إلى عزلة فائقة لعضلة القلب (غلة أفضل وجودة أعلى)17. في الآونة الأخيرة ، تطور هذا إلى أداء في الجسم الحي ، نضح القلب الخالي من لانجيندورف18،19،20،21،22. لقد طورنا تقنية عزل خلايا عضلة القلب الخالية من Langendorff بناء على تقنية Ackers-Johnson et al.18 وقمنا بتكييف مكونات مختلفة من العديد من تقنيات العزل السابقة. تشمل هذه التعديلات الرئيسية حقن مخزن مؤقت لإزالة الجليد البارد ودمج منصة داعمة لتثبيت الإبرة ، مما يسمح بتقليل التلاعب بالقلب. كما تم تفصيل هذه التقنية التحكم في درجة حرارة المخازن المؤقتة المحقونة (37 درجة مئوية) ، مما قلل من الوقت بين الحقن في الجسم الحي والهضم بسبب قلة تروية EDTA كما تم نشرهسابقا 18. عن طريق تقليل التلاعب بالقلب وبالتالي تقليل حجم موقع البزل ، يتم الحصول على نضح شامل ومستمر للشرايين التاجية. قمنا أيضا بتحسين التقنية باستخدام طريقة هضم قطعة ثانوية ، وكمية EDTA في المخزن المؤقت للتطهير المحقون ، وتغيير درجة الحموضة. تقنيتنا الموصوفة أكثر موثوقية وأكثر كفاءة ولا تتطلب تدريبا / ممارسة مكثفة مقارنة باستخدام جهاز Langendorff (الجدول 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

إن الحاجة إلى طرق قابلة للتكرار ولكنها بسيطة تقنيا تنتج خلايا عضلية قلبية عالية الجودة أمر ضروري للبحث في بيولوجيا القلب. التجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية (على سبيل المثال ، الانكماش ، الفيزيولوجيا الكهربية ، دورة الكالسيوم ، إلخ) على خلايا عضلة القلب هي المعيار الذهبي لإنشاء آلية (آليات) المرض. الفأر هو النوع المفضل للتجارب الوظيفية والتقنية الموصوفة مخصصة لعزل خلايا عضلة القلب في الفأر. تتطلب الطرق السابقة التي تتطلب جهاز Langendorff مستويات عالية من التدريب والدقة لقنية الأبهر ، مما يؤدي غالبا إلى نقص التروية. يتحول المجال نحو طرق عزل خالية من Langendorff بسيطة وقابلة للتكرار وتنتج خلايا عضلية قابلة للحياة للحصول على البيانات الفسيولوجية والثقافة. تقلل هذه الطرق بشكل كبير من وقت نقص التروية مقارنة بقنية الأبهر وتؤدي إلى خلايا عضلة القلب التي يتم الحصول عليها بشكل موثوق. يتضمن تكيفنا مع طريقة Langendorff-free التروية الأولية بمحلول إزالة الثلج البارد ، واستخدام منصة تثبيت تضمن إبرة ثابتة أثناء التروية ، وخطوات هضم إضافية لضمان الحصول على خلايا عضلة القلب بشكل موثوق لاستخدامها في القياسات الوظيفية والثقافة. هذه الطريقة بسيطة وسريعة الأداء وتتطلب القليل من المهارة الفنية.

هناك بعض العناصر التي يجب فحصها عند تحديد نجاح العزلة. أولا، يجب أن تكون الخلايا العضلية القلبية على شكل قضيب بدون فقاعات غشائية، مثل الخلايا المعزولة في الشكل 1. سينتج عن العزلة النموذجية ~ 80٪ من الخلايا العضلية على شكل قضيب. إذا كانت العزلة تنتج أي شيء أقل من 50٪ من الخلايا ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

المعيار الذهبي في أمراض القلب للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية هي خلايا عضلة القلب. توضح هذه المقالة التكيفات مع تقنية غير Langendorff لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران.

