Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) ו- T32 HL134616 (Sturgill and Salyer).

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אוהיו בהתאם להנחיות NIH.
1. הכנת פתרון
הערה: ראה טבלה 2 עבור ריכוזי חיץ.
<ol><li>טרום בידוד (עד שבועיים לפני בידוד מיוציטים)<ol><li>בסיס חיץ זילוח: הכינו 1 ליט?...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

היתרון העיקרי של טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף שלנו הוא שהיא מגבילה את זמן ההיפוקסיה והאיסכמי בכך שאינה דורשת קנולציה למכשיר לנגנדורף. לחילופין, בדומה לטכניקות לנגנדורף הקלאסיות שלוקח מספר דקות להסיר, לנקות ולתלות את הלב, מה שגורם לעיתים קרובות לנזק איסכמי למיוציטים, השיטה שלנ...

במשך עשרות שנים, רעיון חיוני בספרות הביולוגיה של הלב הוא מנגנון הפעולה המולקולרי. יש להקים מנגנון פעולה על מנת לפרסם מחקרים מהימנים. אסטרטגיה מבוססת היטב לקביעת מנגנון מולקולרי היא מחקרי קרדיומיוציטים מבודדים, הדורשים קרדיומיוציטים באיכות גבוהה להשגת נתונים אמינים. ניסויים תאיים ומולקולריים המבוצעים על קרדיומיוציטים לקביעת מנגנון פעולה הם תקן הזהב לחקר התכווצות1, אלקטרופיזיולוגיה2, סידן (Ca 2+) מחזור3, מיופילמנט Ca2+ רגישות4, שלד ציטו-שלד5, מטבוליזם6, השפעות הורמונים7, מולקולות איתות8, מחקרי תרופות9 וכו. העכבר הפך למין המועדף על רוב הניסויים בביולוגיה של הלב בשל קלות המניפולציה הגנטית, גודלו הקטן, תוחלת החיים הקצרה יחסית שלו, עלותו הנמוכה וכו '10. עם זאת, בידוד אמין של קרדיומיוציטים עכבר באיכות גבוהה אינו טריוויאלי עם הטכניקות הנוכחיות.
מעבדות מבודדות קרדיומיוציטים כבר כמעט 70 שנה11. כמעט כל הטכניקות לבידוד קרדיומיוציטים מסתמכות על עיכול הלב באמצעות אנזימים שונים (קולגנאז, פרוטאז, טריפסין וכו '). בתקופות המוקדמות (שנות ה-50 עד שנות ה-60) נעשה שימוש בשיטת הגוש, שכללה הוצאת הלב, חיתוך לחתיכות קטנות בהרבה ודגירת תמיסה עם קולגנאז/פרוטאז/טריפסין12. בשנות ה-70 יישמו המעבדות את שיטת "לנגנדורף"13, שבודדה קרדיומיוציטים באמצעות טכניקת בידוד מבוססת זילוח של העורקים הכליליים (זילוח מדרדר עם אנזים באמצעות מנגנון לנגנדורף); טכניקה זו נותרה השיטה השלטת לבידוד מיוציטים בתחום כיום, ~50 שנה מאוחר יותר14,15,16. העבודה האחרונה עברה לשימורי הלב in vivo כדי להגביל את זמן ההיפוקסיה ואת הנזק האיסכמי וכתוצאה מכך בידודי קרדיומיוציטים מעולים (יבולים טובים יותר ואיכות גבוהה יותר)17. לאחרונה, זה התפתח לביצוע in vivo, זילוח לב ללא לנגנדורף 18,19,20,21,22. פיתחנו את טכניקת בידוד קרדיומיוציטים ללא לנגנדורף המבוססת על טכניקת Ackers-Johnson et al.18 והתאמנו רכיבים שונים מטכניקות בידוד קודמות רבות. התאמות מפתח אלה כוללות הזרקה של חיץ ניקוי קר כקרח ושילוב של פלטפורמה תומכת כדי לייצב את המחט, המאפשר מניפולציה מופחתת של הלב. כמו כן מפורט בטכניקה זו בקרת טמפרטורה של חוצצים מוזרקים (37 מעלות צלזיוס), אשר הפחית את הזמן בין הזרקת in vivo לעיכול עקב פחות זילוח EDTA כפי שפורסם בעבר18. על ידי הפחתת מניפולציה של הלב ולכן מזעור גודל אתר לנקב, זילוח יסודי ומתמיד של העורקים הכליליים מתקבל. כמו כן, שיפרנו את הטכניקה עם עיכול בשיטת נתח משני, כמות ה-EDTA במאגר הניקוי המוזרק, ושינינו את רמת החומציות. הטכניקה המתוארת שלנו אמינה יותר, יעילה יותר, ואינה דורשת הכשרה/תרגול נרחב בהשוואה לשימוש במכשיר לנגנדורף (טבלה 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

