Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) en T32 HL134616 (Sturgill en Salyer).

Alle procedures die in deze studie werden uitgevoerd, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee aan de Ohio State University in overeenstemming met de NIH-richtlijnen.
1. Bereiding van de oplossing
OPMERKING: Zie tabel 2 voor bufferconcentraties.
<ol><li>Pre-isolatie (tot 2 weken voor myocytenisolatie)<ol><li>Perfusiebufferbasis: Bereid 1 L perfusiebufferbasis (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, Glucose en...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Het belangrijkste voordeel van onze Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek is dat het hypoxie en ischemische tijd beperkt door geen cannulatie naar een Langendorff-apparaat te vereisen. Als alternatief voor klassieke Langendorff-technieken die enkele minuten nodig hebben om het hart te verwijderen, te reinigen en op te hangen, wat vaak resulteert in ischemische schade aan de myocyt, omvat onze methode een in vivo zuivering van bloed via een ijskoude reinigingsoplossing. De ijskoude zuiveringsb...

Al tientallen jaren is een essentieel idee in de hartbiologieliteratuur het moleculaire werkingsmechanisme. Het werkingsmechanisme moet worden vastgesteld om betrouwbare studies te kunnen publiceren. Een gevestigde strategie om het moleculaire mechanisme te bepalen is geïsoleerde cardiomyocytenstudies, die cardiomyocyten van hoge kwaliteit vereisen voor het verkrijgen van betrouwbare gegevens. Cellulaire en moleculaire experimenten uitgevoerd op cardiomyocyten om het werkingsmechanisme te bepalen zijn de gouden standaard voor het onderzoeken van contractie1, elektrofysiologie2, calcium (Ca 2+) cyclus3, myofilament Ca2+ gevoeligheid4, cytoskelet5, metabolisme6, effecten van hormonen7, signaalmoleculen8, geneesmiddelenstudies9 enz. De muis is de voorkeurssoort geworden voor de meeste hartbiologische experimenten vanwege het gemak van genetische manipulatie, zijn kleine formaat, zijn relatief korte levensduur, lage kosten, enz.10. De betrouwbare isolatie van hoogwaardige cardiomyocyten van muizen is echter niet triviaal met de huidige technieken.
Labs isoleren cardiomyocyten al bijna 70 jaar11. Vrijwel alle technieken om cardiomyocyten te isoleren zijn afhankelijk van de vertering van het hart via verschillende enzymen (collagenase, protease, trypsine, enz.). In de vroege perioden (jaren 1950-1960) werd de brokmethode gebruikt, waarbij het hart werd verwijderd, in veel kleinere stukjes werd gesneden en in oplossing werd geïncubeerd met collagenase / protease / trypsine12. In de jaren 1970 implementeerden laboratoria de verbeterde "Langendorff" -methode13, die cardiomyocyten isoleerde met behulp van een op coronaire perfusie gebaseerde isolatietechniek (retrograde perfusie met enzym via het Langendorff-apparaat); Deze techniek blijft de dominante methode van myocytenisolatie in het veld vandaag, ~50 jaar later14,15,16. Recent werk is verschoven naar het in vivo cannuleren van het hart om de hypoxietijd en ischemische schade te beperken, wat resulteert in superieure cardiomyocytenisolaties (betere opbrengsten en hogere kwaliteit)17. Onlangs is dit geëvolueerd naar het uitvoeren van in vivo, Langendorff-vrije hartperfusies 18,19,20,21,22. We hebben de Langendorff-vrije cardiomyocytenisolatietechniek ontwikkeld op basis van de Ackers-Johnson et al.18-techniek en verschillende componenten aangepast van de vele eerdere isolatietechnieken. Deze belangrijke aanpassingen omvatten de injectie van een ijskoude opruimbuffer en de integratie van een ondersteunend platform om de naald te stabiliseren, waardoor minder manipulatie van het hart mogelijk is. Ook gedetailleerd in deze techniek is temperatuurregeling van geïnjecteerde buffers (37 °C), die de tijd tussen in vivo injectie en spijsvertering verkortte als gevolg van minder EDTA-perfusie zoals eerder gepubliceerd18. Door manipulatie van het hart te verminderen en daardoor de grootte van de punctieplaats te minimaliseren, wordt een grondige en constante perfusie van de kransslagaders verkregen. We verfijnden de techniek ook met een secundaire brokmethode vertering, de hoeveelheid EDTA in de geïnjecteerde clearingbuffer en veranderden de pH. Onze beschreven techniek is betrouwbaarder, efficiënter en vereist niet de uitgebreide training / oefening in vergelijking met het gebruik van het Langendorff-apparaat (tabel 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

