Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) e T32 HL134616 (Sturgill e Salyer).

Tutte le procedure eseguite in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Ohio State University in conformità con le linee guida NIH.
1. Preparazione della soluzione
NOTA: vedere la Tabella 2 per le concentrazioni tampone.
<ol><li>Pre-isolamento (fino a 2 settimane prima dell'isolamento dei miociti)<ol><li>Base tampone di perfusione: preparare 1 L di base tampone di perfusione (N...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Il vantaggio principale della nostra tecnica di isolamento cardiomiocitario senza Langendorff è che limita l'ipossia e il tempo ischemico non richiedendo l'incannulamento a un apparato Langendorff. In alternativa alle classiche tecniche Langendorff che richiedono diversi minuti per rimuovere, pulire e appendere il cuore, spesso con conseguente danno ischemico al miocita, il nostro metodo include una pulizia del sangue in vivo tramite una soluzione di pulizia ghiacciata. Il tampone di compensazione ghia...

Per decenni, un'idea essenziale nella letteratura di biologia cardiaca è il meccanismo molecolare d'azione. Il meccanismo d'azione deve essere stabilito al fine di pubblicare studi affidabili. Una strategia consolidata per determinare il meccanismo molecolare sono gli studi isolati sui cardiomiociti, che richiedono cardiomiociti di alta qualità per ottenere dati affidabili. Gli esperimenti cellulari e molecolari eseguiti sui cardiomiociti per determinare il meccanismo d'azione sono il gold standard per studiare la contrazione1, l'elettrofisiologia2, il calcio (Ca 2+) il ciclo3, il miofilamento Ca 2+ la sensibilità4, il citoscheletro 5, il metabolismo 6, gli effetti degli ormoni7, le molecole di segnalazione8, gli studi farmacologici9 and so on. Il topo è diventato la specie di scelta per la maggior parte degli esperimenti di biologia cardiaca a causa della facilità di manipolazione genetica, delle sue piccole dimensioni, della sua durata relativamente breve, del basso costo, ecc10. Tuttavia, l'isolamento affidabile dei cardiomiociti di topo di alta qualità non è banale con le tecniche attuali.
I laboratori hanno isolato cardiomiociti per quasi 70 anni11. Praticamente tutte le tecniche per isolare i cardiomiociti si basano sulla digestione del cuore attraverso vari enzimi (collagenasi, proteasi, tripsina, ecc.). Nei primi periodi (1950-1960), è stato impiegato il metodo del pezzo, che prevedeva la rimozione del cuore, il taglio in pezzi molto più piccoli e l'incubazione in soluzione con collagenasi / proteasi / tripsina12. Nel 1970 i laboratori implementarono il metodo migliorato "Langendorff"13, che isolava i cardiomiociti usando una tecnica di isolamento basata sulla perfusione coronarica (perfusione retrograda con enzima attraverso l'apparato di Langendorff); Questa tecnica rimane il metodo dominante di isolamento dei miociti nel campo oggi, ~ 50 anni dopo14,15,16. Recenti lavori si sono spostati sull'incannulamento del cuore in vivo per limitare il tempo di ipossia e il danno ischemico con conseguente isolamento cardiomiocitario superiore (rese migliori e qualità superiore)17. Recentemente, questo si è evoluto nell'esecuzione in vivo, perfusioni cardiache prive di Langendorff 18,19,20,21,22. Abbiamo sviluppato la tecnica di isolamento dei cardiomiociti liberi da Langendorff basata sulla tecnica Ackers-Johnson et al.18 e adattato vari componenti dalle molte tecniche di isolamento precedenti. Questi adattamenti chiave includono l'iniezione di un tampone di compensazione ghiacciato e l'incorporazione di una piattaforma di supporto per stabilizzare l'ago, consentendo una riduzione della manipolazione del cuore. Anche dettagliato in questa tecnica è il controllo della temperatura dei tamponi iniettati (37 °C), che ha ridotto il tempo tra l'iniezione in vivo e la digestione a causa della minore perfusione EDTA come precedentemente pubblicato18. Diminuendo la manipolazione del cuore e quindi riducendo al minimo le dimensioni del sito di puntura, si ottiene una perfusione completa e costante delle arterie coronarie. Abbiamo anche perfezionato la tecnica con un metodo di digestione secondario a pezzi, la quantità di EDTA nel tampone di compensazione iniettato e cambiato il pH. La nostra tecnica descritta è più affidabile, più efficiente e non richiede l'addestramento / pratica estensiva rispetto all'uso dell'apparato Langendorff (Tabella 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

La necessità di metodi riproducibili ma tecnicamente semplici che producano cardiomiociti di alta qualità è essenziale per la ricerca in biologia cardiaca. Gli esperimenti funzionali cellulari e molecolari (ad esempio, contrazione, elettrofisiologia, ciclo del calcio, ecc.) sui cardiomiociti sono il gold standard per stabilire i meccanismi della malattia. Il topo è la specie di scelta per gli esperimenti funzionali e la tecnica descritta è specifica per l'isolamento dei cardiomiociti del topo. I metodi precedenti che richiedevano un apparato Langendorff richiedono alti livelli di allenamento e precisione per l'incannulamento aortico, spesso con conseguente ischemia. Il campo si sta spostando verso metodi di isolamento privi di Langendorff che sono semplici, sono riproducibili e producono miociti vitali per l'acquisizione e la coltura di dati fisiologici. Questi metodi riducono notevolmente il tempo di ischemia rispetto all'incannulamento aortico e si traducono in cardiomiociti ottenuti in modo affidabile. Il nostro adattamento al metodo Langendorff-free include una perfusione iniziale con soluzione di pulizia ghiacciata, l'uso di una piattaforma stabilizzante che garantisce un ago stabile durante la perfusione e ulteriori fasi di digestione per garantire cardiomiociti ottenuti in modo affidabile per l'uso in misurazioni funzionali e coltura. Questo metodo è semplice e veloce da eseguire e richiede poca abilità tecnica.

