Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Wij danken Drs. Jinfa Ying en Kristin Cano voor nuttige discussies en technische assistentie. DSL is een St. Baldrick's Scholar en erkent de steun van de St. Baldrick's Foundation (634706). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Welch Foundation (AQ-2001-20190330) aan DSL, het Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant aan DSL), UTHSA Start-Up Funds aan DSL en een Greehey Graduate Fellowship in Children's Health aan CNJ. Dit werk is gebaseerd op onderzoek uitgevoerd in de Structural Biology Core Facilities, onderdeel van de Institutional Research Cores aan het University of Texas Health Science Center in San Antonio, ondersteund door het Office of the Vice President for Research en het Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Algemene vereisten voor het protocol: eiwitzuiveringsfaciliteiten, UV-Vis-spectrometer, high-field NMR-spectrometer en besturingssoftware, nabewerkingsanalysesoftware, waaronder; NMRPipe32, Sparky 33, (of CCPN-analyse34, of NMRViewJ35).
1. Recombinante expressie en zuivering van een eiwit voor PRE-metingen
<ol><li>Ontwerp een expressieconstruct voor het eiwit van belang, zodat er een enkel cysteï...

Een methode voor het karakteriseren van voorbijgaande interacties die bestaan bij lage populaties tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en verschillende bindingspartners met behulp van PRE is gepresenteerd. In het getoonde voorbeeld is het eiwit zelfassociatief en kan de PRE dus ontstaan uit een combinatie van inter- en intramoleculaire interacties. Deze methode kan gemakkelijk worden uitgebreid tot heterogene monsters waar de interacties tussen twee verschillende eiwitten kunnen worden gekarakteriseerd. Aanvullende inf...

