Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por las subvenciones R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) y T32 HL134616 (Sturgill y Salyer) de los Institutos Nacionales de Salud.

Todos los procedimientos realizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Ohio de acuerdo con las pautas de los NIH.
1. Preparación de la solución
NOTA: Consulte la Tabla 2 para conocer las concentraciones de tampón.
<ol><li>Preaislamiento (hasta 2 semanas antes del aislamiento de miocitos)<ol><li>Base tampón de perfusión: Preparar 1 L de base t...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

La principal ventaja de nuestra técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff es que limita la hipoxia y el tiempo isquémico al no requerir canulación a un aparato de Langendorff. Alternativamente a las técnicas clásicas de Langendorff que tardan varios minutos en extraer, limpiar y colgar el corazón, lo que a menudo resulta en daño isquémico al miocito, nuestro método incluye una limpieza in vivo de la sangre a través de una solución de limpieza helada. El tampón de limpieza hela...

Durante décadas, una idea esencial en la literatura de biología cardíaca es el mecanismo de acción molecular. El mecanismo de acción debe establecerse para publicar estudios confiables. Una estrategia bien establecida para determinar el mecanismo molecular son los estudios aislados de cardiomiocitos, que requieren cardiomiocitos de alta calidad para obtener datos confiables. Los experimentos celulares y moleculares realizados en cardiomiocitos para determinar el mecanismo de acción son el estándar de oro para investigar la contracción1, electrofisiología2, calcio (Ca 2+) ciclo3, miofilamento Ca2+ sensibilidad4, citoesqueleto5, metabolismo6, efectos de las hormonas7, moléculas de señalización8, estudios farmacológicos9 etc. El ratón se ha convertido en la especie de elección para la mayoría de los experimentos de biología cardíaca debido a la facilidad de manipulación genética, su pequeño tamaño, su vida útil relativamente corta, bajo costo, etc.10. Sin embargo, el aislamiento confiable de cardiomiocitos de ratón de alta calidad no es trivial con las técnicas actuales.
Los laboratorios han estado aislando cardiomiocitos durante casi 70 años11. Prácticamente todas las técnicas para aislar cardiomiocitos se basan en la digestión del corazón a través de varias enzimas (colagenasa, proteasa, tripsina, etc.). En los primeros períodos (1950-1960), se empleó el método de trozos, que consistía en extraer el corazón, cortar en trozos mucho más pequeños e incubar en solución con colagenasa / proteasa / tripsina12. En la década de 1970, los laboratorios implementaron el método mejorado "Langendorff"13, que aisló cardiomiocitos utilizando una técnica de aislamiento basada en la perfusión de la arteria coronaria (perfusión retrógrada con enzima a través del aparato de Langendorff); Esta técnica sigue siendo el método dominante de aislamiento de miocitos en el campo hoy en día, ~ 50 años después14,15,16. El trabajo reciente se ha desplazado a la canulación del corazón in vivo para limitar el tiempo de hipoxia y el daño isquémico, lo que resulta en aislamientos de cardiomiocitos superiores (mejores rendimientos y mayor calidad)17. Recientemente, esto ha evolucionado para realizar perfusiones cardíacas in vivo sin Langendorff 18,19,20,21,22. Hemos evolucionado la técnica de aislamiento de cardiomiocitos sin Langendorff basada en la técnica de Ackers-Johnson et al.18 y hemos adaptado varios componentes de las muchas técnicas de aislamiento anteriores. Estas adaptaciones clave incluyen la inyección de un tampón de limpieza helada y la incorporación de una plataforma de soporte para estabilizar la aguja, lo que permite una menor manipulación del corazón. También se detalla en esta técnica el control de la temperatura de los tampones inyectados (37 °C), lo que disminuyó el tiempo entre la inyección in vivo y la digestión debido a una menor perfusión de EDTA como se publicó anteriormente18. Al disminuir la manipulación del corazón y, por lo tanto, minimizar el tamaño del sitio de punción, se obtiene una perfusión completa y constante de las arterias coronarias. También refinamos la técnica con un método secundario de digestión de trozos, la cantidad de EDTA en el tampón de limpieza inyectado y cambiamos el pH. Nuestra técnica descrita es más confiable, más eficiente y no requiere el entrenamiento / práctica extensiva en comparación con el uso del aparato de Langendorff (Tabla 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