הצורך בשיטות ניתנות לשחזור אך פשוטות מבחינה טכנית המניבות קרדיומיוציטים באיכות גבוהה חיוני למחקר בביולוגיה של הלב. ניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים (למשל, התכווצות, אלקטרופיזיולוגיה, מחזור סידן וכו ') על קרדיומיוציטים הם תקן הזהב לביסוס מנגנונים של מחלות. העכבר הוא המין המועדף לניסויים פונקציונליים והטכניקה המתוארת היא במיוחד לבידוד קרדיומיוציטים של עכבר. שיטות קודמות הדורשות מכשיר לנגנדורף דורשות רמות גבוהות של אימון ודיוק עבור קנולציה אבי העורקים, לעתים קרובות לגרום איסכמיה. התחום עובר לשיטות בידוד נטולות לנגנדורף שהן פשוטות, ניתנות לשכפול ומניבות מיוציטים בני קיימא לרכישת נתונים פיזיולוגיים ולתרבית. שיטות אלה מפחיתות מאוד את זמן האיסכמיה בהשוואה לקנולציה של אבי העורקים וגורמות לקרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין. ההתאמה שלנו לשיטה נטולת לנגנדורף כוללת זילוח ראשוני עם תמיסת ניקוי קרה כקרח, שימוש בפלטפורמה מייצבת המבטיחה מחט יציבה במהלך הזילוח, ושלבי עיכול נוספים כדי להבטיח קרדיומיוציטים המתקבלים באופן אמין לשימוש במדידות תפקודיות ובתרבית. שיטה זו פשוטה ומהירה לביצוע ודורשת מיומנות טכנית מועטה.

ישנם מספר אלמנטים שיש לבחון בעת קביעת הצלחת הבידוד. ראשית, הקרדיומיוציטים חייבים להיות בצורת מוט ללא כתמים בממברנה, כמו התאים שבודדו באיור 1. בידוד טיפוסי יניב ~80% מהמיוציטים בצורת מוט. אם הבידוד מניב משהו פחות מ 50% תאים בצורת מוט, אז זה נחשב בידוד לא מוצלח קרדיומיוציטים אינם ...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

תקן הזהב בקרדיולוגיה לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים הוא קרדיומיוציטים. מאמר זה מתאר התאמות לטכניקה שאינה לנגנדורף לבידוד קרדיומיוציטים של עכברים.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