Intrinsieke stoornis (ID) beschrijft eiwitten (IDP's) of regio's binnen eiwitten (IDR's) die zich niet spontaan vouwen tot stabiele secundaire of tertiaire structuren, maar biologisch actief zijn. Over het algemeen is de functie van IDP/IDR's het vergemakkelijken van specifieke maar omkeerbare interacties met biomoleculen onder fysiologische omstandigheden1. IDP's en IDR's zijn dus betrokken bij een reeks cellulaire functies, waaronder rekrutering, organisatie en stabilisatie van multi-eiwitcomplexen, bijvoorbeeld de assemblage en activiteit van het spliceosoom2, rekrutering en organisatie van componenten op plaatsen van DNA-schade3, organisatie en stabilisatie van de rekrutering van transcriptiecomplexen4, of van de chromatine-remodeler BAF5. Bovendien worden IDP's gevonden bij signaleringsverbindingen waar hun promiscuïteit voor verschillende bindingspartners hen in staat stelt om informatieoverdracht via cellulaire eiwitnetwerken te bemiddelen6. Recent werk heeft ook een neiging aangetoond voor IDR-regio's om zelf biomoleculaire condensaten te associëren door het proces van vloeistof-vloeistoffasescheiding7. Van veel van de bovengenoemde functies met betrekking tot ID wordt nu ook gedacht dat ze een aspect van condensaatvormingomvatten 8. Ondanks het belang van ID voor biomoleculaire complexe assemblage, stabilisatie, steigers en signaaltransductie, zijn de atomaire details van hun specifieke interacties moeilijk te identificeren, omdat IDP's en IDR's meestal niet vatbaar zijn voor structureel onderzoek met behulp van röntgenkristallografie of cryogene elektronenmicroscopie.
Nucleaire magnetische resonantie (NMR) is een ideale techniek voor het onderzoeken van ID, omdat het niet afhankelijk is van de aanwezigheid van stijve of homogene structurele ensembles, maar rapporteert over de directe lokale omgeving van individuele kernen. De resonantiefrequentie, of chemische verschuiving, van een kern in een bepaald molecuul wordt beïnvloed door zwakke magnetische velden geïnduceerd door de lokale elektronische verdeling, die op zijn beurt afhankelijk is van bindingslengtes, hoeken, nabijheid van andere kernen, interacties met bindingspartners en andere factoren9. Elke kern fungeert dus als een unieke, locatiespecifieke structurele sonde die gevoelig is voor veranderingen in zijn lokale chemische omgeving. Ondanks deze voordelen is NMR een bulktechniek en de waargenomen chemische verschuiving is het gemiddelde van alle omgevingen die door een bepaalde kern worden bemonsterd. Een reeks NMR-technieken, waarvan er vele in dit nummer worden beschreven, zijn ontwikkeld om structurele, dynamische en kinetische informatie over hoogenergetische, laagbevolkte biomoleculaire conformaties in de gemiddelde chemische verschuiving10,11 te herstellen. Hoewel tijdelijk bevolkt, zijn identificatie en kwantificering van deze toestanden belangrijk voor het bepalen van de details van functionele mechanismen12. In het geval van IDP's en IDR's kan het conformatie-ensemble bijvoorbeeld bevooroordeeld zijn om bij voorkeur conformaties te bemonsteren die productief zijn voor de vorming van ontmoetingscomplexen met fysiologische bindingspartners. Detectie van deze toestanden, evenals identificatie van de residuspecifieke inter- en intramoleculaire interacties en dynamiek, zijn belangrijk om de onderliggende structurele mechanismen van eiwitfunctie en complexe vorming te bepalen.
Een protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering (PRE) NMR om voorbijgaande, dunbevolkte toestanden te onderzoeken die belangrijk zijn voor de vorming van IDP / IDR-gemedieerde biomoleculaire complexen wordt beschreven13. Deze benadering is nuttig voor het bestuderen van de voorbijgaande eiwit-eiwitinteracties, zoals die welke de assemblage van amyloïde fibrillen uit α-synucleïne 14,15 of de zelfassociatie van FUS16 bevorderen, evenals om specifieke eiwit-eiwitinteracties te karakteriseren, zoals tussen signaaleiwitten17. Een voorbeeld van een zelf-associërende IDP wordt gepresenteerd, waarbij specifieke inter- en intramoleculaire interacties resulteren in bij voorkeur verdichte toestanden en site-specifieke interacties die zelfassociatie stimuleren.
