Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
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이 작업은 국립 보건원 보조금 R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) 및 T32 HL134616 (Sturgill and Salyer)의 지원을 받았습니다.

이 연구에서 수행된 모든 절차는 NIH 지침에 따라 오하이오 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 용액 준비
참고: 버퍼 농도는 표 2 를 참조하십시오.
<ol><li>사전 격리(근세포 분리 최대 2주 전)<ol><li>관류 완충액 염기: 1L의 초순수 18.2MΩ·cm H 2O에 1L의 관류 완충액 염기(NaCl, KCl, NaH 2PO4, HEPES, ?...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Langendorff-free 심근세포 분리 기술의 주요 장점은 Langendorff 장치에 캐뉼러를 삽입할 필요가 없어 저산소증과 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 심장을 제거, 세척 및 매달아 종종 근세포에 허혈성 손상을 초래하는 고전적인 Langendorff 기법 대신 당사의 방법에는 얼음처럼 차가운 세척 용액을 통한 생체 내 혈액 세척이 포함됩니다. 얼음처럼 차가운 투명 완충액에는 에틸렌디아민테트라...

수십 년 동안 심장 생물학 문헌에서 필수적인 아이디어는 분자 작용 메커니즘입니다. 신뢰할 수 있는 연구를 발표하기 위해서는 행동 메커니즘을 확립해야 합니다. 분자 메커니즘을 결정하기 위한 잘 확립된 전략은 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해 고품질 심근 세포가 필요한 분리된 심근 세포 연구입니다. 작용 기전을 결정하기 위해 심근 세포에서 수행되는 세포 및 분자 실험은 수축1, 전기 생리학2, 칼슘 (Ca2+) 사이클링3, 근섬유 Ca2+ 민감도4, 세포 골격5, 대사6, 호르몬 효과7, 신호 분자8, 약물 연구9를 조사하기 위한 황금 표준이다 등. 마우스는 유전자 조작의 용이성, 작은 크기, 상대적으로 짧은 수명, 저렴한 비용 등으로 인해 대부분의 심장 생물학 실험에서 선택되는 종이 되었습니다10. 그러나 고품질 마우스 심근 세포의 안정적인 분리는 현재 기술로는 간단하지 않습니다.
실험실은 거의 70년 동안 심근 세포를 분리해 왔습니다11. 심근 세포를 분리하는 거의 모든 기술은 다양한 효소 (콜라겐 분해 효소, 프로테아제, 트립신 등)를 통한 심장 소화에 의존합니다. 초기(1950년대-1960년대)에는 심장을 제거하고 훨씬 더 작은 조각으로 자르고 콜라게나제/프로테아제/트립신12와 함께 용액에서 배양하는 청크 방법이 사용되었습니다. 1970년대에 실험실은 관상동맥 관류 기반 격리 기술(Langendorff 장치를 통한 효소로 역행 관류)을 사용하여 심근 세포를 분리하는 개선된 "Langendorff" 방법(13)을 구현했습니다. 이 기술은 ~50년 후인 오늘날에도 현장에서 근세포 분리의 지배적인 방법으로 남아 있습니다14,15,16. 최근 연구는 저산소증 시간과 허혈성 손상을 제한하기 위해 생체 내에서 심장을 캐뉼라화하는 것으로 전환되어 우수한 심근 세포 분리(더 나은 수율 및 더 높은 품질)를 초래했습니다17. 최근에, 이것은 생체 내에서, 랑겐도르프가 없는 심장 관류 18,19,20,21,22를 수행하는 것으로 발전하였다. 우리는 Ackers-Johnson et al.18 기술을 기반으로 Langendorff-free 심근 세포 분리 기술을 발전시켰고 이전의 많은 분리 기술에서 다양한 구성 요소를 채택했습니다. 이러한 주요 적응에는 얼음처럼 차가운 제거 완충액을 주입하고 바늘을 안정화하기 위한 지지 플랫폼을 통합하여 심장 조작을 줄이는 것이 포함됩니다. 또한 이 기술에서 상세히 기술된 것은 주입된 완충액(37°C)의 온도 제어이며, 이는 이전에 발표된 바와 같이 더 적은 EDTA 관류로 인해 생체 내 주입과 소화 사이의 시간을 감소시켰다18. 심장의 조작을 줄이고 천자 부위 크기를 최소화함으로써 관상 동맥의 철저하고 지속적인 관류가 이루어집니다. 우리는 또한 2차 청크 분해법으로 기술을 정제하고, 주입된 투명 완충액 중의 EDTA의 양을 측정하고, pH를 변화시켰다. 설명된 기술은 Langendorff 장치를 사용하는 것에 비해 더 안정적이고 효율적이며 광범위한 교육/실습이 필요하지 않습니다(표 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

