Name: a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes
Uploaded: 2022-11-11T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grants R01 HL114940 (Biesiadecki), R01 AG060542 (Ziolo) och T32 HL134616 (Sturgill och Salyer).

Alla procedurer som utfördes i denna studie godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee vid Ohio State University i enlighet med NIH-riktlinjerna.
1. Beredning av lösning
Anmärkning: Se tabell 2 för buffertkoncentrationer.
<ol><li>Förisolering (upp till 2 veckor före myocytisolering)<ol><li>Perfusionsbuffertbas: Bered 1 liter perfusionsbuffertbas (NaCl, KCl, NaH2PO4, HEPES, glukos och BDM) i 1 liter ...

<ol>
	<li>Ziolo, M. T., Dollinger, S. J., Wahler, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+reduced+basal+shortening+which+is+reversible+by+aminoguanidine.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit reduced basal shortening which is reversible by aminoguanidine.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 30 (5), 1009-1017 (1998).</li><li>Ziolo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocytes+isolated+from+rejecting+transplanted+rat+hearts+exhibit+a+nitric+oxide-mediated+reduction+in+the+calcium+current.">Myocytes isolated from rejecting transplanted rat hearts exhibit a nitric oxide-mediated reduction in the calcium current.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (9), 1691-1699 (2001).</li><li>Traynham, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diesterified+nitrone+rescues+nitroso-redox+levels+and+increases+myocyte+contraction+via+increased+SR+Ca(2+)+handling.">Diesterified nitrone rescues nitroso-redox levels and increases myocyte contraction via increased SR Ca(2+) handling.</a> PLoS One. 7 (12), 52005 (2012).</li><li>Nixon, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+troponin+I+Ser-150+and+Ser-23/24+phosphorylation+sustains+thin+filament+Ca(2+)+sensitivity+and+accelerates+deactivation+in+an+acidic+environment.">Combined troponin I Ser-150 and Ser-23/24 phosphorylation sustains thin filament Ca(2+) sensitivity and accelerates deactivation in an acidic environment.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 72, 177-185 (2014).</li><li>Swager, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Claudin-5+levels+are+reduced+from+multiple+cell+types+in+human+failing+hearts+and+are+associated+with+mislocalization+of+ephrin-B1.">Claudin-5 levels are reduced from multiple cell types in human failing hearts and are associated with mislocalization of ephrin-B1.</a> Cardiovascular Pathology. 24 (3), 160-167 (2015).</li><li>Pinckard, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocrine+role+for+the+BAT-released+lipokine+12,13-diHOME+to+mediate+cardiac+function.">A novel endocrine role for the BAT-released lipokine 12,13-diHOME to mediate cardiac function.</a> Circulation. 143 (2), 145-159 (2021).</li><li>Roof, S. R., Shannon, T. R., Janssen, P. M., Ziolo, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+increased+systolic+Ca2++and+phospholamban+phosphorylation+during+beta-adrenergic+stimulation+on+Ca2++transient+kinetics+in+cardiac+myocytes.">Effects of increased systolic Ca2+ and phospholamban phosphorylation during beta-adrenergic stimulation on Ca2+ transient kinetics in cardiac myocytes.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), 1570-1578 (2011).</li><li>Harris, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+3'-sialyllactose+in+breast+milk+is+a+critical+mediator+to+improve+metabolic+health+and+cardiac+function+in+mouse+offspring.">Exercise-induced 3'-sialyllactose in breast milk is a critical mediator to improve metabolic health and cardiac function in mouse offspring.</a> Nature Metabolism. 2 (8), 678-687 (2020).</li><li>Roof, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXL-1020,+a+novel+nitroxyl+(HNO)+prodrug,+is+more+effective+than+milrinone+in+models+of+diastolic+dysfunction-a+cardiovascular+therapeutic:+an+efficacy+and+safety+study+in+the+rat.">CXL-1020, a novel nitroxyl (HNO) prodrug, is more effective than milrinone in models of diastolic dysfunction-a cardiovascular therapeutic: an efficacy and safety study in the rat.</a> Frontiers in Physiology. 8, 894 (2017).</li><li>Milani-Nejad, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+and+large+animal+models+in+cardiac+contraction+research:+advantages+and+disadvantages.">Small and large animal models in cardiac contraction research: advantages and disadvantages.</a> Pharmacology and Therapeutics. 141 (3), 235-249 (2014).