Ci sono alcuni elementi da esaminare quando si determina il successo di un isolamento. In primo luogo, i cardiomiociti devono essere a forma di bastoncello senza macchie di membrana, come le cellule isolate nella Figura 1. Un tipico isolamento produrrà ~ 80% dei miociti a forma di bastoncello. Se l'isolamento produce meno del 50% di cellule a forma di bastoncello, allora è considerato un isolamento non riuscito e i cardiomiociti non vengono utilizzati. Infine, i cardiomiociti dovrebbero es...

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A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Il gold standard in cardiologia per esperimenti funzionali cellulari e molecolari sono i cardiomiociti. Questo articolo descrive gli adattamenti alla tecnica non-Langendorff per isolare i cardiomiociti di topo.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Questa tecnica è più affidabile ed efficiente e non richiede una pratica o un addestramento approfonditi rispetto alle tecniche di apparecchi Langendorff più comunemente usate. Il vantaggio principale di questa tecnica è che limita il tempo ischemico poiché la perfusione iniziale avviene in vivo. Durante l'esecuzione di questa tecnica, è essenziale evitare bolle nel collettore e per evitare un eccessivo movimento del cuore durante la digestione, queste possono diminuire la resa.A dimostrare questa tecnica sarà Sarah Sturgill, una studentessa laureata nel laboratorio del Dr.Mark Ziolo. Iniziare con la pulizia del collettore a temperatura controllata utilizzando un tampone di perfusione appena preparato. Per fare ciò, avvitare un ago calibro 27 e rimuovere le bolle utilizzando un connettore luer lock.Assicurati che non rimangano bolle. Per isolare il cardiomiocita, esporre lo sterno del topo completamente anestetizzato, e lateralmente alla linea mediana, tagliare prossimalmente attraverso le costole e all'ascella. Quindi tagliare attraverso il diaframma, assicurando tagli superficiali per evitare il cuore.Bloccare lo sterno con un emostatico e piegare le costole all'indietro per esporre la cavità toracica. Rimuovere delicatamente il pericardio dal cuore prima di tagliare la vena cava inferiore immediatamente distale al cuore. Iniettare tre millilitri di tampone ghiacciato nel ventricolo destro del cuore in un minuto utilizzando un ago da 27 gauge.Quindi, tieni il cuore usando una pinzetta. Tirarlo via dal corpo ed esporre il più possibile l'aorta. Quindi bloccare l'aorta ascendente usando un emostato e asportare il cuore.Trasferire rapidamente il cuore bloccato sul coperchio di una capsula di Petri in polipropilene contenente 10 millilitri di tampone di perfusione calda. Posizionare il cuore bloccato nella piattaforma di supporto e iniettare 10 millilitri di tampone di perfusione a temperatura controllata a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per cinque minuti utilizzando un ago stabilizzato da 27 gauge collegato al collettore. Quindi, trasferire il cuore bloccato e la piattaforma di supporto in una capsula di Petri con circa cinque millilitri di tampone di digestione.Sostituire le siringhe di ingresso con una siringa da 50 millilitri contenente 25 millilitri di tampone di digestione. Eliminare il collettore da eventuali bolle e il tampone di perfusione rimanente prima dell'iniezione. Riposizionare con cautela l'ago nella stessa posizione dell'ago nell'apice ventricolare sinistro.Con l'aiuto di una pompa di perfusione, iniettare tampone di digestione a 37 gradi Celsius nel ventricolo sinistro per 15 minuti utilizzando una siringa da 50 millilitri. Controllare la temperatura della soluzione con una camicia d'acqua calibrata per espellere la soluzione a 37 gradi Celsius. Rimuovere i ventricoli dagli atri prima di trasferirli in un becher da 10 millilitri.Aggiungere tre millilitri di tampone di digestione al becher e tagliare i ventricoli in grandi pezzi usando forbici affilate. Coprire il becher con un foglio di alluminio e metterlo in un bagno d'acqua agitante preriscaldato a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere i pezzi di tessuto in tre millilitri di tampone digestivo e triturarlo per circa quattro minuti o fino a raggiungere una miscela omogenea.Una volta fatto, filtrare le celle in un tubo di polipropilene da 50 millilitri utilizzando un filtro di nylon da 70 micrometri. Lavare il filtro cellulare in nylon con tre millilitri di tampone digestivo. Riportare il filtrato in un tubo di polipropilene con fondo rotondo da 14 millilitri e centrifugarlo.Scartare il surnatante prima di risospendere il pellet in tre millilitri di tampone di arresto. Alla sospensione cellulare, aggiungere 54 microlitri di 100 millimolari di calcio cloruro di calcio per rendere la concentrazione finale di cloruro di calcio 1,8 millimolare. Lasciare riposare le cellule vive per 10 minuti e rimuovere il surnatante contenente cellule morte.Dopo aver risospeso il pellet in una soluzione di stoccaggio, le cellule possono essere utilizzate per esperimenti funzionali e colture. Le immagini al microscopio a campo chiaro di cellule isolate hanno mostrato che l'isolamento dei cardiomiociti di topo produceva cellule quiescenti a forma di bastoncello senza macchie di membrana o bordi arrotondati. Le cellule hanno mostrato una resa di circa l'80% e alti tassi di sopravvivenza che hanno determinato il successo della tecnica di isolamento.Per un isolamento di successo, è molto importante rimuovere le bolle dal collettore e inserire l'ago nello stesso foro nel cuore. Una volta isolati, i cardiomiociti possono essere utilizzati per esperimenti funzionali cellulari e molecolari.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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