Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Vi takker Dr. Jinfa Ying og Kristin Cano for nyttige diskussioner og teknisk assistance. DSL er en St. Baldrick's Scholar og anerkender støtten fra St. Baldrick's Foundation (634706). Dette arbejde blev delvist støttet af Welch Foundation (AQ-2001-20190330) til DSL, Max og Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant til DSL), UTHSA Start-Up Funds til DSL og et Greehey Graduate Fellowship in Children's Health til CNJ. Dette arbejde er baseret på forskning udført i Structural Biology Core Facilities, en del af de institutionelle forskningskerner ved University of Texas Health Science Center i San Antonio støttet af Office of the Vice President for Research og Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Generelle krav til protokollen: proteinrensningsfaciliteter, UV-Vis-spektrometer, højfelts NMR-spektrometer og driftssoftware, software til efterbehandlingsanalyse, herunder; NMRPipe32, Sparky 33 (eller CCPN-analyse 34 eller NMRViewJ35).
1. Rekombinant ekspression og oprensning af et protein til PRE-målinger
<ol><li>Design en ekspressionskonstruktion for proteinet af interesse, så der er en enk...

En metode til karakterisering af forbigående interaktioner, der eksisterer ved lave populationer mellem iboende uordnede proteiner og forskellige bindingspartnere, der bruger PRE, er blevet præsenteret. I det viste eksempel er proteinet selvassocierende, og PRE kan således opstå ved en kombination af inter- og intramolekylære interaktioner. Denne metode udvides let til heterogene prøver, hvor interaktionerne mellem to forskellige proteiner kan karakteriseres. Supplerende information om, hvordan forskellige regioner...

Intrinsic disorder (ID) beskriver proteiner (IDP'er) eller regioner inden for proteiner (IDR'er), der ikke spontant folder sig ind i stabile sekundære eller tertiære strukturer, men er biologisk aktive. Generelt er funktionen af IDP / IDR'er at lette specifikke, men reversible interaktioner med biomolekyler under fysiologiske forhold1. Således er IDP'er og IDR'er involveret i en række cellulære funktioner, herunder rekruttering, organisering og stabilisering af multiproteinkomplekser, for eksempel samling og aktivitet af spliceosom2, rekruttering og organisering af komponenter på steder med DNA-skade3, organisering og stabilisering af rekrutteringen af transkriptionskomplekser4 eller af kromatinremodeleren BAF5. Derudover findes IDP'er ved signalering af nexuser, hvor deres promiskuitet for forskellige bindingspartnere gør det muligt for dem at formidle informationsoverførsel gennem cellulære proteinnetværk6. Nyligt arbejde har også afsløret en tilbøjelighed for IDR-regioner til selvassociering af dannelse af biomolekylære kondensater gennem processen med væske-væskefaseseparation7. Mange af de førnævnte funktioner, der involverer ID, menes nu også at involvere et aspekt af kondensatdannelse8. På trods af ID's betydning for biomolekylær kompleks samling, stabilisering, stilladser og signaltransduktion er de atomare detaljer om deres specifikke interaktioner vanskelige at identificere, da IDP'er og IDR'er typisk ikke er modtagelige for strukturelle undersøgelser ved hjælp af røntgenkrystallografi eller kryogen elektronmikroskopi.
Kernemagnetisk resonans (NMR) er en ideel teknik til undersøgelse af ID, da den ikke er afhængig af tilstedeværelsen af stive eller homogene strukturelle ensembler, men rapporterer om det umiddelbare lokale miljø for individuelle kerner. Resonansfrekvensen eller det kemiske skift af en kerne i et givet molekyle påvirkes af svage magnetfelter induceret af den lokale elektroniske fordeling, som igen er afhængig af bindingslængder, vinkler, nærhed af andre kerner, interaktioner med bindingspartnere og andre faktorer9. Således fungerer hver kerne som en unik, stedspecifik strukturel sonde, der er følsom over for ændringer i dets lokale kemiske miljø. På trods af disse fordele er NMR en bulkteknik, og det observerede kemiske skift er gennemsnittet af alle de miljøer, der udtages af en bestemt kerne. En række NMR-teknikker, hvoraf mange er beskrevet i dette nummer, er blevet udviklet til at genvinde strukturel, dynamisk og kinetisk information om højenergiske, lavt befolkede biomolekylære konformationer indeholdt i det gennemsnitlige kemiske skift10,11. Selv om disse tilstande er forbigående befolket, er identifikation og kvantificering vigtig for at bestemme detaljerne i funktionelle mekanismer12. For eksempel kan konformationsensemblet i tilfælde af IDP'er og IDR'er være forudindtaget til fortrinsvis at prøve konformationer, der er produktive til dannelse af mødekomplekser med fysiologiske bindingspartnere. Påvisning af disse tilstande samt identifikation af de restspecifikke inter- og intramolekylære interaktioner og dynamikker er vigtige for at bestemme de underliggende strukturelle mekanismer for proteinfunktion og kompleks dannelse.