</li><li>Harary, I., Farley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+studies+of+single+isolated+beating+heart+cells.">In vitro studies of single isolated beating heart cells.</a> Science. 131 (3414), 1674-1675 (1960).</li><li>Kono, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+collagenases+and+other+proteolytic+enzymes+in+the+dispersal+of+animal+tissues.">Roles of collagenases and other proteolytic enzymes in the dispersal of animal tissues.</a> Biochimica Biophysica Acta. 178 (2), 397-400 (1969).</li><li>Baker, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+apparatus+for+mammalian+heart+perfusion.">An improved apparatus for mammalian heart perfusion.</a> The Journal of Physiology. 115 (1), 30-32 (1951).</li><li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium.">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 72 (1), 327-333 (1976).</li><li>Motayagheni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+Langendorff+technique+for+mouse+heart+cannulation:+Improved+heart+quality+and+decreased+risk+of+ischemia.">Modified Langendorff technique for mouse heart cannulation: Improved heart quality and decreased risk of ischemia.</a> MethodsX. 4, 508-512 (2017).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+procedure+for+isolating+adult+mouse+cardiomyocytes+for+epicardial+activation+mapping.">An improved procedure for isolating adult mouse cardiomyocytes for epicardial activation mapping.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (24), 11257-11263 (2021).</li><li>Jian, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cannulation+methods+for+cardiomyocytes+isolation+from+heart+disease+models.">In vivo cannulation methods for cardiomyocytes isolation from heart disease models.</a> PLoS One. 11 (8), 0160605 (2016).</li><li>Ackers-Johnson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified,+Langendorff-free+method+for+concomitant+isolation+of+viable+cardiac+myocytes+and+nonmyocytes+from+the+adult+mouse+heart.">A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart.</a> Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).</li><li>Weldrick, J. J., Abdul-Ghani, M., Megeney, L. A., Burgon, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+efficient+method+for+the+isolation+of+postnatal+murine+cardiac+myocyte+and+fibroblast+cells.">A rapid and efficient method for the isolation of postnatal murine cardiac myocyte and fibroblast cells.</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 96 (5), 535-539 (2018).</li><li>Myachina, T. A., Butova, X. A., Khohlova, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+Langendorff-free+method+for+isolation+of+cadiomyocytes+from+adult+rat+heart.">A modified Langendorff-free method for isolation of cadiomyocytes from adult rat heart.</a> AIP Conference Proceedings. 2174 (1), 020140 (2019).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Yoshioka, K., Fukunaga, R., Sagawa, H., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+antegrade+perfusion+method+for+isolating+viable+single+cardiomyocytes+from+neonatal+to+aged+mice.">A simple antegrade perfusion method for isolating viable single cardiomyocytes from neonatal to aged mice.</a> Physiological Reports. 6 (9), 13688 (2018).</li><li>Omatsu-Kanbe, M., Fukunaga, R., Mi, X., Matsuura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+antegrade+perfusion+method+for+cardiomyocyte+isolation+from+mice.">An antegrade perfusion method for cardiomyocyte isolation from mice.</a> Journal of Visualized Experiments. (171), e61866 (2021).</li><li>Bers, D. M., Patton, C. W., Nuccitelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+the+preparation+of+Ca2++buffers.">A practical guide to the preparation of Ca2+ buffers.</a> Methods in Cell Biology. 99, 126 (1994).</li><li>Grosso, D. S., Frangakis, C. J., Carlson, E. C., Bressler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+myocytes+from+the+adult+rat+heart.">Isolation and characterization of myocytes from the adult rat heart.</a> Preparative Biochemistry. 7 (5), 383-401 (1977).</li><li>Thum, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butadione+Monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butadione Monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovascular Toxicology. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Wolska, B. M., Solaro, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+isolation+of+adult+mouse+cardiac+myocytes+for+studies+of+contraction+and+microfluorimetry.">Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry.</a> American Journal of Physiology. 271 (3), 1250-1255 (1996).</li></ol>