De PRE ontstaat uit de magnetische dipolaire interactie van een kern met een paramagnetisch centrum met een isotrope g-tensor, gewoonlijk geleverd in de vorm van een ongepaard elektron op een nitroxidegroep of als een paramagnetisch metaalatoom18 (figuur 1). Hoewel atomen met anisotrope g-tensoren ook een PRE-effect produceren, is analyse van deze systemen moeilijker vanwege verstorende effecten die worden bijgedragen door de pseudo-contactverschuivingen (PCS) of residuele dipolaire koppeling (RDC)13,19. De sterkte van de interactie tussen een kern en het paramagnetische centrum is afhankelijk van de <r-6> afstand tussen de twee. Deze interactie resulteert in een toename van nucleaire relaxatiesnelheden, wat detecteerbare lijnverbreding veroorzaakt, zelfs voor langeafstandsinteracties (~ 10-35 Å), omdat het magnetische moment van het ongepaarde elektron zo sterk is20,21. Detectie van voorbijgaande toestanden met de PRE is mogelijk als aan de volgende twee voorwaarden wordt voldaan; (1) de voorbijgaande interactie is in snelle uitwisseling op de NMR-tijdschaal (waargenomen chemische verschuiving is een populatiegewogen gemiddelde van de uitwisselingstoestanden); en (2) de kernen tot paramagnetische centrumafstand is korter in de tijdelijk bevolkte toestand dan in de hoofdtoestand11. De transversale PRE wordt aangeduid Γ2 en wordt voor praktische doeleinden berekend uit het verschil in 1H transversale relaxatiesnelheden tussen een monster met een paramagnetisch centrum en een diamagnetische controle. Voor een diepgaande behandeling van de theorie van de PRE en gerelateerde pseudocontactverschuivingen in snelle en langzame uitwisselingsregimes, wordt de lezer verwezen naar de uitgebreide beoordelingen door Clore en collega's13,22. Hier wordt alleen de situatie overwogen waarin 1H N-Γ2 zich in het snelle uitwisselingsregime bevindt, waarbij vanwege de r-6-afhankelijkheid van de PRE, de waargenomen relaxatiesnelheid gerelateerd is aan zowel de afstand waartoe het paramagnetische centrum de kern nadert als de hoeveelheid tijd die het in die conformatie doorbrengt. Daarom produceren voorbijgaande conformaties die geen nauwe benadering inhouden een kleine PRE, terwijl nauwere interacties, zelfs als ze van korte duur zijn, een grotere PRE zullen produceren.
Voor IDP's wordt de PRE gebruikt om de interacties te meten en te differentiëren die plaatsvinden binnen een enkel molecuul (intramoleculair) en tussen afzonderlijke moleculen (intermoleculair). Door een paramagnetisch centrum te hechten aan een NMR zichtbaar (bijv. 15N-gelabeld) of NMR onzichtbaar (bijv. natuurlijke abundantie 14N) eiwit, kan de bron (inter- of intramoleculair) van de PRE worden bepaald (figuur 2). Plaatsgerichte mutagenese die een cysteïneresidu introduceert, is een handige benadering om een paramagnetisch centrum (spin-label) aan een eiwit23 te hechten. Verschillende soorten moleculen zijn voorgesteld voor gebruik als spinlabels, waaronder metaalchelaatvorming (op basis van EDTA) en vrije radicalen (op basis van nitroxide)24. Verschillende nitroxide spin labels zijn beschreven en zijn verkrijgbaar met verschillende cysteïne-reactieve chemische stoffen zoals methanethiosulfonaat, maleimide en iodoacetamide25,26 (figuur 1). Inherente flexibiliteit van de tag of van de linker kan problematisch zijn voor bepaalde analyses, en in deze situaties zijn verschillende strategieën voorgesteld om de beweging van de tag te beperken, bijvoorbeeld door omvangrijke chemische groepen toe te voegen of het gebruik van een tweede linker om de tag aan het eiwit te verankeren (twee site-attachment)27, 28. Bovendien kunnen in de handel verkrijgbare tags diastereomere eiwitten bevatten, maar over het algemeen zal dit niet bijdragen aan de waargenomen PRE29. Het gebruik van de 3-Maleimido-PROXYL bevestigd aan een vrije cysteïne via maleimide chemie wordt beschreven omdat het direct beschikbaar, kosteneffectief, niet-omkeerbaar is en het reductiemiddel tris (2-carboxyethyl) fosfine (TCEP) gedurende de hele etiketteringsreactie in de oplossing kan worden gehandhaafd. Aangezien 3-Maleimido-PROXYL een isotrope g-tensor heeft, worden er geen PCS of RDC's geïnduceerd en kunnen dezelfde chemische verschuivingstoewijzingen worden gebruikt voor zowel de paramagnetische als de diamagnetische monsters13.
