Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) og T32 HL134616 (Sturgill og Salyer).

Alle prosedyrer utført i denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee ved Ohio State University i samsvar med NIHs retningslinjer.
1. Forberedelse av løsning
MERK: Se tabell 2 for bufferkonsentrasjoner.
<ol><li>Preisolering (inntil 2 uker før myocyttisolering)<ol><li>Perfusjonsbufferbase: Klargjør 1 liter perfusjonsbufferbase (NaCl, KCl, NaH 2 PO 4, HEPES, glukose og BDM) i 1 liter ultraren 18,2 M?...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Hovedfordelen med vår Langendorff-frie kardiomyocyttisolasjonsteknikk er at den begrenser hypoksi og iskemisk tid ved ikke å kreve kanylering til et Langendorff-apparat. Alternativt til klassiske Langendorff-teknikker som tar flere minutter å fjerne, rense og henge hjertet, noe som ofte resulterer i iskemisk skade på myocytten, inkluderer vår metode en in vivo clearing av blod via en iskald clearingløsning. Den iskalde clearingbufferen inneholder etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), irreversibelt ch...

I flere tiår er en viktig idé i hjertebiologisk litteratur den molekylære virkningsmekanismen. Virkningsmekanismen må etableres for å publisere pålitelige studier. En veletablert strategi for å bestemme molekylær mekanisme er isolerte kardiomyocyttstudier, som krever kardiomyocytter av høy kvalitet for å oppnå pålitelige data. Cellulære og molekylære eksperimenter utført på kardiomyocytter for å bestemme virkningsmekanismen er gullstandarden for å undersøke sammentrekning1, elektrofysiologi2, kalsium (Ca 2+) syklus3, myofilament Ca2+ følsomhet4, cytoskjelett5, metabolisme6, effekter av hormoner7, signalmolekyler8, legemiddelstudier9 etc. Musen har blitt den valgte arten for de fleste hjertebiologiske eksperimenter på grunn av den enkle genetiske manipulasjonen, den lille størrelsen, den relativt korte levetiden, lave kostnader, etc10. Den pålitelige isoleringen av høykvalitets musekardiomyocytter er imidlertid ikke triviell med dagens teknikker.
Laboratorier har isolert kardiomyocytter i nesten 70 år11. Nesten alle teknikker for å isolere kardiomyocytter er avhengige av fordøyelsen av hjertet via forskjellige enzymer (kollagenase, protease, trypsin, etc.). I de tidlige periodene (1950-1960-tallet) ble chunk-metoden benyttet, som innebar å fjerne hjertet, kutte i mye mindre biter og inkubere i løsning med kollagenase / protease / trypsin12. På 1970-tallet implementerte laboratorier den forbedrede "Langendorff" -metoden13, som isolerte kardiomyocytter ved hjelp av en perfusjonsbasert isolasjonsteknikk i kranspulsårene (retrograd perfusjon med enzym via Langendorff-apparatet); Denne teknikken er fortsatt den dominerende metoden for myocytisolering i feltet i dag, ~ 50 år senere14,15,16. Nylig arbeid har skiftet til kanylering av hjertet in vivo for å begrense hypoksitid og iskemisk skade som resulterer i overlegne kardiomyocyttisolasjoner (bedre utbytter og høyere kvalitet)17. Nylig har dette utviklet seg til å utføre in vivo, Langendorff-frie hjerteperfusjoner 18,19,20,21,22. Vi har utviklet Langendorff-fri kardiomyocyttisolasjonsteknikk basert på Ackers-Johnson et al.18-teknikken og tilpasset ulike komponenter fra de mange tidligere isolasjonsteknikkene. Disse viktige tilpasningene inkluderer injeksjon av en iskald ryddebuffer og inkorporering av en støtteplattform for å stabilisere nålen, noe som muliggjør redusert manipulering av hjertet. Også detaljert i denne teknikken er temperaturkontroll av injiserte buffere (37 ° C), noe som reduserte tiden mellom in vivo injeksjon og fordøyelse på grunn av mindre EDTA-perfusjon som tidligere publisert18. Ved å redusere manipulering av hjertet og dermed minimere punkteringsstedets størrelse, oppnås grundig og konstant perfusjon av koronararteriene. Vi raffinerte også teknikken med en sekundær chunk method fordøyelse, mengden EDTA i den injiserte clearingbufferen, og endret pH. Vår beskrevne teknikk er mer pålitelig, mer effektiv og krever ikke den omfattende opplæringen / øvelsen sammenlignet med bruk av Langendorff-apparatet (tabell 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