Den främsta fördelen med vår Langendorff-fria kardiomyocytisoleringsteknik är att den begränsar hypoxi och ischemisk tid genom att inte kräva kanylering till en Langendorff-apparat. Alternativt till klassiska Langendorff-tekniker som tar flera minuter att ta bort, rengöra och hänga hjärtat, vilket ofta resulterar i ischemisk skada på myocyten, inkluderar vår metod en in vivo-rensning av blod via en iskall clearinglösning. Den iskalla rensningsbufferten innehåller etylendiamintetraättiksyra...

I årtionden är en viktig idé i hjärtbiologisk litteratur den molekylära verkningsmekanismen. Verkningsmekanismen måste fastställas för att tillförlitliga studier ska kunna publiceras. En väletablerad strategi för att bestämma molekylär mekanism är isolerade kardiomyocytstudier, som kräver högkvalitativa kardiomyocyter för att uppnå tillförlitliga data. Cellulära och molekylära experiment som utförs på kardiomyocyter för att bestämma verkningsmekanismen är guldstandarden för att undersöka sammandragning1, elektrofysiologi2, kalcium (Ca 2+) cykling3, myofilament Ca2+ känslighet4, cytoskelett5, metabolism6, effekter av hormoner7, signalmolekyler8, läkemedelsstudier9 etc. Musen har blivit den art som valts för de flesta hjärtbiologiska experiment på grund av enkel genetisk manipulation, dess lilla storlek, dess relativt korta livslängd, låga kostnad etc10. Den tillförlitliga isoleringen av högkvalitativa muskardiomyocyter är emellertid inte trivial med nuvarande tekniker.
Labs har isolerat kardiomyocyter i nästan 70 år11. Praktiskt taget alla tekniker för att isolera kardiomyocyter är beroende av matsmältningen av hjärtat via olika enzymer (kollagenas, proteas, trypsin, etc.). Under de tidiga perioderna (1950-1960-talet) användes segmentmetoden, som innebar att hjärtat avlägsnades, skars i mycket mindre bitar och inkuberades i lösning med kollagenas / proteas / trypsin12. På 1970-talet implementerade laboratorier den förbättrade "Langendorff" -metoden13, som isolerade kardiomyocyter med hjälp av en kranskärlsperfusionsbaserad isoleringsteknik (retrograd perfusion med enzym via Langendorff-apparaten); Denna teknik är fortfarande den dominerande metoden för myocytisolering i fältet idag, ~ 50 år senare14,15,16. Det senaste arbetet har övergått till kanylering av hjärtat in vivo för att begränsa hypoxitiden och ischemisk skada, vilket resulterar i överlägsen kardiomyocytisolering (bättre avkastning och högre kvalitet)17. Nyligen har detta utvecklats till att utföra in vivo, Langendorff-fria hjärtperfusioner 18,19,20,21,22. Vi har utvecklat den Langendorff-fria kardiomyocytisoleringstekniken baserad på Ackers-Johnson et al.18-tekniken och anpassat olika komponenter från de många tidigare isoleringsteknikerna. Dessa viktiga anpassningar inkluderar injektion av en iskall rensningsbuffert och införlivandet av en stödjande plattform för att stabilisera nålen, vilket möjliggör minskad manipulation av hjärtat. I denna teknik beskrivs också temperaturkontroll av injicerade buffertar (37 °C), vilket minskade tiden mellan in vivo-injektion och matsmältning på grund av mindre EDTA-perfusion som tidigare publicerats18. Genom att minska manipulationen av hjärtat och därmed minimera punkteringsställets storlek erhålls grundlig och konstant perfusion av kranskärlen. Vi förfinade också tekniken med en sekundär bitmetod digestion, mängden EDTA i den injicerade clearingbufferten och ändrade pH. Vår beskrivna teknik är mer tillförlitlig, effektivare och kräver inte omfattande utbildning/övning jämfört med användning av Langendorff-apparaten (tabell 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10 cc Bd Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-827-52</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Pyrex Low-Form Beaker</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>UX-34502-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mL polypropylene cap glass media storage bottle</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>UX-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14 mL Round-Bottom Polypropylene Test Tubes With Cap</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-959-11B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0753</td>
			<td>&#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 cc BD Luer-Lok Syringe</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-823-435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.0-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL BD Syringe without Needle</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-689-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>EW-22999-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>95% O2 5% CO2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AIMS Space Gel Heating Pad</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>14-370-223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD PrecisionGlide 27 G X 1/2&#34; Hypodermic Needles</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3803</td>
			<td>Heat shock fraction, lyophilized powder, essentially fatty acid free, &#62;98%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td>Suitable for cell culture, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>11965092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>AAA1071336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 100 mm TC-treated Cell Culture Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-techne)</td>
			<td>S11195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Isotemp Heated Immersion Circulators</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>13-874-432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Mosquito Hemostatic Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hausser Scientific Hy-Lite Counting Chamber Set</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>02-671-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labeling Tape</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>15-901-10R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Legato 100 Syringe Pump</td>
			<td>kdScientific</td>
			<td>788100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutathione</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>ICN19467980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TH Research Grade</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>5401135001</td>
			<td>High thermolysin concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M199</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>MT10060CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9530G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Laminin</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354232</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5405</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Digital Reciprocating Water Bath</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSCIR19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5886</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S5011</td>
			<td>&#62;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#181;m</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>22-363-548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Student Fine Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91460-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Absorbent Underpads</td>
			<td>Fisher Sci</td>
			<td>NC9481815</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and effective method to consistently isolate mouse cardiomyocytes