En protokol til brug af paramagnetisk afslapningsforbedring (PRE) NMR til at undersøge forbigående, lavt befolkede tilstande, der er vigtige for dannelsen af IDP / IDR-medierede biomolekylære komplekser, er beskrevet13. Denne tilgang er nyttig til at studere de forbigående protein-proteininteraktioner, såsom dem, der fremmer samlingen af amyloidfibriller fra α-synuclein 14,15 eller selvforeningen af FUS16, samt at karakterisere specifikke protein-proteininteraktioner, såsom mellem signalproteiner17. Et eksempel på en selvassocierende IDP præsenteres, hvor specifikke inter- og intramolekylære interaktioner resulterer i fortrinsvis komprimerede tilstande såvel som stedspecifikke interaktioner, der driver selvforening.
PRE stammer fra den magnetiske dipolære interaktion mellem en kerne og et paramagnetisk center med en isotrop g-tensor, der almindeligvis leveres i form af en uparret elektron på en nitrogenoxidgruppe eller som et paramagnetisk metalatom18 (figur 1). Mens atomer med anisotrope g-tensorer også producerer en PRE-effekt, er analyse af disse systemer vanskeligere på grund af forvirrende effekter bidraget af pseudokontaktskift (PCS) eller resterende dipolær kobling (RDC)13,19. Styrken af interaktionen mellem en kerne og det paramagnetiske centrum afhænger af afstanden på <r-6> mellem de to. Denne interaktion resulterer i en stigning i nukleare afslapningshastigheder, hvilket forårsager detekterbar linjeudvidelse selv for langtrækkende interaktioner (~ 10-35 Å), fordi det magnetiske moment for den uparrede elektron er så stærk20,21. Påvisning af forbigående tilstande med PRE er mulig, hvis følgende to betingelser er opfyldt; (1) den forbigående interaktion er i hurtig udveksling på NMR-tidsskalaen (observeret kemisk skift er et befolkningsvægtet gennemsnit af udvekslingstilstandene); og (2) kernerne til paramagnetisk centerafstand er kortere i den forbigående befolkede tilstand end i den store tilstand11. Den tværgående PRE betegnes Γ2 og beregnes til praktiske formål ud fra forskellen i 1H tværgående afslapningshastigheder mellem en prøve indeholdende et paramagnetisk center og en diamagnetisk kontrol. For en dybdegående behandling af teorien om PRE og relaterede pseudokontaktskift i hurtige og langsomme udvekslingsregimer henvises læseren til de omfattende anmeldelser af Clore og kolleger13,22. Her overvejes kun situationen, hvor 1HN-Γ 2 er i hurtigudvekslingsregimet, hvor den observerede afslapningshastighed på grund af PRE's r-6-afhængighed er relateret til både den afstand, som det paramagnetiske center nærmer sig kernen såvel som den tid, den bruger i denne konformation. Derfor producerer forbigående konformationer, der ikke involverer en tæt tilgang, en lille PRE, mens tættere interaktioner, selvom de er kortvarige, vil producere en større PRE.
