Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

نشكر الدكتورة جينفا ينغ وكريستين كانو على المناقشات المفيدة والمساعدة التقنية. DSL هو باحث في سانت بالدريك ويعترف بدعم مؤسسة سانت بالدريك (634706). تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل مؤسسة ويلش (AQ-2001-20190330) إلى DSL ، وصندوق Max and Minnie Tomerlin Voelcker (منحة الباحث الشاب لمؤسسة Voelcker إلى DSL) ، وصناديق بدء UTHSA إلى DSL ، وزمالة Greehey Graduate في صحة الأطفال إلى CNJ. يعتمد هذا العمل على الأبحاث التي أجريت في المرافق الأساسية للبيولوجيا الهيكلية ، وهي جزء من مراكز الأبحاث المؤسسية في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس في سان أنطونيو بدعم من مكتب نائب الرئيس للأبحاث والموارد المشتركة لاكتشاف الأدوية والبيولوجيا الهيكلية في مركز ميس للسرطان (NIH P30 CA054174).

المتطلبات العامة للبروتوكول: مرافق تنقية البروتين ، مطياف الأشعة المرئية وفوق البنفسجية ، مطياف الرنين المغناطيسي النووي عالي المجال وبرمجيات التشغيل ، برامج تحليل ما بعد المعالجة بما في ذلك ؛ NMRPipe32 أو Sparky33 (أو تحليل CCPN 34 أو NMRViewJ35).
<p cl...

تم تقديم طريقة لتوصيف التفاعلات العابرة الموجودة في مجموعات منخفضة بين البروتينات المضطربة جوهريا ومختلف شركاء الربط باستخدام PRE. في المثال الموضح، يرتبط البروتين ذاتيا، ومن ثم قد ينشأ PRE من مزيج من التفاعلات بين الجزيئات وداخلها. تمتد هذه الطريقة بسهولة إلى عينات غير متجانسة حيث يمكن تم?...