Behovet for reproduserbare, men teknisk enkle metoder som gir kardiomyocytter av høy kvalitet, er essensielt for forskning innen hjertebiologi. Cellulære og molekylære funksjonelle eksperimenter (f.eks. Sammentrekning, elektrofysiologi, kalsiumsykling, etc.) på kardiomyocytter er gullstandarden for å etablere sykdomsmekanisme(r). Musen er den valgte arten for funksjonelle eksperimenter, og den beskrevne teknikken er spesielt for isolering av musekardiomyocytter. Tidligere metoder som krever et Langendorff-apparat krever høy trening og presisjon for kanylering av aorta, noe som ofte resulterer i iskemi. Feltet skifter mot Langendorff-frie isolasjonsmetoder som er enkle, er reproduserbare og gir levedyktige myocytter for fysiologisk datainnsamling og kultur. Disse metodene reduserer iskemitiden sterkt sammenlignet med aortakanylering og resulterer i pålitelig oppnådde kardiomyocytter. Vår tilpasning til den Langendorff-frie metoden inkluderer en innledende perfusjon med iskald renseløsning, bruk av en stabiliseringsplattform som sikrer en jevn nål under perfusjon, og ytterligere fordøyelsestrinn for å sikre pålitelig oppnådde kardiomyocytter for bruk i funksjonelle målinger og kultur. Denne metoden er enkel og rask å utføre og krever lite teknisk dyktighet.

Det er noen elementer å undersøke når man bestemmer suksessen til en isolasjon. Først må kardiomyocyttene være stavformede uten membranbleb, slik cellene isolert i figur 1. En typisk isolasjon vil gi ~ 80% av myocyttene er stavformede. Hvis isolasjonen gir noe mindre enn 50% stavformede celler, anses det som en mislykket isolasjon og kardiomyocytter brukes ikke. Til slutt bør kardiomyocyttene være hvilende. Spontane sammentrekningsmyocytter viser Ca2+-intoleranse og vil gi upåliteli...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Gullstandarden i kardiologi for cellulære og molekylære funksjonelle eksperimenter er kardiomyocytter. Denne artikkelen beskriver tilpasninger til ikke-Langendorff-teknikken for å isolere musekardiomyocytter.