La necesidad de métodos reproducibles pero técnicamente simples que produzcan cardiomiocitos de alta calidad es esencial para la investigación en biología cardíaca. Los experimentos funcionales celulares y moleculares (por ejemplo, contracción, electrofisiología, ciclo de calcio, etc.) en cardiomiocitos son el estándar de oro para establecer los mecanismos de la enfermedad. El ratón es la especie de elección para experimentos funcionales y la técnica descrita es específicamente para el aislamiento de cardiomiocitos de ratón. Los métodos anteriores que requerían un aparato de Langendorff requieren altos niveles de entrenamiento y precisión para la canulación aórtica, lo que a menudo resulta en isquemia. El campo se está desplazando hacia métodos de aislamiento sin Langendorff que son simples, son reproducibles y producen miocitos viables para la adquisición de datos fisiológicos y el cultivo. Estos métodos disminuyen en gran medida el tiempo de isquemia en comparación con la canulación aórtica y dan como resultado cardiomiocitos obtenidos de manera confiable. Nuestra adaptación al método sin Langendorff incluye una perfusión inicial con solución de limpieza helada, el uso de una plataforma estabilizadora que garantiza una aguja estable durante la perfusión y pasos de digestión adicionales para garantizar la obtención confiable de cardiomiocitos para su uso en mediciones funcionales y cultivo. Este método es simple y rápido de realizar y requiere poca habilidad técnica.

Hay algunos elementos a examinar al determinar el éxito de un aislamiento. En primer lugar, los cardiomiocitos deben tener forma de bastón sin ampollas de membrana, como las células aisladas en la Figura 1. Un aislamiento típico producirá ~ 80% de los miocitos en forma de bastón. Si el aislamiento produce menos del 50% de células en forma de bastón, entonces se considera un aislamiento fallido y no se utilizan cardiomiocitos. Por último, los cardiomiocitos deben estar inactivos. Los...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

El estándar de oro en cardiología para experimentos funcionales celulares y moleculares son los cardiomiocitos. Este artículo describe adaptaciones a la técnica no Langendorff para aislar cardiomiocitos de ratón.