For internt fordrevne anvendes PRE til at måle og differentiere interaktionerne inden for et enkelt molekyle (intramolekylært) og mellem separate molekyler (intermolekylært). Ved at fastgøre et paramagnetisk center til et NMR-synligt (f.eks. 15N-mærket) eller NMR-usynligt (f.eks. naturligt overflod 14N) protein, kan kilden (inter- eller intramolekylær) til PRE bestemmes (figur 2). Site-rettet mutagenese, der introducerer en cysteinrest, er en bekvem tilgang til at vedhæfte et paramagnetisk center (spin-label) til et protein23. Flere typer molekyler er blevet foreslået til brug som spin-etiketter, herunder metalchelatering (EDTA-baseret) og frie radikaler (nitrogenoxidbaseret)24. Forskellige nitrogenoxidspinetiketter er blevet beskrevet og fås med forskellige cystein-reaktive kemikalier, såsom methenethiosulfonat, maleimid og iodoacetamid25,26 (figur 1). Mærkets eller linklinkerens iboende fleksibilitet kan være problematisk i forbindelse med visse analyser, og i disse situationer er der foreslået forskellige strategier for at begrænse mærkets bevægelse, f.eks. ved at tilføje omfangsrige kemiske grupper eller brugen af en anden linker til at forankre mærket til proteinet (fastgørelse på to steder)27. 28. Derudover kan kommercielt tilgængelige mærker indeholde diastereomere proteiner, men generelt vil dette ikke bidrage til den observerede PRE29. Anvendelsen af 3-maleimido-PROXYL bundet til en fri cystein via maleimidkemi er beskrevet, da det er let tilgængeligt, omkostningseffektivt, ikke-reversibelt, og reduktionsmidlet tris (2-carboxyethyl) phosphin (TCEP) kan opretholdes i opløsningen gennem hele mærkningsreaktionen. Da 3-Maleimido-PROXYL har en isotrop g-tensor, induceres der ingen PCS eller RDC'er, og de samme kemiske skiftopgaver kan bruges til både de paramagnetiske og diamagnetiske prøver13.
1HN-T 2 måles ved hjælp af en to-punktsstrategi (T a, Tb), der tidligere har vist sig at være lige så nøjagtig som at indsamle en fuld evolutionsserie bestående af 8 til 12 tidspunkter30. Det første tidspunkt (T a) er sat så tæt på nul som praktisk muligt, og den optimale længde af det andet tidspunkt afhænger af størrelsen af den største forventede PRE for en given prøve og kan estimeres ud fra: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2), hvor R 2,dia repræsenterer R2 i den diamagnetiske prøve13. Hvis størrelsen af de største PRE'er er ukendt, er indstilling af T b til ~ en gange proteinets 1H T2 et godt indledende estimat og yderligere optimeret ved at justere T2 for at forbedre signalet til støj. Denne topunktsmålestrategi reducerer signifikant den eksperimentelle tid, der kræves for at måle PRE'er, og giver tid til mere signalgennemsnit, især da relativt fortyndede prøver bruges til at minimere virkningerne af ikke-specifikke kontakter mellem molekyler. En HSQC-baseret pulssekvens bruges til at måle 1H N-T2 og er beskrevet detaljeret andetsteds30. For at forbedre følsomheden kan de hårde impulser fra INEPT-overførsler fremad og tilbage erstattes med formede impulser; alternativt konverteres sekvensen let til en TROSY-baseret aflæsning31. Da internt fordrevne typisk har meget længere tværgående afslapningshastigheder, hvilket resulterer i smallere linjebredder (på grund af den iboende lidelse) end globulære proteiner af samme størrelse, kan lange erhvervelsestider i den indirekte dimension bruges til at forbedre spektralopløsningen og lindre den kemiske forskydningsdispersionsbegrænsning, der er iboende for internt fordrevne.
PRE er et nyttigt værktøj til at studere protein-protein og protein-nukleinsyre interaktioner, især interaktioner, der er forbigående eller lavt befolket. Der gives en detaljeret protokol til forberedelse af en NMR-prøve, der er egnet til måling af PRE'er, herunder trin til proteinoprensning, stedrettet spinmærkning, opsætning og kalibrering af pulsprogrammet, behandling og fortolkning af NMR-dataene. Vigtige eksperimentelle overvejelser bemærkes overalt, der kan påvirke datakvaliteten og eksperimentelle resultater, herunder prøvekoncentration, valg af spin-etiket og fjernelse af paramagnetiske komponenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Iboende uordnede proteiner og iboende uordnede regioner i proteiner udgør en stor og funktionelt signifikant del af det humane proteom. Den meget fleksible karakter af disse sekvenser giver dem mulighed for at danne svage, langtrækkende og forbigående interaktioner med forskellige biomolekylære partnere. Specifikke, men alligevel lavaffinitetsinteraktioner fremmer promiskuøs binding og gør det muligt for et enkelt iboende forstyrret segment at interagere med en lang række målsteder. På grund af den forbigående karakter af disse interaktioner kan de være vanskelige at karakterisere ved strukturelle biologiske metoder, der er afhængige af proteiner til at danne en enkelt, dominerende konformation. Paramagnetisk afslapningsforbedring NMR er et nyttigt værktøj til at identificere og definere den strukturelle understøttelse af svage og forbigående interaktioner. En detaljeret protokol til brug af paramagnetisk afslapningsforbedring til at karakterisere de lavt befolkede mødekomplekser, der dannes mellem iboende uordnede proteiner og deres protein, nukleinsyre eller andre biomolekylære partnere, er beskrevet.