En enkel og effektiv metode for konsekvent å isolere muskardiomyocytter

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Denne teknikken er mer pålitelig og effektiv og krever ikke omfattende praksis eller trening sammenlignet med de mest brukte Langendorff-apparatteknikkene. Den største fordelen med denne teknikken er at den begrenser den iskemiske tiden siden den første perfusjonen forekommer in vivo. Mens du utfører denne teknikken, er det viktig å unngå bobler i manifolden og for å unngå overdreven bevegelse av hjertet under fordøyelsen, kan disse redusere utbyttet.Demonstrere denne teknikken vil være Sarah Sturgill, en kandidatstudent i Dr.Ziolo's laboratorium. Begynn med å fjerne den temperaturkontrollerte manifolden ved hjelp av nylaget perfusjonsbuffer. For å gjøre dette, skru inn en 27 gauge nål og fjern boblene ved hjelp av en luer lock-kontakt.Sørg for at ingen bobler forblir. For å isolere kardiomyocytten, eksponer brystbenet til den fullt bedøvede musen, og lateralt til midtlinjen, kutt proksimalt gjennom ribbeina og til armhulen. Skjær deretter gjennom mellomgulvet, og sørg for grunne kutt for å unngå hjertet.Klem brystbenet med en hemostat og brett ribbeina bakover for å avsløre brysthulen. Fjern perikardiet fra hjertet forsiktig før du skjærer gjennom den dårligere vena cava umiddelbart distalt for hjertet. Injiser tre milliliter iskald clearing buffer inn i hjertets høyre ventrikkel over ett minutt ved hjelp av en 27 gauge nål.Deretter holder du hjertet ved hjelp av pinsett. Trekk den bort fra kroppen og utsett så mye av aorta som mulig. Klem deretter den stigende aorta ved hjelp av en hemostat og punkter hjertet.Overfør raskt det klemmede hjertet til lokket på en petriskål av polypropylen som inneholder 10 ml varm perfusjonsbuffer. Plasser det klemte hjertet inn i støtteplattformen og injiser 10 ml temperaturkontrollert perfusjonsbuffer ved 37 grader Celsius i venstre ventrikkel over fem minutter ved bruk av en stabilisert 27 gauge nål festet til manifolden. Deretter overfører du det klemte hjertet og støtteplattformen til en petriskål med omtrent fem milliliter fordøyelsesbuffer.Bytt inngangssprøyter for en 50 milliliter sprøyte som inneholder 25 ml fordøyelsesbuffer. Fjern manifolden for eventuelle bobler og gjenværende perfusjonsbuffer før injeksjon. Nålen settes forsiktig tilbake i samme nåleposisjon i venstre ventrikkels toppunkt.Ved hjelp av en perfusjonspumpe, injiser 37 grader Celsius fordøyelsesbuffer i venstre ventrikel i 15 minutter ved hjelp av en 50 ml sprøyte. Kontroller temperaturen på løsningen med en vannkappe kalibrert for å kaste ut 37 grader Celsius-oppløsning. Fjern ventriklene fra atriene før du overfører dem til et 10 milliliter beger.Tilsett tre milliliter fordøyelsesbuffer i begeret og kutt ventriklene i store biter ved hjelp av skarp saks. Dekk begeret med aluminiumsfolie og legg det i et ristende vannbad forvarmet til 37 grader Celsius i fem minutter. Etter å ha kastet supernatanten, resuspender vevsbitene i tre milliliter fordøyelsesbuffer og triturerer den i omtrent fire minutter eller til en homogen blanding oppnås.Når du er ferdig, filtrer cellene i et 50 milliliter polypropylenrør ved hjelp av en 70 mikrometer nyloncellesil. Vask nyloncellesil med tre milliliter fordøyelsesbuffer. Sett filtratet tilbake til et 14 milliliter polypropylenrør med rund bunn og sentrifuger det.Kast supernatanten før pelleten resuspenderes i tre milliliter stoppbuffer. Til cellesuspensjonen, tilsett 54 mikroliter 100 millimolar kalsiumkloridlager for å gjøre den endelige kalsiumkloridkonsentrasjonen 1,8 millimolar. La de levende cellene slå seg ned i 10 minutter og fjern supernatanten som inneholder døde celler.Etter resuspendering av pelleten i en lagringsløsning, kan cellene brukes til funksjonelle eksperimenter og kulturer. Brightfield-mikroskopbilder av isolerte celler viste at isoleringen av musekardiomyocytter produserte stavformede hvileceller uten membranbleb eller avrundede kanter. Cellene viste omtrent 80% utbytte og høy overlevelse som bestemmer suksessen til isolasjonsteknikken.For vellykket isolasjon er det viktigst å fjerne boblene fra manifolden og sette nålen inn i samme hull i hjertet. Når de er isolert, kan kardiomyocyttene brukes til cellulære og molekylære funksjonelle eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metode for Mouse Lung Intubasjon

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

En Modifisert Nedbør Metode for å isolere Urin Exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

En enkel Kritisk store Femoral Defect Model i Mus

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

En enkel enhet å raskt Forbered Hele Mounts av Mouse Tarm

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

En enkel mekanisk prosedyre for å opprette limbale Stem Cell Mangel på Mouse

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Pankreaskanalinfusjon: En effektiv og selektiv metode for legemiddel- og viruslevering

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D Ultralyd Imaging: rask og kostnadseffektiv Morphometry av muskel vev

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...