Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Nous remercions les Dres Jinfa Ying et Kristin Cano pour leurs discussions utiles et leur assistance technique. DSL est un boursier St. Baldrick’s et reconnaît le soutien de la St. Baldrick’s Foundation (634706). Ce travail a été soutenu en partie par la Welch Foundation (AQ-2001-20190330) à DSL, le Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant à DSL), UTHSA Start-Up Funds to DSL et une bourse d’études supérieures Greehey en santé des enfants au CNJ. Ce travail est basé sur des recherches menées dans les installations de base de biologie structurale, qui font partie des noyaux de recherche institutionnelle du Centre des sciences de la santé de l’Université du Texas à San Antonio, avec le soutien du Bureau du vice-président pour la recherche et la ressource partagée de découverte de médicaments et de biologie structurale du Mays Cancer Center (NIH P30 CA054174).

Exigences générales pour le protocole: installations de purification des protéines, spectromètre UV-Vis, spectromètre RMN à haut champ et logiciel d’exploitation, logiciel d’analyse post-traitement, y compris; NMRPipe32, Sparky 33, (ou CCPN Analysis 34, ou NMRViewJ35).
1. Expression recombinante et purification d’une protéine pour les mesures PRE
<ol><li>Concevoir une construction d?...

Une méthode pour caractériser les interactions transitoires qui existent à de faibles populations entre des protéines intrinsèquement désordonnées et divers partenaires de liaison utilisant PRE a été présentée. Dans l’exemple montré, la protéine s’auto-associa, et donc le PRE peut provenir d’une combinaison d’interactions inter et intramoléculaires. Cette méthode est facilement étendue à des échantillons hétérogènes où les interactions entre deux protéines différentes peuvent être caract?...

Le trouble intrinsèque (DI) décrit des protéines (IDP) ou des régions à l’intérieur des protéines (IDR) qui ne se replient pas spontanément en structures secondaires ou tertiaires stables, mais qui sont biologiquement actives. Généralement, la fonction des IDP/IDR est de faciliter des interactions spécifiques mais réversibles avec des biomolécules dans des conditions physiologiques1. Ainsi, les IDP et les IDR sont impliqués dans une gamme de fonctions cellulaires, y compris le recrutement, l’organisation et la stabilisation de complexes multiprotéiques, par exemple, l’assemblage et l’activité du splicéosome2, le recrutement et l’organisation des composants sur les sites de dommages à l’ADN3, l’organisation et la stabilisation du recrutement des complexes de transcription4, ou du remodeleur de chromatine BAF5. En outre, les PDI se trouvent à des carrefours de signalisation où leur promiscuité pour différents partenaires de liaison leur permet de servir de médiateur dans le transfert d’informations via des réseaux de protéines cellulaires6. Des travaux récents ont également révélé une propension des régions IDR à s’associer en formant des condensats biomoléculaires par le processus de séparation en phase liquide-liquide7. Bon nombre des fonctions susmentionnées impliquant l’ID sont également considérées comme impliquant un aspect de la formation de condensats8. Malgré l’importance de l’ID pour l’assemblage de complexes biomoléculaires, la stabilisation, l’échafaudage et la transduction du signal, les détails atomiques de leurs interactions spécifiques sont difficiles à identifier car les IDP et les IDR ne se prêtent généralement pas à des études structurelles utilisant la cristallographie aux rayons X ou la microscopie électronique cryogénique.
La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une technique idéale pour étudier l’ID car elle ne dépend pas de la présence d’ensembles structurels rigides ou homogènes, mais rend compte de l’environnement local immédiat des noyaux individuels. La fréquence de résonance, ou décalage chimique, d’un noyau dans une molécule donnée est influencée par les faibles champs magnétiques induits par la distribution électronique locale, qui à son tour dépend de la longueur des liaisons, des angles, de la proximité d’autres noyaux, des interactions avec les partenaires de liaison et d’autres facteurs9. Ainsi, chaque noyau agit comme une sonde structurelle unique, spécifique au site, sensible aux changements de son environnement chimique local. Malgré ces avantages, la RMN est une technique de masse, et le décalage chimique observé est la moyenne de tous les environnements échantillonnés par un noyau particulier. Une gamme de techniques de RMN, dont beaucoup sont décrites dans ce numéro, ont été développées pour récupérer des informations structurelles, dynamiques et cinétiques sur les conformations biomoléculaires à haute énergie et faiblement peuplées contenues dans le décalage chimique moyen10,11. Bien que transitoirement peuplés, l’identification et la quantification de ces états sont importantes pour déterminer les détails des mécanismes fonctionnels12. Par exemple, dans le cas des PDI et des IDR, l’ensemble conformationnel peut être biaisé pour échantillonner préférentiellement les conformations productives pour la formation de complexes de rencontre avec des partenaires de liaison physiologiques. La détection de ces états, ainsi que l’identification des interactions et de la dynamique inter- et intramoléculaires spécifiques aux résidus, sont importantes pour déterminer les mécanismes structurels sous-jacents de la fonction protéique et de la formation complexe.