يصف الاضطراب الداخلي (ID) البروتينات (IDPs) أو المناطق داخل البروتينات (IDRs) التي لا تطوى تلقائيا في هياكل ثانوية أو ثالثية مستقرة ولكنها نشطة بيولوجيا. بشكل عام ، تتمثل وظيفة IDP / IDRs في تسهيل تفاعلات محددة ولكن قابلة للعكس مع الجزيئات الحيوية في الظروف الفسيولوجية1. وهكذا، يشارك النازحون داخليا والنازحون داخليا في مجموعة من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تجنيد وتنظيم وتثبيت المجمعات متعددة البروتينات، على سبيل المثال، تجميع ونشاط المركب2، وتجنيد وتنظيم المكونات في مواقع تلف الحمض النووي3، وتنظيم وتثبيت تجنيد معقدات النسخ4، أو معيد تشكيل الكروماتين BAF5. بالإضافة إلى ذلك، يوجد النازحون داخليا في روابط الإشارة حيث تمكنهم اختلاطهم مع شركاء ملزمين مختلفين من التوسط في نقل المعلومات من خلال شبكات البروتين الخلوي6. كما كشفت الأعمال الأخيرة عن ميل مناطق IDR إلى ربط المكثفات الجزيئية الحيوية ذاتية التكوين من خلال عملية فصل الطور السائلعن السائل 7. يعتقد الآن أن العديد من الوظائف المذكورة أعلاه التي تتضمن ID تتضمن بعض جوانب تكوين المكثفات8. على الرغم من أهمية تحديد الهوية للتجميع المعقد الجزيئي الحيوي ، والاستقرار ، والسقالات ، ونقل الإشارات ، يصعب تحديد التفاصيل الذرية لتفاعلاتها المحددة نظرا لأن النازحين داخليا و IDRs عادة ما يكونون غير قابلين للتحقيقات الهيكلية باستخدام علم البلورات بالأشعة السينية أو المجهر الإلكتروني المبرد.
الرنين المغناطيسي النووي (NMR) هو تقنية مثالية لفحص الهوية لأنه لا يعتمد على وجود مجموعات هيكلية صلبة أو متجانسة ولكنه يقدم تقارير عن البيئة المحلية المباشرة للنوى الفردية. يتأثر تردد الرنين ، أو التحول الكيميائي ، للنواة في جزيء معين بالمجالات المغناطيسية الضعيفة التي يسببها التوزيع الإلكتروني المحلي ، والذي يعتمد بدوره على أطوال الروابط والزوايا وقرب النوى الأخرى والتفاعلات مع شركاء الربط وعوامل أخرى9. وبالتالي ، تعمل كل نواة كمسبار هيكلي فريد خاص بالموقع حساس للتغيرات في بيئته الكيميائية المحلية. على الرغم من هذه المزايا ، فإن الرنين المغناطيسي النووي هو تقنية سائبة ، والتحول الكيميائي المرصود هو متوسط جميع البيئات التي تم أخذ عينات منها بواسطة نواة معينة. تم تطوير مجموعة من تقنيات الرنين المغناطيسي النووي ، والتي تم وصف العديد منها في هذا العدد ، لاستعادة المعلومات الهيكلية والديناميكية والحركية حول المطابقات الجزيئية الحيوية عالية الطاقة ومنخفضة السكان الموجودة في متوسط التحول الكيميائي10,11. على الرغم من أن هذه الحالات مكتظة بالسكان بشكل عابر ، إلا أن تحديد هذه الحالات وقياسها كميا مهمان لتحديد تفاصيل الآليات الوظيفية12. على سبيل المثال، في حالة النازحين داخليا والنازحين داخليا، قد تكون المجموعة التوافقية متحيزة لأخذ عينات تفضيلية من المطابقات المنتجة لتشكيل مجمعات المواجهة مع شركاء الربط الفسيولوجي. يعد الكشف عن هذه الحالات ، وكذلك تحديد التفاعلات والديناميات الجزيئية الخاصة بالبقايا وداخلها ، أمرا مهما لتحديد الآليات الهيكلية الأساسية لوظيفة البروتين والتكوين المعقد.