Intramolekylære 1H N-Γ2 PRE'er blev registreret på et selvassocierende, iboende uordnet fragment (rester 171-264) afledt af lavkompleksitetsdomænet af det RNA-bindende protein EWSR142 (figur 3). Restkoncentrationer i umiddelbar sekventiel nærhed af spin-label-fastgørelsespunktet (f.eks. rest 178 eller 260 i figur 3) forventes at blive væsentligt udvidet og kan ikke påvises i spektret. Rest...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

En protokol til anvendelse af paramagnetisk afslapningsforbedring NMR-spektroskopi til påvisning af svage og forbigående inter- og intramolekylære interaktioner i iboende uordnede proteiner præsenteres.

Paramagnetisk afslapningsforbedring til påvisning og karakterisering af selvforeninger af iboende uordnede proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Den paramagnetiske afslapningsforbedringsteknik kan bruges til at karakterisere og måle intermolekylære afstande og kvantificere forbigående og / eller lavt befolkede biomolekylære interaktioner. Her har vi anvendt denne teknik til at fange interaktioner, der går forud for proteinkondensation. PRE'ernes følsomhed muliggør atomopløsningsidentifikation, detektion og kvantificering af dynamisk tilstand, der forbliver usynlig og utilgængelig for andre NMR-teknikker.Nøgletrin i denne protokol inkluderer fjernelse af den ukonjugerede nitrogenoxidspin-etiket og omhyggeligt analyse af spektrene for nøjagtigt at måle tophøjden. Derudover skal der udvises forsigtighed under NMR-eksperimentopsætning og pulskalibrering. Til at begynde med tilsættes 3-maleimido-PROXYL fra en stamopløsning ved 20 gange molært overskud af det 15N isotopisk mærkede protein af interesse.Inkuber natten over ved stuetemperatur eller fire grader Celsius beskyttet mod lys og ilt og med blid vuggen eller nutation. Den følgende dag fjernes den ikke-reagerede free spin-etiket for at forhindre ikke-specifik opløsningsmiddel-PRE ved enten omfattende dialyse af proteinprøven eller ved hjælp af gelfiltrering. Brug derefter Ellmans reagens til at kvantificere frie sulfhydrylgrupper i opløsningen.Absorbansen måles ved hjælp af en mikropladelæser, og standardkurven konstrueres. For at måle intramolekylær PRE fremstilles 15N isotopisk beriget spinmærket protein til en koncentration på mindst 100 mikromolar, men ikke mere end 300 mikromolar, i en buffer, der er egnet til NMR. Brug derefter en glaspipette med lang stilk eller mikropipette til at overføre NMR-prøven til et fem millimeter NMR-rør, der er egnet til brug i højfeltmagneter.Anbring prøven i magneten. Lås på deuteriumsignalet ved hjælp af låsekommandoen og indstil og match protonkanalen i henhold til facilitetsprotokoller. Juster derefter shims ved hjælp af den øverste shim-subrutine for at optimere undertrykkelsen af opløsningsmiddelsignalet.Kalibrer derefter protonpulsen ved hjælp af P-OPT-programmet. Kalibrer derefter 15N-pulsen mod en standardprøve. Bestem den korrekte dæmpning for formede impulser ved hjælp af formværktøjets subrutine.Åbn derefter den relevante pulsformfil ved at klikke på mappeikonet. De formede impulser findes i afsnittet om pulsparametre i erhvervelsesparametre. Når du har indlæst pulsdefinitionsfilen, skal du klikke på Analysér bølgeform efterfulgt af Integrer form.Indtast den kalibrerede proton 90 graders hård puls, ønsket form, pulslængde og rotation. Beregn derefter effektniveauet for den formede puls ved at tilføje ændringen af effektniveau til dæmpningen for den kalibrerede 90 graders puls. Optag en standard proton 15N HSQC for at optimere fejebredde, bærefrekvens og kontrollere vandundertrykkelse.Til sidst skal du justere fejebredden og antallet af indirekte dimensionsintervaller ved hjælp af SW- og TD-kommandoerne eller direkte i de relevante dialogbokse. Kalibrer de formede impulser som vist tidligere. Indtast derefter de kalibrerede