De behoefte aan reproduceerbare maar technisch eenvoudige methoden die hoogwaardige cardiomyocyten opleveren, is essentieel voor onderzoek in de hartbiologie. Cellulaire en moleculaire functionele experimenten (bijv. Contractie, elektrofysiologie, calciumcyclus, enz.) op cardiomyocyten zijn de gouden standaard voor het vaststellen van mechanismen van ziekte. De muis is de soort bij uitstek voor functionele experimenten en de beschreven techniek is specifiek voor de isolatie van cardiomyocyten van muizen. Eerdere methoden die een Langendorff-apparaat vereisen, vereisen een hoge mate van training en precisie voor aorta-cannulatie, wat vaak resulteert in ischemie. Het veld verschuift naar Langendorff-vrije isolatiemethoden die eenvoudig zijn, reproduceerbaar zijn en levensvatbare myocyten opleveren voor fysiologische gegevensverzameling en cultuur. Deze methoden verminderen de ischemietijd aanzienlijk in vergelijking met aortacannulatie en resulteren in betrouwbaar verkregen cardiomyocyten. Onze aanpassing aan de Langendorff-vrije methode omvat een eerste perfusie met ijskoude reinigingsoplossing, het gebruik van een stabiliserend platform dat zorgt voor een stabiele naald tijdens perfusie en extra verteringsstappen om betrouwbaar verkregen cardiomyocyten te garanderen voor gebruik in functionele metingen en cultuur. Deze methode is eenvoudig en snel uit te voeren en vereist weinig technische vaardigheid.

Er zijn een paar elementen om te onderzoeken bij het bepalen van het succes van een isolatie. Ten eerste moeten de cardiomyocyten staafvormig zijn zonder membraanblebs, zoals de cellen geïsoleerd in figuur 1. Een typische isolatie levert ~80% op van de myocyten die staafvormig zijn. Als de isolatie iets minder dan 50% staafvormige cellen oplevert, wordt het beschouwd als een mislukte isolatie en worden cardiomyocyten niet gebruikt. Ten slotte moeten de cardiomyocyten rustig zijn. Spontane s...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

De gouden standaard in de cardiologie voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten zijn cardiomyocyten. Dit artikel beschrijft aanpassingen aan de niet-Langendorff-techniek om cardiomyocyten bij muizen te isoleren.

Een eenvoudige en effectieve methode om cardiomyocyten van muizen consequent te isoleren