تم وصف بروتوكول لاستخدام الرنين المغناطيسي النووي (PRE) لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي (PRE) للتحقيق في الحالات العابرة ذات الكثافة السكانية المنخفضة المهمة لتشكيل المعقدات الجزيئية الحيوية بوساطة IDP / IDR13. هذا النهج مفيد لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين العابرة مثل تلك التي تعزز تجميع ألياف الأميلويد من α-synuclein 14,15 أو الارتباط الذاتي ل FUS16 ، وكذلك لتوصيف تفاعلات البروتين والبروتين المحددة مثل بين بروتينات الإشارة17. يتم تقديم مثال على IDP المرتبط ذاتيا ، حيث تؤدي التفاعلات المحددة بين الجزيئات وداخلها إلى حالات مضغوطة بشكل تفضيلي بالإضافة إلى تفاعلات خاصة بالموقع تدفع الارتباط الذاتي.
ينشأ PRE من التفاعل المغناطيسي ثنائي القطب للنواة إلى مركز مغناطيسي مع موتر g متناحي الخواص ، يتم توفيره عادة في شكل إلكترون غير مزاوج على مجموعة نيتروكسيد أو كذرة فلز بارامغناطيسية18 (الشكل 1). في حين أن الذرات ذات الموترات g-tensors متباينة الخواص تنتج أيضا تأثير PRE ، فإن تحليل هذه الأنظمة يكون أكثر صعوبة بسبب التأثيرات المربكة التي تساهم بها تحولات الاتصال الزائفة (PCS) أو الاقتران ثنائي القطب المتبقي (RDC)13,19. تعتمد قوة التفاعل بين النواة والمركز المغنطيسي على المسافة <r-6> بين الاثنين. ينتج عن هذا التفاعل زيادة في معدلات الاسترخاء النووي ، مما يؤدي إلى توسيع الخط القابل للكشف حتى بالنسبة للتفاعلات طويلة المدى (~ 10-35 Å) ، لأن اللحظة المغناطيسية للإلكترون غير المزاوج قوية جدا20,21. يمكن اكتشاف الحالات العابرة باستخدام PRE إذا تم استيفاء الشرطين التاليين ؛ (1) التفاعل العابر في تبادل سريع على المقياس الزمني للرنين المغناطيسي النووي (التحول الكيميائي المرصود هو متوسط مرجح للسكان لحالات التبادل) ؛ و (2) تكون المسافة بين النوى والمركز المغنطيسي أقصر في الحالة المأهولة بالسكان بشكل عابر منها في الحالة الرئيسية11. يشار إلى PRE المستعرض Γ2 ، ولأغراض عملية ، يتم حسابه من الفرق في معدلات الاسترخاء المستعرض 1H بين عينة تحتوي على مركز مغناطيسي وتحكم مغناطيسي. للحصول على معالجة متعمقة لنظرية PRE وتحولات الاتصال الزائف ذات الصلة في أنظمة التبادل السريع والبطيء ، تتم إحالة القارئ إلى المراجعات الشاملة التي أجراها كلور وزملاؤهفي العمل 13،22. هنا ، يتم النظر فقط في الحالة التي يكون فيها 1H N-Γ2 في نظام التبادل السريع ، حيث بسبب اعتماد r-6 على PRE، يرتبط معدل الاسترخاء الملحوظ بكل من المسافة التي يقترب منها المركز المغنطيسي من النواة وكذلك مقدار الوقت الذي يقضيه في هذا التشكل. لذلك ، فإن المطابقات العابرة التي لا تنطوي على نهج وثيق تنتج PRE صغيرا بينما التفاعلات الأوثق ، حتى لو كانت قصيرة الأجل ، ستنتج PRE.
بالنسبة للنازحين داخليا ، يتم استخدام PRE لقياس وتمييز التفاعلات التي تحدث داخل جزيء واحد (داخل الجزيئات) وبين جزيئات منفصلة (بين الجزيئات). من خلال ربط مركز مغناطيسي ببروتين الرنين المغناطيسي النووي المرئي (على سبيل المثال ، 15N-labeld) أو NMR غير المرئي (على سبيل المثال ، الوفرة الطبيعية 14N) ، يمكن تحديد المصدر (بين أو داخل الجزء) من PRE (الشكل 2). يعد الطفرات الموجهة للموقع والتي تقدم بقايا السيستين طريقة ملائمة لربط مركز مغناطيسي (ملصق مغزلي) ببروتين23. تم اقتراح عدة أنواع من الجزيئات لاستخدامها كعلامات مغزلية ، بما في ذلك مخلب المعادن (القائم على EDTA) والجذور الحرة (القائمة على النيتروكسيد)24. تم وصف