De 1HN-T 2 wordt gemeten met behulp van een twee-tijdpuntstrategie (T a, Tb) waarvan eerder is aangetoond dat deze net zo nauwkeurig is als het verzamelen van een volledige evolutiereeks bestaande uit 8 tot 12 tijdpunten30. Het eerste tijdspunt (T a) wordt zo dicht bij nul ingesteld als praktisch is, en de optimale lengte van het tweede tijdspunt is afhankelijk van de grootte van de grootste verwachte PRE voor een bepaald monster en kan worden geschat vanaf: Tb ~ 1,15 / (R 2, dia + Γ 2) waarbij R 2, dia de R 2 van het diamagnetische monster13 vertegenwoordigt. Als de grootte van de grootste PREs onbekend is, is het instellen van T b op ~ één keer de 1H T 2 van het eiwit een goede eerste schatting en verder geoptimaliseerd door T2 aan te passen om het signaal naar ruis te verbeteren. Deze tweepuntsmeetstrategie vermindert de experimentele tijd die nodig is om PRE's te meten aanzienlijk en biedt tijd voor meer signaalmiddeling, vooral omdat relatief verdunde monsters worden gebruikt om de effecten van niet-specifieke contacten tussen moleculen te minimaliseren. Een op HSQC gebaseerde pulssequentie wordt gebruikt om 1H N-T2 te meten en is elders in detail beschreven30. Voor een betere gevoeligheid kunnen de harde pulsen van de voorwaartse en achterste INEPT-overdrachten worden vervangen door gevormde pulsen; als alternatief kan de reeks gemakkelijk worden geconverteerd naar een op TROSY gebaseerde uitlezing31. Aangezien IDP's doorgaans veel langere transversale relaxatiesnelheden hebben, wat resulteert in smallere lijnbreedtes (vanwege de inherente aandoening) dan bolvormige eiwitten van vergelijkbare grootte, kunnen lange acquisitietijden in de indirecte dimensie worden gebruikt om de spectrale resolutie te verbeteren en de beperking van de chemische verschuivingsdispersie die inherent is aan IDP's te verlichten.
PRE is een nuttig hulpmiddel voor het bestuderen van eiwit-eiwit en eiwit-nucleïnezuur interacties, met name interacties die van voorbijgaande of laagbevolkte aard zijn. Een gedetailleerd protocol voor de bereiding van een NMR-monster dat geschikt is voor het meten van PREs, inclusief stappen voor eiwitzuivering, site-directed spin-etikettering, het opzetten en kalibreren van het pulsprogramma, het verwerken en interpreteren van de NMR-gegevens, wordt verstrekt. Er worden overal belangrijke experimentele overwegingen opgemerkt die van invloed kunnen zijn op de kwaliteit van de gegevens en de experimentele resultaten, waaronder de monsterconcentratie, de selectie van het spinlabel en de verwijdering van paramagnetische componenten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Intrinsiek ongeordende eiwitten en intrinsiek ongeordende gebieden binnen eiwitten vormen een groot en functioneel significant deel van het menselijk proteoom. De zeer flexibele aard van deze sequenties stelt hen in staat om zwakke, langdurige en voorbijgaande interacties te vormen met diverse biomoleculaire partners. Specifieke maar laag-affiniteitsinteracties bevorderen promiscue binding en stellen een enkel intrinsiek ongeordend segment in staat om te communiceren met een groot aantal doelsites. Vanwege de voorbijgaande aard van deze interacties, kunnen ze moeilijk te karakteriseren zijn door structurele biologische methoden die afhankelijk zijn van eiwitten om een enkele, overheersende conformatie te vormen. Paramagnetische relaxatieverbetering NMR is een nuttig hulpmiddel voor het identificeren en definiëren van de structurele onderbouwing van zwakke en voorbijgaande interacties. Een gedetailleerd protocol voor het gebruik van paramagnetische relaxatieverbetering om de dunbevolkte ontmoetingscomplexen te karakteriseren die zich vormen tussen intrinsiek ongeordende eiwitten en hun eiwit, nucleïnezuur of andere biomoleculaire partners wordt beschreven.