Un protocole d’utilisation de la RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique (PRE) pour étudier les états transitoires et peu peuplés importants pour la formation de complexes biomoléculaires médiés par IDP/IDR est décrit13. Cette approche est utile pour étudier les interactions transitoires protéine-protéine telles que celles qui favorisent l’assemblage des fibrilles amyloïdes à partir de la α-synucléine 14,15 ou l’auto-association de FUS16, ainsi que pour caractériser des interactions protéine-protéine spécifiques telles que entre protéines de signalisation17. Un exemple d’IDP auto-associatif est présenté, où des interactions inter- et intramoléculaires spécifiques entraînent des états préférentiellement compactés ainsi que des interactions spécifiques au site qui conduisent à l’auto-association.
Le PRE résulte de l’interaction dipolaire magnétique d’un noyau à un centre paramagnétique avec un tenseur g isotrope, généralement fourni sous la forme d’un électron non apparié sur un groupe nitroxide ou sous forme d’atome métallique paramagnétique18 (Figure 1). Alors que les atomes avec des tenseurs g anisotropes produisent également un effet PRE, l’analyse de ces systèmes est plus difficile en raison des effets de confusion apportés par les décalages de pseudo-contact (PCS) ou le couplage dipolaire résiduel (RDC)13,19. La force de l’interaction entre un noyau et le centre paramagnétique dépend de la distance <r-6> entre les deux. Cette interaction entraîne une augmentation des taux de relaxation nucléaire, ce qui provoque un élargissement détectable de la raie même pour les interactions à longue portée (~10-35 Å), car le moment magnétique de l’électron non apparié est si fort20,21. La détection d’états transitoires avec le PRE est possible si les deux conditions suivantes sont remplies; (1) l’interaction transitoire est en échange rapide sur l’échelle de temps RMN (le déplacement chimique observé est une moyenne pondérée en fonction de la population des états échangeurs); et (2) la distance entre les noyaux et le centre paramagnétique est plus courte à l’état de population transitoire qu’à l’état principal11. Le PRE transversal est noté Γ2 et, pour des raisons pratiques, est calculé à partir de la différence de vitesse de relaxation transversale 1H entre un échantillon contenant un centre paramagnétique et un contrôle diamagnétique. Pour un traitement approfondi de la théorie du PRE et des changements de pseudo-contact connexes dans les régimes d’échange rapide et lent, le lecteur est renvoyé aux examens complets de Clore et de ses collègues13,22. Ici, seule la situation où 1H N-Γ2 est dans le régime d’échange rapide est considérée, où, en raison de la dépendance r-6 du PRE, le taux de relaxation observé est lié à la fois à la distance à laquelle le centre paramagnétique s’approche du noyau ainsi qu’au temps qu’il passe dans cette conformation. Par conséquent, les conformations transitoires qui n’impliquent pas une approche rapprochée produisent un petit PRE tandis que des interactions plus étroites, même si elles sont de courte durée, produiront un PRE plus grand.