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Deze techniek is betrouwbaarder en efficiënter en vereist geen uitgebreide oefening of training in vergelijking met de meest gebruikte Langendorff-apparaattechnieken. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de ischemische tijd beperkt, omdat de initiële perfusie in vivo plaatsvindt. Tijdens het uitvoeren van deze techniek is het essentieel om bubbels in het spruitstuk te vermijden en overmatige beweging van het hart tijdens de spijsvertering te voorkomen, deze kunnen de opbrengst verminderen.Sarah Sturgill, een afgestudeerde student in het laboratorium van Dr. Mark Ziolo, demonstreert deze techniek en zal deze techniek demonstreren. Begin met het opruimen van het temperatuurgeregelde spruitstuk met behulp van vers bereide perfusiebuffer. Om dit te doen, schroeft u een naald van 27 gauge in en verwijdert u de bellen met behulp van een luer lock-connector.Zorg ervoor dat er geen bubbels achterblijven. Om de cardiomyocyt te isoleren, stelt u het borstbeen van de volledig verdoofde muis bloot en lateraal naar de middellijn, snijdt proximaal door de ribben en naar de oksel. Snijd vervolgens door het middenrif en zorg voor ondiepe sneden om het hart te vermijden.Klem het borstbeen vast met een hemostat en vouw de ribben naar achteren om de borstholte bloot te leggen. Verwijder het hartzakje voorzichtig uit het hart voordat u de inferieure vena cava onmiddellijk distaal van het hart doorsnijdt. Injecteer drie milliliter ijskoude opruimbuffer in de rechterkamer van het hart gedurende één minuut met behulp van een naald van 27 gauge.Houd vervolgens het hart vast met een pincet. Trek het weg van het lichaam en stel zoveel mogelijk van de aorta bloot. Klem vervolgens de opgaande aorta vast met behulp van een hemostat en snijd het hart weg.Breng het geklemde hart snel over naar het deksel van een polypropyleen petrischaaltje met 10 milliliter warme perfusiebuffer. Plaats het geklemde hart in het ondersteunende platform en injecteer 10 milliliter temperatuurgecontroleerde perfusiebuffer bij 37 graden Celsius in de linker ventrikel gedurende vijf minuten met behulp van een gestabiliseerde naald van 27 gauge die aan het spruitstuk is bevestigd. Breng vervolgens het geklemde hart en het ondersteunende platform over naar een petrischaal met ongeveer vijf milliliter verteringsbuffer.Wissel invoerspuiten in voor een spuit van 50 milliliter met 25 milliliter verteringsbuffer. Verwijder het spruitstuk van eventuele bubbels en de resterende perfusiebuffer vóór injectie. Vervang de naald voorzichtig in dezelfde naaldpositie in de linkerventrikeltop.Injecteer met behulp van een perfusiepomp de verteringsbuffer van 37 graden Celsius gedurende 15 minuten in de linkerkamer met behulp van een spuit van 50 milliliter. Regel de temperatuur van de oplossing met een watermantel gekalibreerd om de oplossing van 37 graden Celsius uit te werpen. Verwijder de ventrikels uit de boezems voordat u ze overbrengt naar een bekerglas van 10 milliliter.Voeg drie milliliter verteringsbuffer toe aan het bekerglas en snijd de ventrikels in grote stukken met een scherpe schaar. Bedek het bekerglas met aluminiumfolie en plaats het gedurende vijf minuten in een schudwaterbad voorverwarmd tot 37 graden Celsius. Na het weggooien van het supernatant, resuspensie de weefselbrokken in drie milliliter verteringsbuffer en trituleer het gedurende ongeveer vier minuten of totdat een homogeen mengsel is bereikt.Als u klaar bent, filtert u de cellen in een polypropyleenbuis van 50 milliliter met behulp van een 70 micrometer nyloncelzeef. Was nylon celzeef met drie milliliter verteringsbuffer. Breng het filtraat terug naar een polypropyleenbuis met ronde bodem van 14 milliliter en centrifugeer het.Gooi het supernatant weg voordat u de pellet opnieuw in drie milliliter stopbuffer plaatst. Voeg aan de celsuspensie 54 microliter 100 millimolaire calciumchloridevoorraad toe om de uiteindelijke calciumchlorideconcentratie 1,8 millimolair te maken. Laat de levende cellen 10 minuten bezinken en verwijder het supernatant met dode cellen.Na het opnieuw suspenderen van de pellet in een opslagoplossing, kunnen de cellen worden gebruikt voor functionele experimenten en culturen. Brightfield-microscoopbeelden van geïsoleerde cellen toonden aan dat de isolatie van cardiomyocyten van muizen staafvormige rustcellen produceerde zonder membraanblebs of afgeronde randen. De cellen vertoonden ongeveer 80% opbrengst en hoge overlevingskansen die het succes van de isolatietechniek bepaalden.Voor een succesvolle isolatie is het het belangrijkst om de bellen uit het spruitstuk te verwijderen en de naald in hetzelfde gat in het hart te steken. Eenmaal geïsoleerd, kunnen de cardiomyocyten worden gebruikt voor cellulaire en moleculaire functionele experimenten.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Een model van Disturbed Flow-geïnduceerde atherosclerose in Muis halsslagader op een gedeelte van ligatie en een eenvoudige methode van RNA isolatie van carotis Endotheel

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Een eenvoudige methode van de Muis van Lung intubatie

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Een gemodificeerde precipitatiewerkwijze isoleren Urinary exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

A Simple Kritische-sized Femorale Defect Model in Muizen

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Een eenvoudig apparaat om snel te bereiden Whole Bergen van de muis Darm

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Een eenvoudige mechanische Procedure aanmaken Limbale Stem Cell Deficiency in Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Pancreas duct infusie: een effectieve en selectieve methode van drug en virale levering

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D echografie Imaging: snelle en rendabele Morphometry van Musculoskeletal Tissue

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...