pulslængder i afsnittet pulsparametre under fanen Anskaffelsesparametre.For at måle amidprotonen T2 ved hjælp af tilgangen med to tidsforsinkelsespunkter skal du indstille tidsforsinkelserne ved at redigere VD-listefilen. Den første forsinkelse er indstillet til 0,01 millisekunder. Brug relationen til den forventede maksimale PRE, vælg den anden forsinkelse.Derefter bestemmes en passende værdi ved at sammenligne de første trin i det første og andet forsinkelsesspektre og justere den anden forsinkelse, således at signalet henfalder til mellem 40 og 50% af dets oprindelige værdi. Bestem antallet af komplekse punkter, der skal registreres, og antallet af scanninger for tilstrækkelig signalgennemsnit. Brug derefter kommandoen EXPT til at beregne eksperimenttiden og starte eksperimentet med kommandoen ZG. Efter opløsning af natriumascorbat i NMR-bufferen justeres pH-værdien, så den svarer til den oprindelige NMR-buffer.Derefter tilsættes ascorbinsyren til NMR-røret med et 10 gange molært overskud over koncentrationen af spinetiketten ved at placere en dråbe under rørets kant. Sæt hætten på røret og vend forsigtigt på hovedet for at blande. Drej ved 200 til 400 G i 10 til 20 sekunder i en håndsvinget centrifuge for at bundfælde prøven i bunden af røret.Efter indpakning af røret i folie skal reaktionen fortsætte i mindst tre timer. Derefter registreres amidproton T2 på den diamagnetiske prøve ved hjælp af de samme parametre, der anvendes til den paramagnetiske prøve. Intramolekylære amidprotongammaer PRE'er blev registreret på et selvassocierende iboende uordnet fragment afledt af det lave kompleksitetsdomæne af RNA-bindingsproteinet EWSR1.Restkoncentrationer i umiddelbar nærhed af spin-mærkets fastgørelsespunkt forventes at blive væsentligt udvidet og kan ikke påvises i spektret. Rester, der var sekventielt fordelt fra fastgørelsespunktet, men alligevel viste forbedret gamma, var rumligt tæt på spin-etiketten. I tilfælde af iboende uordnede proteiner vil optagelse og analyse af puréer give information om intramolekylære kontakter og forbigående interaktionsoverflader.Kombination af PRE-målinger med andre biofysiske metoder såsom dynamisk lysspredning, størrelseseksklusionskromatografi, analytisk ultracentrifugering og beregningsmetoder kan give dybere indsigt. PRE-måling hjælper med at karakterisere forbigående tyndt befolket tilstand. Denne tilgang kan udvides til at karakterisere interaktioner, der er vigtige for utallige biologiske processer, såsom molekylær genkendelse, allosterisk konformationsvalg og samlingsprocesser, herunder samling af membranløse organeller via faseseparation.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for Identifikation af flere fosforyleringer af Intrinsically Disordered Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Brug af elektron paramagnetisk resonans i biologiske prøver ved omgivende temperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farvning af proteinerne i polyacrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Ekspression, rensning, krystallisering og enzym assays af Fumarylacetoacetat hydrolase-domæne-holdige proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fuldt forarbejdet rekombinant KRAS4b: isolering og karakterisering af det Farnesylerede og methylerede protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tværgående 2000 af ældre ris(Oryza sativa L.) Kerner til scanning elektronmikroskopi imaging ved hjælp af pipette tips som immobilisering Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 år N CPMG Afslapning Spredning til undersøgelse af protein kropsbygning Dynamics på μs-ms Tidshorisont

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiske aspekter af prøveforberedelse og opsætning af 1H R1ρ Afslapningsspredningseksperimenter af RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...