Behovet av reproducerbara men tekniskt enkla metoder som ger kardiomyocyter av hög kvalitet är avgörande för forskning inom hjärtbiologi. Cellulära och molekylära funktionella experiment (t.ex. kontraktion, elektrofysiologi, kalciumcykling, etc.) på kardiomyocyter är guldstandarden för att fastställa sjukdomsmekanism(er). Musen är den art som valts för funktionella experiment och den beskrivna tekniken är specifikt för isolering av muskardiomyocyter. Tidigare metoder som kräver en Langendorff-apparat kräver hög grad av träning och precision för aortakannulation, vilket ofta resulterar i ischemi. Fältet skiftar mot Langendorff-fria isoleringsmetoder som är enkla, reproducerbara och ger livskraftiga myocyter för fysiologisk datainsamling och odling. Dessa metoder minskar kraftigt ischemitiden jämfört med aortakanylering och resulterar i tillförlitligt erhållna kardiomyocyter. Vår anpassning till den Langendorff-fria metoden inkluderar en initial perfusion med iskall rensningslösning, användning av en stabiliseringsplattform som säkerställer en stadig nål under perfusion och ytterligare matsmältningssteg för att säkerställa tillförlitligt erhållna kardiomyocyter för användning i funktionella mätningar och odling. Denna metod är enkel och snabb att utföra och kräver liten teknisk skicklighet.

Det finns några faktorer att undersöka när man bestämmer framgången för en isolering. Först måste kardiomyocyterna vara stavformade utan membranfläckar, såsom cellerna isolerade i figur 1. En typisk isolering kommer att ge ~ 80% av myocyterna som stavformade. Om isoleringen ger något mindre än 50% stavformade celler, anses det vara en misslyckad isolering och kardiomyocyter används inte. Slutligen bör kardiomyocyterna vara lugna. Spontant sammandragande myocyter visar Ca2 + int...

Watch this Scientific Journal Video about A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes at JoVE.com

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

Guldstandarden inom kardiologi för cellulära och molekylära funktionella experiment är kardiomyocyter. Denna artikel beskriver anpassningar till icke-Langendorff-tekniken för att isolera muskardiomyocyter.