טכניקה זו אמינה ויעילה יותר ואינה דורשת תרגול או הכשרה נרחבים בהשוואה לטכניקות הנפוצות ביותר של מנגנון לנגנדורף. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מגבילה את הזמן האיסכמי מאז הזילוח הראשוני מתרחשת in vivo. בעת ביצוע טכניקה זו, זה חיוני כדי למנוע בועות בסעפת וכדי למנוע תנועה מוגזמת של הלב במהלך העיכול, אלה יכולים להקטין את התשואה.תדגים טכניקה זו שרה סטורג'יל, סטודנטית לתואר שני במעבדתו של ד"ר מארק זיולו. התחל עם ניקוי סעפת הטמפרטורה מבוקרת באמצעות חיץ זילוח טרי שהוכן. לשם כך, הברג במחט 27 מד ונקה את הבועות באמצעות מחבר נעילת luer.ודא שלא נותרו בועות. כדי לבודד את cardiomyocyte, לחשוף את עצם החזה של העכבר מורדם לחלוטין, לרוחב לקו האמצע, לחתוך בסמיכות דרך הצלעות אל בית השחי. ואז לחתוך דרך הסרעפת, הבטחת חתכים רדודים כדי למנוע את הלב.מהדקים את עצם החזה עם hemostat ומקפלים את הצלעות לאחור כדי לחשוף את חלל בית החזה. הסר את קרום הלב מהלב בעדינות לפני חיתוך דרך הווריד קאווה התחתון מיד דיסטלי ללב. הזריקו שלושה מיליליטר של חיץ ניקוי קר כקרח לחדר הימני של הלב במשך דקה אחת באמצעות מחט 27 מד.לאחר מכן, להחזיק את הלב באמצעות פינצטה. משכו אותו מהגוף וחשפו כמה שיותר מאבי העורקים. לאחר מכן מהדקים את אבי העורקים העולה באמצעות hemostat ו הבלו את הלב.העבר במהירות את הלב המהודק למכסה של צלחת פטרי פוליפרופילן המכילה 10 מיליליטר של חיץ זילוח חם. הכניסו את הלב המהודק לפלטפורמה התומכת והזריקו 10 מיליליטר של חיץ זילוח מבוקר טמפרטורה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי במשך חמש דקות באמצעות מחט 27 מד מיוצבת המחוברת לסעפת. לאחר מכן, העבירו את הלב המהודק ואת המצע התומך לצלחת פטרי עם כחמישה מיליליטר של חיץ עיכול.החלפת מזרקי קלט במזרק 50 מיליליטר המכיל 25 מיליליטר חיץ עיכול. נקה את הסעפת של כל הבועות ואת חיץ הזילוח שנותר לפני ההזרקה. החלף בזהירות את המחט לאותו מיקום מחט בקודקוד החדר השמאלי.בעזרת משאבת זילוח, הזריקו חיץ עיכול של 37 מעלות צלזיוס לחדר השמאלי למשך 15 דקות באמצעות מזרק 50 מיליליטר. שלוט בטמפרטורת התמיסה באמצעות מעיל מים המכויל לפלוט תמיסת 37 מעלות צלזיוס. מוציאים את החדרים מהאטריה לפני שמעבירים אותם לכוס של 10 מיליליטר.מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ עיכול לכד וחותכים את החדרים לגושים גדולים בעזרת מספריים חדים. מכסים את הכד ברדיד אלומיניום ומניחים אותו באמבט מים מטלטל שחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, משעים מחדש את גושי הרקמה בשלושה מיליליטר של חיץ העיכול ומטריאים אותו במשך כארבע דקות או עד לקבלת תערובת הומוגנית.לאחר שתסיים, סנן את התאים לתוך צינור פוליפרופילן 50 מיליליטר באמצעות מסננת תאי ניילון 70 מיקרומטר. לשטוף מסננת תא ניילון עם שלושה מיליליטר של חיץ העיכול. מחזירים את התסנין לצינור פוליפרופילן תחתון עגול בקוטר 14 מיליליטר וצנטריפוגות אותו.השליכו את הסופרנאטנט לפני שתשהו מחדש את הגלולה בשלושה מיליליטר של חיץ עצירה. לתרחיף התא, הוסף 54 מיקרוליטר של ציר סידן כלורי 100 מילימולרי כדי להפוך את ריכוז הסידן כלורי הסופי ל -1.8 מילימולר. תנו לתאים החיים להסתפק במשך 10 דקות והוציאו את הסופרנאטנט המכיל תאים מתים.לאחר השעיה מחדש של הגלולה בתמיסת אחסון, התאים יכולים לשמש לניסויים פונקציונליים ותרביות. תמונות מיקרוסקופ ברייטפילד של תאים מבודדים הראו כי הבידוד של קרדיומיוציטים של עכברים יצר תאים שקטים בצורת מוט ללא כתמי קרום או קצוות מעוגלים. התאים הראו תפוקה של כ-80% ושיעורי הישרדות גבוהים שקבעו את הצלחת טכניקת הבידוד.לבידוד מוצלח, חשוב ביותר להסיר את הבועות מהסעפת ולהחדיר את המחט לאותו חור בלב. לאחר הבידוד, הקרדיומיוציטים יכולים לשמש לניסויים פונקציונליים תאיים ומולקולריים.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

המודל של טרשת עורקים Flow-induced מופרע על העורק הראשי עכבר ידי קשירת חלקי שיטה פשוטה של ​​בידוד RNA מן התרדמה האנדותל

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

שיטת ממטרים השתנה לבודד השתן Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

מכשיר פשוט להכין במהירות mounts כל ממעי העכבר

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

עירוי צינור הלבלב: שיטה יעילה וסלקטיבית של סמים ומשלוח ויראלי

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

אולטראסאונד תלת-ממד הדמיה: Morphometry מהירה וחסכונית של רקמת שריר-שלד

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...