العديد من ملصقات دوران النيتروكسيد وهي متوفرة مع كيمياء مختلفة تفاعلية للسيستين مثل ميثانثيوسلفونات وماليميد ويودواسيتاميد25,26 (الشكل 1). قد تكون المرونة المتأصلة في العلامة أو الرابط مشكلة بالنسبة لبعض التحليلات ، وفي هذه الحالات ، تم اقتراح استراتيجيات مختلفة للحد من حركة العلامة ، مثل إضافة مجموعات كيميائية ضخمة أو استخدام رابط ثان لتثبيت العلامة على البروتين (ملحق موقعين)27 ، 28. بالإضافة إلى ذلك ، قد تحتوي العلامات المتاحة تجاريا على بروتينات دياستيرومريك ولكن هذا بشكل عام لن يساهم في PRE29 المرصود. يوصف استخدام 3-Maleimido-PROXYL المرتبط بالسيستين الحر عبر كيمياء ماليميد لأنه متاح بسهولة وفعال من حيث التكلفة وغير قابل للعكس ، ويمكن الحفاظ على عامل الاختزال tris (2-carboxyethyl) phosphine (TCEP) في المحلول طوال تفاعل وضع العلامات. نظرا لأن 3-Maleimido-PROXYL يحتوي على موتر g متناحي الخواص ، فلا يتم تحفيز PCS أو RDCs ، ويمكن استخدام نفس تخصيصات التحول الكيميائي لكل من العينات المغناطيسية والمغناطيسية13.
يتم قياس 1HN-T 2 باستخدام استراتيجية نقطتين زمنيتين (T a ، Tb) التي ثبت سابقا أنها دقيقة مثل جمع سلسلة تطور كاملة تتكون من 8 إلى 12 نقطة زمنية30. يتم تعيين النقطة الزمنية الأولى (T a) بالقرب من الصفر قدر الإمكاني ، ويعتمد الطول الأمثل للنقطة الزمنية الثانية على حجم أكبر PRE متوقع لعينة معينة ويمكن تقديره من: Tb ~ 1.15 / (R 2، dia + Γ 2) حيث R 2 ، dia يمثل R 2 للعينة المغناطيسية13. إذا كان حجم أكبر PREs غير معروف ، فإن ضبط T b على ~ مرة واحدة في 1H T 2 للبروتين هو تقدير أولي جيد ويتم تحسينه بشكل أكبر عن طريق ضبط T2 لتحسين الإشارة إلى الضوضاء. تقلل استراتيجية القياس المكونة من نقطتين بشكل كبير من الوقت التجريبي اللازم لقياس PREs وتتيح الوقت لمزيد من متوسط الإشارة ، خاصة وأن العينات المخففة نسبيا تستخدم لتقليل آثار الاتصالات غير المحددة بين الجزيئات. يتم استخدام تسلسل النبض القائم على HSQC لقياس 1H N-T2 وقد تم وصفه بالتفصيل في مكان آخر30. لتحسين الحساسية ، يمكن استبدال النبضات الصلبة لعمليات نقل INEPT الأمامية والخلفية بنبضات على شكل ؛ بدلا من ذلك ، يتم تحويل التسلسل بسهولة إلى قراءاتتستند إلى TROSY-based 31. وبما أن النازحين داخليا عادة ما يكون لديهم معدلات استرخاء عرضية أطول بكثير مما يؤدي إلى عرض خط أضيق (بسبب الاضطراب المتأصل) من البروتينات الكروية ذات الحجم المماثل، يمكن استخدام أوقات اكتساب طويلة في البعد غير المباشر لتحسين الاستبانة الطيفية والتخفيف من قيود تشتت التحول الكيميائي المتأصلة في النازحين داخليا.
PRE هي أداة مفيدة لدراسة تفاعلات البروتين والبروتين والحمض النووي ، وخاصة التفاعلات العابرة أو منخفضة السكان. يتم توفير بروتوكول مفصل لإعداد عينة الرنين المغناطيسي النووي المناسبة لقياس PREs ، بما في ذلك خطوات تنقية البروتين ، ووضع العلامات الدورانية الموجهة للموقع ، وإعداد ومعايرة برنامج النبض ، ومعالجة وتفسير بيانات الرنين المغناطيسي النووي. لوحظت اعتبارات تجريبية مهمة في جميع أنحاء والتي قد تؤثر على جودة البيانات والنتائج التجريبية ، بما في ذلك تركيز العينة ، واختيار التسمية المغزلية ، وإزالة المكونات البارامغناطيسية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