طريقة بسيطة وفعالة لعزل خلايا عضلة القلب في الفئران باستمرار

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

هذه التقنية أكثر موثوقية وكفاءة ولا تتطلب ممارسة أو تدريبا مكثفا مقارنة بتقنيات أجهزة Langendorff الأكثر استخداما. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها تحد من الوقت الإقفاري لأن التروية الأولية تحدث في الجسم الحي. أثناء تنفيذ هذه التقنية ، من الضروري تجنب الفقاعات في المشعب وتجنب الحركة المفرطة للقلب أثناء الهضم ، يمكن أن تقلل من الغلة.ستوضح هذه التقنية سارة ستورجيل ، طالبة دراسات عليا في مختبر الدكتور مارك زيولو. ابدأ بتنظيف المشعب الذي يتم التحكم في درجة حرارته باستخدام مخزن التروية المحضر حديثا. للقيام بذلك ، قم بربط إبرة قياس 27 ومسح الفقاعات باستخدام موصل قفل luer.تأكد من عدم بقاء فقاعات. لعزل عضلة القلب ، فضح عظم الفأر المخدر بالكامل ، والجانبي إلى خط الوسط ، وقطع بالقرب من الأضلاع والإبط. ثم قطع الحجاب الحاجز ، وضمان الجروح الضحلة لتجنب القلب.المشبك القص مع مرقئ وطي الأضلاع للخلف لفضح التجويف الصدري. قم بإزالة التامور من القلب برفق قبل قطع الوريد الأجوف السفلي البعيد عن القلب مباشرة. احقن ثلاثة ملليلتر من محلول إزالة الثلج البارد في البطين الأيمن للقلب على مدار دقيقة واحدة باستخدام إبرة قياس 27.بعد ذلك ، امسك القلب باستخدام الملقط. اسحبه بعيدا عن الجسم واكشف أكبر قدر ممكن من الشريان الأورطي. ثم المشبك الشريان الأورطي الصاعد باستخدام مرقئ واستئصال القلب.انقل القلب المثبت بسرعة إلى غطاء طبق بتري من مادة البولي بروبيلين يحتوي على 10 ملليلتر من محلول التروية الدافئ. ضع القلب المثبت في المنصة الداعمة وحقن 10 ملليلتر من محلول التروية الذي يتم التحكم في درجة حرارته عند 37 درجة مئوية في البطين الأيسر على مدار خمس دقائق باستخدام إبرة قياس 27 مثبتة متصلة بالمشعب. بعد ذلك ، انقل القلب المثبت والمنصة الداعمة إلى طبق بتري مع ما يقرب من خمسة ملليلتر من محلول الهضم.تبادل محاقن الإدخال لحقنة 50 ملليلتر تحتوي على 25 ملليلتر من الهضم العازلة. قم بإزالة المشعب من أي فقاعات ومخزن التروية المتبقي قبل الحقن. استبدل الإبرة بعناية في نفس موضع الإبرة في قمة البطين الأيسر.بمساعدة مضخة التروية ، قم بحقن 37 درجة مئوية من محلول الهضم في البطين الأيسر لمدة 15 دقيقة باستخدام حقنة سعة 50 ملليلتر. تحكم في درجة حرارة المحلول باستخدام سترة مائية تمت معايرتها لإخراج محلول 37 درجة مئوية. أخرج البطينين من الأذينين قبل نقلهما إلى كأس زجاجية سعة 10 ملليلترات.أضف ثلاثة ملليلترات من محلول الهضم إلى الدورق وقطع البطينين إلى قطع كبيرة باستخدام مقص حاد. غطي الدورق بورق الألمنيوم وضعيه في حمام مائي مسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد التخلص من المادة الطافية ، أعد تعليق قطع الأنسجة في ثلاثة ملليلتر من محلول الهضم وسحنها لمدة أربع دقائق تقريبا أو حتى يتم تحقيق خليط متجانس.بمجرد الانتهاء من ذلك ، قم بتصفية الخلايا في أنبوب بولي بروبيلين سعة 50 ملليلتر باستخدام مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرومتر. اغسل مصفاة خلايا النايلون بثلاثة ملليلتر من محلول الهضم. أعد المرشح إلى أنبوب بولي بروبيلين دائري القاع سعة 14 ملليلتر وجهاز طرد مركزي.تخلص من المادة الطافية قبل تعليق الحبيبات في ثلاثة ملليلتر من المخزن المؤقت للتوقف. إلى تعليق الخلية ، أضف 54 ميكرولترا من مخزون كلوريد الكالسيوم 100 ملليمولار لجعل تركيز كلوريد الكالسيوم النهائي 1.8 مليمولار. دع الخلايا الحية تستقر لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية التي تحتوي على خلايا ميتة.بعد تعليق الحبيبات في محلول التخزين ، يمكن استخدام الخلايا للتجارب الوظيفية والثقافات. أظهرت صور مجهر برايتفيلد للخلايا المعزولة أن عزل خلايا عضلة القلب في الفئران أنتج خلايا هادئة على شكل قضيب بدون فقاعات غشائية أو حواف مستديرة. أظهرت الخلايا ما يقرب من 80 ٪ من العائد ومعدلات البقاء على قيد الحياة عالية تحدد نجاح تقنية العزل.للعزل الناجح ، من المهم للغاية إزالة الفقاعات من المشعب وإدخال الإبرة في نفس الفتحة في القلب. بمجرد عزلها ، يمكن استخدام الخلايا العضلية القلبية للتجارب الوظيفية الخلوية والجزيئية.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

نموذج من تصلب الشرايين الناتج عن تدفق ديستيربد في الشريان السباتي الماوس بواسطة الربط الجزئي وطريقة بسيطة لعزل الحمض النووي الريبي من بطانة الشريان السباتي

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

برغي دليل بسيط أسلوب للدراسات طعم أجنبي داخل الجمجمة في الفئران

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

طريقة بسيطة لتركيب الانبوبة الرئة ماوس

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

وهناك طريقة الهطول معدلة لعزل البولية Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

بسيطة الحرجة الحجم فخذي عيب النموذجي في الفئران

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

جهاز بسيط للتحضير السريع الجبال الجامعة للماوس الأمعاء

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

إجراء ميكانيكي بسيط لإنشاء الحوفي نقص الخلايا الجذعية في الفأر

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

ضخ قناة البنكرياس: طريقة فعالة وانتقائية من المخدرات والتسليم الفيروسي

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

التصوير بالموجات فوق الصوتية ثلاثية الأبعاد: مورفوميتري سريعة وفعالة من حيث التكلفة لانسجة العضلات والعظام

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...