고품질 심근 세포를 생성하는 재현 가능하면서도 기술적으로 간단한 방법의 필요성은 심장 생물학 연구에 필수적입니다. 심근 세포에 대한 세포 및 분자 기능 실험(예: 수축, 전기생리학, 칼슘 순환 등)은 질병의 메커니즘을 확립하기 위한 황금 표준입니다. 마우스는 기능 실험을 위해 선택되는 종이며 설명된 기술은 특히 마우스 심근 세포의 분리를 위한 것입니다. Langendorff 장치가 필요한 이전 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입을 위해 높은 수준의 훈련과 정밀도가 필요하며 종종 허혈을 초래합니다. 이 분야는 단순하고 재현 가능하며 생리학적 데이터 수집 및 배양을 위한 생존 가능한 근세포를 생성하는 Langendorff-free 분리 방법으로 이동하고 있습니다. 이러한 방법은 대동맥 캐뉼라 삽입에 비해 허혈 시간을 크게 줄이고 안정적으로 얻은 심근 세포를 생성합니다. Langendorff-free 분석법에 대한 당사의 적응에는 얼음처럼 차가운 투명 용액을 사용한 초기 관류, 관류 중 안정적인 바늘을 보장하는 안정화 플랫폼 사용, 기능 측정 및 배양에 사용하기 위해 안정적으로 얻은 심근 세포를 보장하기 위한 추가 분해 단계가 포함됩니다. 이 방법은 간단하고 빠르게 수행할 수 있으며 기술이 거의 필요하지 않습니다.

격리의 성공 여부를 결정할 때 검토해야 할 몇 가지 요소가 있습니다. 첫째, 심근 세포는 그림 1에서 분리된 세포와 같이 막 기피가 없는 막대 모양이어야 합니다. 전형적인 분리는 근세포의 ~80%가 막대 모양이 됩니다. 분리 결과 막대 모양의 세포가 50% 미만이면 실패한 분리로 간주되며 심근 세포는 사용되지 않습니다. 마지막으로 심근 세포는 정지 상태여야 합니다. 자발적?...

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A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