تشكل البروتينات المضطربة جوهريا والمناطق المضطربة جوهريا داخل البروتينات جزءا كبيرا ومهما وظيفيا من البروتين البشري. تسمح الطبيعة المرنة للغاية لهذه التسلسلات بتكوين تفاعلات ضعيفة وطويلة المدى وعابرة مع شركاء جزيئيين حيويين متنوعين. تعمل التفاعلات المحددة ذات التقارب المنخفض على تعزيز الارتباط غير المشروع وتمكين جزء واحد مضطرب جوهريا من التفاعل مع العديد من المواقع المستهدفة. بسبب الطبيعة العابرة لهذه التفاعلات ، قد يكون من الصعب توصيفها بطرق البيولوجيا الهيكلية التي تعتمد على البروتينات لتشكيل شكل واحد سائد. يعد الرنين المغناطيسي النووي لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي أداة مفيدة لتحديد وتعريف الأساس الهيكلي للتفاعلات الضعيفة والعابرة. تم وصف بروتوكول مفصل لاستخدام تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لتوصيف مجمعات المواجهة منخفضة السكان التي تتشكل بين البروتينات المضطربة جوهريا وبروتينها أو حمضها النووي أو شركاء جزيئيين حيويين آخرين.

تم تسجيل الجزيئات 1HN-Γ 2 PREs على جزء مرتبط ذاتيا ومضطرب جوهريا (بقايا 171-264) مشتق من مجال منخفض التعقيد لبروتين ربط الحمض النووي الريبي EWSR142 (الشكل 3). ومن المتوقع أن تتسع المخلفات المتتالية القريبة من نقطة التعلق بعلامة الدوران (مثل البقايا 178...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

يتم تقديم بروتوكول لتطبيق التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي لتعزيز الاسترخاء المغنطيسي للكشف عن التفاعلات الضعيفة والعابرة بين الجزيئات وداخلها في البروتينات المضطربة جوهريا.

تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لاكتشاف وتوصيف الارتباطات الذاتية للبروتينات المضطربة جوهريا

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

يمكن استخدام تقنية تعزيز الاسترخاء المغنطيسي لتوصيف وقياس المسافات بين الجزيئات وتحديد التفاعلات الجزيئية الحيوية العابرة و / أو منخفضة السكان. هنا ، طبقنا هذه التقنية لالتقاط التفاعلات التي تسبق تكثيف البروتين. تتيح حساسية PREs تحديد الدقة الذرية والكشف والقياس الكمي للحالة الديناميكية التي تظل غير مرئية ولا يمكن الوصول إليها لتقنيات الرنين المغناطيسي النووي الأخرى.تتضمن الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول إزالة ملصق دوران النيتروكسيد غير المقترن وتحليل الأطياف بعناية لقياس ارتفاع الذروة بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب توخي الحذر أثناء إعداد تجربة الرنين المغناطيسي النووي ومعايرة النبض. للبدء ، أضف 3-maleimido-PROXYL من محلول مخزون عند 20 مرة زيادة مولية من البروتين المسمى نظائريا 15N محل الاهتمام.احتضان بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة أو أربع درجات مئوية محمية من الضوء والأكسجين ومع هزاز لطيف أو nutation. في اليوم التالي ، قم بإزالة ملصق الدوران الحر غير المتفاعل لمنع المذيب غير المحدد PRE باستخدام إما غسيل الكلى الشامل لعينة البروتين أو باستخدام ترشيح الهلام. ثم استخدم كاشف إيلمان لتحديد مجموعات سلفهيدريل الحرة في المحلول.قم بقياس الامتصاص باستخدام قارئ الصفائح الدقيقة وقم ببناء المنحنى القياسي. لقياس PRE، قم بإعداد بروتين 15N المخصب بالنظائر المسمى بتركيز لا يقل عن 100 ميكرومولار ، ولكن ليس أكثر من 300 ميكرومولار ، في مخزن مؤقت مناسب للرنين المغناطيسي النووي. ثم باستخدام ماصة زجاجية طويلة الساق أو ماصة دقيقة ، انقل عينة الرنين المغناطيسي النووي إلى أنبوب NMR بخمسة ملليمترات مناسب للاستخدام في المغناطيسات عالية المجال.ضع العينة في المغناطيس. قفل على إشارة الديوتيريوم باستخدام أمر القفل وتناغم ومطابقة قناة البروتون وفقا لبروتوكولات المنشأة. ثم اضبط الحشوات باستخدام الروتين الفرعي العلوي للرقاقة لتحسين قمع إشارة المذيبات.بعد ذلك ، قم بمعايرة نبضة البروتون باستخدام برنامج P-OPT. ثم قم بمعايرة نبضة 15N مقابل عينة قياسية. حدد التوهين الصحيح لنبضات الشكل باستخدام الروتين الفرعي لأداة الشكل.ثم افتح ملف شكل النبض المناسب بالنقر فوق رمز المجلد. تم العثور على النبضات المشكلة في قسم معلمات النبض لمعلمات الاستحواذ. بعد تحميل ملف تعريف النبض ، انقر فوق تحليل الشكل الموجي ، متبوعا بدمج الشكل.أدخل النبضة الصلبة للبروتون المعاير 90 درجة ، وطول نبضة الشكل المطلوب ، والدوران. ثم احسب مستوى طاقة النبضة المشكلة عن طريق إضافة تغيير مستوى الطاقة إلى التوهين للنبضة المعايرة 90 درجة. سجل بروتون قياسي 15N HSQC لتحسين عرض المسح وتردد الموجة الحاملة والتحقق من قمع المياه.أخيرا، اضبط عرض الاجتياح وعدد زيادات الأبعاد غير المباشرة باستخدام أوامر SW وTD أو مباشرة في شاشات التشغيل المناسبة. معايرة النبضات المشكلة كما هو موضح سابقا. ثم أدخل أطوال النبضات المعايرة في قسم معلمات النبض في علامة التبويب معلمات الاكتساب.لقياس بروتون الأميد T2 باستخدام نهج نقطتي تأخير زمنيتين ، اضبط التأخيرات الزمنية عن طريق تحرير ملف قائمة VD. يتم ضبط التأخير الأول على 0.01 مللي ثانية. باستخدام العلاقة إلى الحد الأقصى المتوقع ل PRE، اختر التأخير الثاني.ثم حدد قيمة مناسبة من خلال مقارنة الزيادات الأولى من أطياف التأخير الأول والثاني وضبط التأخير الثاني بحيث تضمحل الإشارة إلى ما بين 40 إلى 50٪ من قيمتها الأولية. حدد عدد النقاط المعقدة المراد تسجيلها وعدد عمليات المسح للحصول على متوسط إشارة كاف. ثم استخدم الأمر EXPT لحساب وقت التجربة وبدء التجربة باستخدام الأمر ZG. بعد إذابة أسكوربات الصوديوم في المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي ، اضبط الرقم الهيدروجيني لمطابقة المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي الأصلي.ثم أضف حمض الأسكوربيك إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي عند زيادة مولية 10 مرات فوق تركيز ملصق الدوران عن طريق وضع قطرة أسفل حافة الأنبوب. قم بتغطية الأنبوب واقلبه بعناية للخلط. تدور عند 200 إلى 400 جم لمدة 10 إلى 20 ثانية في جهاز طرد مركزي يدوي لتسوية العينة في قاع الأنبوب.بعد لف الأنبوب بورق ، اترك التفاعل يستمر لمدة ثلاث ساعات على الأقل. ثم سجل أميد بروتون T2 على العينة المغناطيسية باستخدام نفس المعلمات المستخدمة للعينة البارامغناطيسية. تم تسجيل أميد بروتون جاما داخل الجزيئات على جزء مضطرب جوهريا مرتبط ذاتيا مشتق من مجال التعقيد المنخفض لبروتين ربط الحمض النووي الريبي EWSR1.من المتوقع أن يتم توسيع المخلفات القريبة من نقطة ربط ملصق الدوران بشكل كبير ولا يمكن اكتشافها في الطيف. كانت البقايا التي كانت متباعدة بالتتابع من نقطة التعلق ولكنها أظهرت جاما محسنة قريبة مكانيا من ملصق الدوران. في حالة البروتينات المضطربة جوهريا ، فإن تسجيل وتحليل الهريس سينتج عنه معلومات حول الاتصالات داخل الجزيئات وأسطح التفاعل العابرة.يمكن أن يوفر الجمع بين قياسات PRE والطرق الفيزيائية الحيوية الأخرى مثل تشتت الضوء الديناميكي ، وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم ، والطرد المركزي الفائق التحليلي ، والطرق الحسابية رؤى أعمق. يساعد قياس PRE في توصيف الحالة العابرة ذات الكثافة السكانية المنخفضة. يمكن توسيع هذا النهج لتوصيف التفاعلات المهمة لعدد لا يحصى من العمليات البيولوجية مثل التعرف الجزيئي ، والانتقاء التوافقي الخيفي ، وعمليات التجميع بما في ذلك تجميع العضيات الخالية من الأغشية عن طريق فصل الطور.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

النووي التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي لتحديد Phosphorylations متعددة من جوهريا المختلين البروتينات

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

استخدام الإلكترون الرنين باراماجنيتيك في العينات البيولوجية في درجة الحرارة المحيطة و 77 ك

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

تلوين الفضة الفلورسنت من البروتينات في المواد الهلامية Polyacrylamide

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

التعبير، تنقية، تبلور، واختبارات إنزيم من البروتينات التي تحتوي على مجال الهيدرولاز اتاتس

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b المؤتلف المجهزة بالبالكامل: عزل وتوصيف البروتين فارنيسلاتيد وميثيل

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

المقطع المستعرض من الأرز الناضج(Oryza sativa L.) حبات لمسح المجهر الإلكتروني التصوير باستخدام نصائح ماصة كدعم تعطيل

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG التشتت الاسترخاء للتحقيق في ديناميات تشكيل البروتين على مقياس زمني μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

الجوانب العملية لإعداد عينة والإعداد من 1H R1ρ تجارب التشتت الاسترخاء من الجيش الملكي النيبالي

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...