Un método simple y efectivo para aislar consistentemente cardiomiocitos de ratón

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Esta técnica es más fiable y eficiente y no requiere una amplia práctica o entrenamiento en comparación con las técnicas de aparatos Langendorff más utilizadas. La principal ventaja de esta técnica es que limita el tiempo isquémico ya que la perfusión inicial se produce in vivo. Al realizar esta técnica, es esencial evitar burbujas en el colector y evitar el movimiento excesivo del corazón durante la digestión, estas pueden disminuir el rendimiento.Demostrando esta técnica estará Sarah Sturgill, una estudiante graduada en el laboratorio del Dr. Mark Ziolo. Comience limpiando el colector de temperatura controlada utilizando un tampón de perfusión recién preparado. Para hacerlo, atornille una aguja de calibre 27 y limpie las burbujas con un conector luer lock.Asegúrese de que no queden burbujas. Para aislar el cardiomiocitos, exponer el esternón del ratón completamente anestesiado, y lateral a la línea media, cortar proximalmente a través de las costillas y a la axila. Luego corte a través del diafragma, asegurando cortes poco profundos para evitar el corazón.Sujete el esternón con un hemostático y doble las costillas hacia atrás para exponer la cavidad torácica. Retire el pericardio del corazón suavemente antes de cortar a través de la vena cava inferior inmediatamente distal al corazón. Inyecte tres mililitros de tampón de limpieza helada en el ventrículo derecho del corazón durante un minuto con una aguja de calibre 27.Luego, sostenga el corazón con pinzas. Aleje el cuerpo y exponga la mayor cantidad posible de aorta. Luego sujete la aorta ascendente con un hemostático y extirpe el corazón.Transfiera rápidamente el corazón sujetado a la tapa de una placa de Petri de polipropileno que contenga 10 mililitros de tampón de perfusión caliente. Coloque el corazón pinzado en la plataforma de soporte e inyecte 10 mililitros de tampón de perfusión con temperatura controlada a 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante cinco minutos usando una aguja estabilizada de calibre 27 conectada al colector. A continuación, transfiera el corazón pinzado y la plataforma de soporte a una placa de Petri con aproximadamente cinco mililitros de tampón de digestión.Intercambie las jeringas de entrada por una jeringa de 50 mililitros que contenga 25 mililitros de tampón de digestión. Limpie el colector de cualquier burbuja y el tampón de perfusión restante antes de la inyección. Reemplace cuidadosamente la aguja en la misma posición de la aguja en el ápice ventricular izquierdo.Con la ayuda de una bomba de perfusión, inyecte tampón de digestión de 37 grados centígrados en el ventrículo izquierdo durante 15 minutos con una jeringa de 50 mililitros. Controle la temperatura de la solución con una camisa de agua calibrada para expulsar una solución de 37 grados centígrados. Retire los ventrículos de las aurículas antes de transferirlos a un vaso de precipitados de 10 mililitros.Agregue tres mililitros de tampón de digestión al vaso de precipitados y corte los ventrículos en trozos grandes con tijeras afiladas. Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y colóquelo en un baño de agua agitante precalentado a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Después de desechar el sobrenadante, resuspenda los trozos de tejido en tres mililitros de tampón de digestión y triture durante aproximadamente cuatro minutos o hasta que se logre una mezcla homogénea.Una vez hecho esto, filtre las células en un tubo de polipropileno de 50 mililitros con un colador de células de nylon de 70 micrómetros. Lave el colador de células de nylon con tres mililitros de tampón de digestión. Devolver el filtrado a un tubo de polipropileno de fondo redondo de 14 mililitros y centrifugarlo.Deseche el sobrenadante antes de resuspender el pellet en tres mililitros de tope de parada. A la suspensión celular, agregue 54 microlitros de 100 milimolares de cloruro de calcio para que la concentración final de cloruro de calcio sea de 1.8 milimolar. Deje que las células vivas se asienten durante 10 minutos y retire el sobrenadante que contiene células muertas.Después de resuspender el pellet en una solución de almacenamiento, las células se pueden utilizar para experimentos funcionales y cultivos. Las imágenes de microscopio de campo claro de células aisladas mostraron que el aislamiento de cardiomiocitos de ratón produjo células quiescentes en forma de bastón sin ampollas de membrana ni bordes redondeados. Las células mostraron aproximadamente un 80% de rendimiento y altas tasas de supervivencia que determinaron el éxito de la técnica de aislamiento.Para un aislamiento exitoso, es más importante eliminar las burbujas del colector e insertar la aguja en el mismo orificio del corazón. Una vez aislados, los cardiomiocitos se pueden utilizar para experimentos funcionales celulares y moleculares.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

Un modelo de Disturbed inducida por el flujo de Aterosclerosis en la arteria carótida del ratón por la ligadura parcial y un método sencillo para el aislamiento de ARN del endotelio carótida

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

Investigación

Medicina

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Una guía sencilla Método de tornillo para intracraneal Estudios xenoinjerto en ratones

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

Un sencillo método de intubación ratón de pulmón

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

Un método de precipitación Modificado para aislar urinaria exosomas

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

A-crítico tamaño femoral Defecto sencillo modelo en ratones

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

Un dispositivo sencillo de preparar rápidamente enteros Montes del Intestino Ratón

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

Un procedimiento mecánico simple de crear deficiencia de células madre limbares en ratón

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Infusión del conducto pancreático: un método eficaz y selectivo de administración de fármacos y virus

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

Proyección de imagen de ultrasonido 3D: morfometría rápida y rentable de tejido músculo-esquelético

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...