Intramoleculair 1HN-Γ 2 PRE's werden geregistreerd op een zelfassociatief, intrinsiek ongeordend fragment (residuen 171-264) afgeleid van het laagcomplexe domein van het RNA-bindende eiwit EWSR142 (figuur 3). Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel (bv. residu 178 of 260 in figuur 3) zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het ...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Een protocol voor de toepassing van paramagnetische relaxatieverbetering NMR-spectroscopie om zwakke en voorbijgaande inter- en intramoleculaire interacties in intrinsiek ongeordende eiwitten te detecteren, wordt gepresenteerd.

Paramagnetische relaxatieverbetering voor het detecteren en karakteriseren van zelfassociaties van intrinsiek ongeordende eiwitten

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

De paramagnetische relaxatieverbeteringstechniek kan worden gebruikt om intermoleculaire afstanden te karakteriseren en te meten en voorbijgaande en / of laagbevolkte biomoleculaire interacties te kwantificeren. Hier hebben we deze techniek toegepast om interacties vast te leggen die voorafgaan aan eiwitcondensatie. De gevoeligheid van PREs maakt identificatie van atomaire resolutie, detectie en kwantificering van dynamische toestanden mogelijk die onzichtbaar en ontoegankelijk blijven voor andere NMR-technieken.Belangrijke stappen in dit protocol zijn het verwijderen van het ongeconjugeerde nitroxide spinlabel en het zorgvuldig analyseren van de spectra om de piekhoogte nauwkeurig te meten. Bovendien moet voorzichtigheid worden betracht tijdens het instellen van het NMR-experiment en de pulskalibratie. Voeg om te beginnen 3-maleimido-PROXYL toe uit een stamoplossing met 20 keer molaire overmaat van het 15N isotopisch gelabelde eiwit van belang.Incubeer 's nachts bij kamertemperatuur of vier graden Celsius beschermd tegen licht en zuurstof en met zacht schommelen of nutatie. Verwijder de volgende dag het niet-gereageerde vrije spinlabel om niet-specifiek oplosmiddel PRE te voorkomen met behulp van uitgebreide dialyse van het eiwitmonster of met behulp van gelfiltratie. Gebruik vervolgens het reagens van Ellman om vrije sulfhydrylgroepen in de oplossing te kwantificeren.Meet de absorptie met behulp van een microplaatlezer en construeer de standaardcurve. Om intramoleculaire PRE te meten, bereidt u 15N isotopisch verrijkt spin-gelabeld eiwit tot een concentratie van ten minste 100 micromolair, maar niet meer dan 300 micromolair, in een buffer die geschikt is voor NMR. Breng vervolgens met behulp van een glazen pipet met lange steel of micropipet het NMR-monster over naar een NMR-buis van vijf millimeter die geschikt is voor gebruik in magneten met een hoog veld.Plaats het monster in de magneet. Vergrendel het deuteriumsignaal met behulp van het vergrendelingscommando en stem het protonkanaal af en match het volgens de facilitaire protocollen. Pas vervolgens de shims aan met behulp van de bovenste shim-subroutine om de onderdrukking van het oplosmiddelsignaal te optimaliseren.Kalibreer vervolgens de protonenpuls met behulp van het P-OPT-programma. Kalibreer vervolgens de 15N-puls tegen een standaardmonster. Bepaal de juiste demping voor gevormde pulsen met behulp van de subroutine van het vormgereedschap.Open vervolgens het juiste pulsvormbestand door op het mappictogram te klikken. De gevormde pulsen zijn te vinden in de sectie pulsparameters van acquisitieparameters. Nadat u het pulsdefinitiebestand hebt geladen, klikt u op Golfvorm analyseren, gevolgd door Shape integreren.Voer het gekalibreerde proton 90 graden harde puls, gewenste vorm pulslengte en rotatie in. Bereken vervolgens het vermogensniveau van de gevormde puls door de verandering van het vermogensniveau toe te voegen aan de demping voor de gekalibreerde puls van 90 graden. Neem een standaard proton 15N HSQC op om de veegbreedte, de draaggolffrequentie te optimaliseren en de wateronderdrukking te controleren.Pas ten slotte de veegbreedte en het aantal indirecte dimensieverhogingen aan met de opdrachten SW en TD of rechtstreeks in de juiste dialoogvensters. Kalibreer de gevormde pulsen zoals eerder gedemonstreerd. Voer vervolgens de gekalibreerde pulslengtes in het gedeelte pulsparameters in op het tabblad