이 기술은 가장 일반적으로 사용되는 Langendorff 장치 기술에 비해 더 안정적이고 효율적이며 광범위한 연습이나 교육이 필요하지 않습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 내에서 초기 관류가 발생하기 때문에 허혈 시간을 제한한다는 것입니다. 이 기술을 수행하는 동안 매니폴드의 기포를 피하고 소화 중 심장의 과도한 움직임을 피하는 것이 필수적이며, 이는 수율을 감소시킬 수 있습니다.이 기술을 시연하는 것은 Mark Ziolo 박사 연구실의 대학원생 인 Sarah Sturgill이 될 것입니다. 새로 준비된 관류 버퍼를 사용하여 온도 제어 매니폴드를 청소하는 것으로 시작합니다. 이렇게 하려면 27게이지 바늘을 조이고 루어 잠금 커넥터를 사용하여 기포를 제거합니다.기포가 남아 있지 않은지 확인하십시오. 심근 세포를 분리하기 위해 완전히 마취 된 마우스의 흉골을 노출시키고 정중선의 측면으로 갈비뼈와 겨드랑이를 통해 근위부로 자릅니다. 그런 다음 다이어프램을 절단하여 심장을 피하기 위해 얕은 절단을 보장합니다.지혈제로 흉골을 고정하고 갈비뼈를 뒤로 접어 흉강을 노출시킵니다. 심장 바로 원위부에 있는 하대정맥을 절단하기 전에 심장에서 심낭을 부드럽게 제거합니다. 27 게이지 바늘을 사용하여 1 분 동안 3 밀리리터의 얼음 차가운 클리어링 버퍼를 심장의 우심실에 주입합니다.다음으로 핀셋을 사용하여 심장을 잡습니다. 몸에서 떼어내고 가능한 한 많은 대동맥을 노출시킵니다. 그런 다음 지혈제를 사용하여 상행 대동맥을 고정하고 심장을 절제하십시오.클램핑 된 심장을 10 밀리리터의 따뜻한 관류 완충액이 들어있는 폴리 프로필렌 페트리 접시의 뚜껑으로 빠르게 옮깁니다. 클램핑된 심장을 지지 플랫폼에 놓고 매니폴드에 부착된 안정화된 27게이지 바늘을 사용하여 섭씨 37도에서 온도 제어 관류 완충액 10ml를 5분에 걸쳐 좌심실에 주입합니다. 다음으로, 클램핑 된 심장과지지 플랫폼을 약 5 밀리리터의 소화 완충액이있는 페트리 접시로 옮깁니다.입력 주사기를 25밀리리터의 소화 완충액이 들어 있는 50밀리리터 주사기로 교환합니다. 주입하기 전에 기포의 매니폴드와 나머지 관류 완충액을 제거합니다. 바늘을 좌심실 정점의 동일한 바늘 위치로 조심스럽게 교체하십시오.관류 펌프의 도움으로 50 밀리리터 주사기를 사용하여 섭씨 37도 소화 완충액을 좌심실에 15 분 동안 주입합니다. 섭씨 37도 용액을 배출하도록 보정된 워터 재킷으로 용액의 온도를 제어합니다. 심방을 10 밀리리터 비커로 옮기기 전에 심방에서 심실을 제거하십시오.비커에 3 밀리리터의 소화 완충액을 넣고 날카로운 가위를 사용하여 심실을 큰 덩어리로 자릅니다. 비커를 알루미늄 호일로 덮고 섭씨 37도로 예열된 진탕수조에 5분 동안 넣습니다. 상청액을 버린 후, 조직 덩어리를 3 밀리리터의 소화 완충액에 재현 탁하고 약 4 분 동안 또는 균질 한 혼합물이 달성 될 때까지 분쇄합니다.완료되면 70마이크로미터 나일론 셀 스트레이너를 사용하여 50밀리리터 폴리프로필렌 튜브에 셀을 여과합니다. 나일론 세포 여과기를 3밀리리터의 소화 완충액으로 세척합니다. 여과액을 14 밀리리터 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브로 되돌려 놓고 원심 분리합니다.펠릿을 3밀리리터의 정지 완충액에 재현탁하기 전에 상청액을 버립니다. 세포 현탁액에 54 마이크로 리터의 100 밀리몰 염화칼슘 스톡을 첨가하여 최종 염화칼슘 농도를 1.8 밀리몰로 만듭니다. 살아있는 세포를 10분 동안 침전시키고 죽은 세포가 들어 있는 상청액을 제거합니다.펠릿을 저장 용액에 재현탁시킨 후, 세포는 기능적 실험 및 배양에 사용될 수 있다. 분리된 세포의 명시야 현미경 이미지는 마우스 심근 세포의 분리가 막 블랩이나 둥근 모서리가 없는 막대 모양의 정지 세포를 생성한다는 것을 보여주었습니다. 세포는 약 80%의 수율과 높은 생존율을 보였으며 분리 기술의 성공을 결정했습니다.성공적인 격리를 위해서는 매니폴드에서 기포를 제거하고 심장의 동일한 구멍에 바늘을 삽입하는 것이 가장 중요합니다. 일단 분리되면 심근 세포는 세포 및 분자 기능 실험에 사용할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

부분 결합하여 마우스 경동맥 동맥에있는 방해 흐름 유발 죽상 경화증과 경동맥 내피로부터 RNA 분리의 간단한 방법의 모델

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

연구

의학

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

마우스에 Intracranial 이종 이식 연구에 대한 간단한 안내 스크류 방법

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

마우스 폐 삽관 법의 간단한 방법

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

수정 된 침전 법은 요도 엑소 좀을 분리

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

간단한 장치는 빠르게 마우스 소장의 전체 마운트를 준비하는 방법

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

간단한 기계 절차 마우스에서 윤부 줄기 세포 결핍을 만드는 방법

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

췌장 덕트 주입: 효과적이고 선택적 약물 및 바이러스 성 전달 방법

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3 차원 초음파 영상: 골격 조직의 신속 하 고 비용 효율적인 Morphometry

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...