En enkel och effektiv metod för att konsekvent isolera muskardiomyocyter

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Denna teknik är mer tillförlitlig och effektiv och kräver ingen omfattande övning eller träning jämfört med de vanligaste Langendorff-apparatteknikerna. Den största fördelen med denna teknik är att den begränsar den ischemiska tiden eftersom den initiala perfusionen sker in vivo. När du utför denna teknik är det viktigt att undvika bubblor i grenröret och för att undvika överdriven rörelse av hjärtat under matsmältningen, dessa kan minska avkastningen.Demonstrerar denna teknik kommer att vara Sarah Sturgill, en doktorand i Dr.Mark Ziolos laboratorium. Börja med att rensa det temperaturkontrollerade grenröret med nyberedd perfusionsbuffert. För att göra det, skruva in en 27 gauge nål och rensa bubblorna med en luer lock-kontakt.Se till att inga bubblor finns kvar. För att isolera kardiomyocyten, exponera bröstbenet hos den helt bedövade musen och lateralt till mittlinjen, skär proximalt genom revbenen och till axillen. Skär sedan genom membranet, vilket säkerställer grunda snitt för att undvika hjärtat.Kläm bröstbenet med en hemostat och vik revbenen bakåt för att exponera brösthålan. Ta bort hjärtsäcken från hjärtat försiktigt innan du skär igenom den sämre vena cava omedelbart distalt mot hjärtat. Injicera tre milliliter iskall rensningsbuffert i hjärtats högra kammare under en minut med en 27 gauge nål.Håll sedan hjärtat med pincett. Dra bort den från kroppen och exponera så mycket av aortan som möjligt. Kläm sedan fast den stigande aortan med en hemostat och punktskatta hjärtat.Överför snabbt det klämda hjärtat till locket på en polypropen Petri-skål som innehåller 10 ml varm perfusionsbuffert. Placera det fastspända hjärtat i stödplattformen och injicera 10 ml temperaturkontrollerad perfusionsbuffert vid 37 grader Celsius i vänster kammare under fem minuter med en stabiliserad 27 gauge nål fäst vid grenröret. Överför sedan det klämda hjärtat och stödplattformen till en petriskål med cirka fem milliliter matsmältningsbuffert.Byt sprutor för en 50 ml spruta innehållande 25 ml digestionsbuffert. Rensa grenröret från eventuella bubblor och den återstående perfusionsbufferten före injektion. Sätt försiktigt tillbaka nålen i samma nålposition i vänster kammartopp.Med hjälp av en perfusionspump injicerar du 37 grader Celsius matsmältningsbuffert i vänster kammare i 15 minuter med en 50 ml spruta. Kontrollera lösningens temperatur med en vattenmantel kalibrerad för att mata ut 37 grader Celsius-lösning. Ta bort ventriklerna från förmaken innan du överför dem till en 10 ml bägare.Tillsätt tre milliliter rötningsbuffert i bägaren och skär ventriklerna i stora bitar med en vass sax. Täck bägaren med aluminiumfolie och placera den i ett skakande vattenbad förvärmt till 37 grader Celsius i fem minuter. Efter kassering av supernatanten, suspendera vävnadsbitarna i tre milliliter matsmältningsbuffert och triturera den i cirka fyra minuter eller tills en homogen blandning uppnås.När du är klar, filtrera cellerna i ett 50 ml polypropenrör med en 70 mikrometer nyloncellsil. Tvätta nyloncellssil med tre milliliter matsmältningsbuffert. Sätt tillbaka filtratet i ett 14 ml rundbottnat polypropenrör och centrifugera det.Kassera supernatanten innan du återsuspenderar pelleten i tre milliliter stoppbuffert. Tillsätt 54 mikroliter 100 millimolar kalciumklorid till cellsuspensionen för att göra den slutliga kalciumkloridkoncentrationen 1,8 millimolar. Låt de levande cellerna sätta sig i 10 minuter och ta bort supernatanten som innehåller döda celler.Efter resuspendering av pelleten i en lagringslösning kan cellerna användas för funktionella experiment och kulturer. Brightfield-mikroskopbilder av isolerade celler visade att isoleringen av muskardiomyocyter producerade stavformade vilande celler utan membranblebs eller rundade kanter. Cellerna visade cirka 80% utbyte och hög överlevnad som bestämde isoleringsteknikens framgång.För lyckad isolering är det viktigast att ta bort bubblorna från grenröret och sätta in nålen i samma hål i hjärtat. När de är isolerade kan kardiomyocyterna användas för cellulära och molekylära funktionella experiment.

Research

JoVE Journal

Medicine

A Model of Disturbed Flow-Induced Atherosclerosis in Mouse Carotid Artery by Partial Ligation and a Simple Method of RNA Isolation from Carotid Endothelium

En modell av Disturbed Flow-Induced ateroskleros hos mus Carotid Artery genom partiell Ligation och en enkel metod för RNA Isolering från Carotid endotelet

Despite the well-known close association, direct evidence linking disturbed flow to atherogenesis has been lacking. We have recently used a modified ...

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

En enkel guide Skruv Metod för Intrakraniell xenograft studier på möss

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

En enkel metod för mus Lung Intubation

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes

En modifierad Nederbörd Metod för att isolera Urin exosomes

Identification of biomarkers that allow early detection of kidney diseases in urine and plasma has been an area of active interest for several years. ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

En enkel Kritisk stora Femoral Defect Model hos möss

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

A Simple Device to Rapidly Prepare Whole Mounts of the Mouse Intestine

En enkel enhet för att snabbt förbereda hela Mounts av mus tarm

Preparing whole mounts of the mouse small intestine and colon for subsequent analysis or quantification can be time consuming and difficult. We describe ...

A Simple Mechanical Procedure to Create Limbal Stem Cell Deficiency in Mouse

En enkel mekanisk procedur för att skapa limbus Stem Cell Brist på mus

Limbal stem cell deficiency (LSCD) is a state of malfunction or loss of limbal epithelial stem cells, after which the corneal epithelium is replaced with ...

Pancreatic Duct Infusion: An Effective and Selective Method of Drug and Viral Delivery

Infusion av bukspottskörteln: En effektiv och selektiv metod för läkemedels- och virusleverans

The pancreas is a bifunctional organ with both endocrine and exocrine components. A number of pathologies can afflict the pancreas, including diabetes, ...

3D Ultrasound Imaging: Fast and Cost-effective Morphometry of Musculoskeletal Tissue

3D ultraljud: snabb och kostnadseffektiv morfometri muskuloskeletala vävnad

The developmental goal of 3D ultrasound imaging (3DUS) is to engineer a modality to perform 3D morphological ultrasound analysis of human muscles. 3DUS ...