Acquisitieparameters.Om het amideproton T2 te meten met behulp van de tweetijdsvertragingspuntbenadering, stelt u de tijdvertragingen in door het VD-lijstbestand te bewerken. De eerste vertraging is ingesteld op 0,01 milliseconden. Gebruik de relatie met de verwachte maximale PRE en kies de tweede vertraging.Bepaal vervolgens een geschikte waarde door de eerste stappen van de eerste en tweede vertragingsspectra te vergelijken en de tweede vertraging zodanig aan te passen dat het signaal vervalt tot 40 tot 50% van de beginwaarde. Bepaal het aantal complexe punten dat moet worden vastgelegd en het aantal scans voor voldoende signaalgemiddelde. Gebruik vervolgens de opdracht EXPT om de experimenttijd te berekenen en start het experiment met de opdracht ZG. Na het oplossen van natriumascorbaat in de NMR-buffer, past u de pH aan die van de oorspronkelijke NMR-buffer aan.Voeg vervolgens het ascorbinezuur toe aan de NMR-buis met een 10 keer molaire overmaat boven de concentratie van het spinlabel door een druppel onder de rand van de buis te plaatsen. Sluit de buis af en keer voorzichtig om om te mengen. Draai op 200 tot 400 G gedurende 10 tot 20 seconden in een met de hand aangedreven centrifuge om het monster op de bodem van de buis te laten bezinken.Nadat u de buis in folie hebt gewikkeld, laat u de reactie minstens drie uur doorgaan. Neem vervolgens amideproton T2 op het diamagnetische monster op met dezelfde parameters die voor het paramagnetische monster worden gebruikt. Intramoleculaire amide proton gamma's PREs werden geregistreerd op een zelf-associërend intrinsiek ongeordend fragment afgeleid van het lage complexiteitsdomein van het RNA-bindende eiwit EWSR1.Residuen in de nabijheid van het bevestigingspunt van het spinlabel zullen naar verwachting aanzienlijk worden verbreed en zijn niet detecteerbaar in het spectrum. Residuen die sequentieel van het aanhechtingspunt waren geplaatst, maar toch een verbeterd gamma vertoonden, lagen ruimtelijk dicht bij het spinlabel. In het geval van intrinsiek ongeordende eiwitten zal het registreren en analyseren van purees informatie opleveren over intramoleculaire contacten en voorbijgaande interactieoppervlakken.Het combineren van PRE-metingen met andere biofysische methoden zoals dynamische lichtverstrooiing, grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en computationele methoden kan diepere inzichten bieden. PRE-meting helpt bij het karakteriseren van voorbijgaande dunbevolkte toestanden. Deze benadering kan worden uitgebreid om interacties te karakteriseren die belangrijk zijn voor talloze biologische processen zoals moleculaire herkenning, allosterische conformatieselectie en assemblageprocessen, waaronder het assembleren van membraanloze organellen via fasescheiding.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleaire magnetische resonantie spectroscopie voor de identificatie van verschillende fosforyleringen van intrinsiek ontvouwen eiwitten

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Gebruik van Electron paramagnetisch resonantie in biologische monsters bij kamertemperatuur en 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende zilveren kleuring van eiwitten in Polyacrylamide Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expressie, zuivering, kristallisatie, en enzym assays van Fumarylacetoacetate hydrolase domein-bevattende eiwitten

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriseren van individuele eiwit aggregaten door infrarood nano spectroscopie en Atoom kracht microscopie

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Volledig verwerkte recombinant KRAS4b: isoleren en karakteriseren van het Farnesylated en gemethyleerd eiwit

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Kenmerkend voor cellulaire eiwitten met in-cell snelle fotochemische oxidatie van eiwitten

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Dwarsdoorsnede van rijpe rijst(Oryza sativa L.) Kernels voor scanning elektronenmicroscopie beeldvorming met behulp van pipet tips als immobilisatie ondersteuning

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktische aspecten van monstervoorbereiding en -opstelling van 1H R1ρ ontspanningsdispersie-experimenten met RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...