Pour les PDI, le PRE est utilisé pour mesurer et différencier les interactions qui se produisent au sein d’une seule molécule (intramoléculaire) et entre des molécules distinctes (intermoléculaires). En attachant un centre paramagnétique à une protéine RMN visible (p. ex., 15N-marquée) ou RMN invisible (p. ex., abondance naturelle 14N), la source (inter- ou intra-moléculaire) de l’ERP peut être déterminée (Figure 2). La mutagénèse dirigée qui introduit un résidu de cystéine est une approche pratique pour attacher un centre paramagnétique (spin-label) à une protéine23. Plusieurs types de molécules ont été proposés pour être utilisés comme marqueurs de spin, y compris la chélation des métaux (à base d’EDTA) et les radicaux libres (à base de nitroxide)24. Diverses étiquettes de spin de nitroxide ont été décrites et sont disponibles avec différentes chimies réactives à la cystéine telles que le méthanethiosulfonate, le maléimide et l’iodoacétamide25,26 (Figure 1). La flexibilité inhérente de l’étiquette ou de l’agent de liaison peut être problématique pour certaines analyses, et dans ces situations, différentes stratégies ont été proposées pour limiter le mouvement de l’étiquette, par exemple en ajoutant des groupes chimiques volumineux ou l’utilisation d’un deuxième agent de liaison pour ancrer l’étiquette à la protéine (fixation à deux sites)27, 28. De plus, les étiquettes disponibles dans le commerce peuvent contenir des protéines diastéréomères, mais cela ne contribuera généralement pas à l’ERP29 observée. L’utilisation du 3-Maleimido-PROXYL attaché à une cystéine libre via la chimie maléimide est décrite car il est facilement disponible, rentable, non réversible et l’agent réducteur tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) peut être maintenu dans la solution tout au long de la réaction de marquage. Étant donné que le 3-maléimido-PROXYL possède un tenseur g isotrope, aucun PCS ou RDC n’est induit, et les mêmes assignations de décalage chimique peuvent être utilisées pour les échantillons paramagnétiques et diamagnétiques13.
Le 1HN-T 2 est mesuré à l’aide d’une stratégie à deux points temporels (T a, Tb) qui s’est déjà révélée aussi précise que la collecte d’une série d’évolution complète composée de 8 à 12 points temporels30. Le premier point temporel (T a) est fixé aussi près de zéro que possible, et la longueur optimale du deuxième point de temps dépend de l’amplitude du plus grand PRE attendu pour un échantillon donné et peut être estimée à partir de: Tb ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) où R 2,dia représente le R2 de l’échantillon diamagnétique13. Si la magnitude des plus grands PRE est inconnue, définir T b à ~ une fois le 1H T 2 de la protéine est une bonne estimation initiale et optimisée en ajustant T2 pour améliorer le signal au bruit. Cette stratégie de mesure en deux points réduit considérablement le temps expérimental requis pour mesurer les PRE et laisse le temps de faire plus de moyenne des signaux, d’autant plus que des échantillons relativement dilués sont utilisés pour minimiser les effets des contacts non spécifiques entre les molécules. Une séquence d’impulsions basée sur HSQC est utilisée pour mesurer 1HN-T 2 et a été décrite en détail ailleurs30. Pour améliorer la sensibilité, les impulsions dures des transferts INEPT avant et arrière peuvent être remplacées par des impulsions façonnées; alternativement, la séquence est facilement convertie en une lecture basée sur TROSY31. Étant donné que les PDI ont généralement des taux de relaxation transversale beaucoup plus longs, ce qui entraîne des largeurs de raies plus étroites (en raison du désordre inhérent) que les protéines globulaires de taille similaire, de longs temps d’acquisition dans la dimension indirecte peuvent être utilisés pour améliorer la résolution spectrale et atténuer la limitation de la dispersion par décalage chimique inhérente aux PDI.
Le PRE est un outil utile pour étudier les interactions protéine-protéine et protéine-acide nucléique, en particulier les interactions transitoires ou peu peuplées. Un protocole détaillé pour la préparation d’un échantillon RMN adapté à la mesure des PRE, y compris les étapes de purification des protéines, le marquage par centrifugation dirigé sur site, la mise en place et l’étalonnage du programme d’impulsions, le traitement et l’interprétation des données RMN, est fourni. D’importantes considérations expérimentales sont notées tout au long de la période qui peuvent avoir une incidence sur la qualité des données et les résultats expérimentaux, y compris la concentration de l’échantillon, la sélection de l’étiquette de spin et l’élimination des composants paramagnétiques.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Les protéines intrinsèquement désordonnées et les régions intrinsèquement désordonnées dans les protéines constituent une partie importante et fonctionnellement significative du protéome humain. La nature très flexible de ces séquences leur permet de former des interactions faibles, à longue portée et transitoires avec divers partenaires biomoléculaires. Des interactions spécifiques mais de faible affinité favorisent la liaison de promiscuité et permettent à un seul segment intrinsèquement désordonné d’interagir avec une multitude de sites cibles. En raison de la nature transitoire de ces interactions, elles peuvent être difficiles à caractériser par des méthodes de biologie structurale qui reposent sur des protéines pour former une seule conformation prédominante. La RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique est un outil utile pour identifier et définir le fondement structurel des interactions faibles et transitoires. Un protocole détaillé pour l’utilisation de l’amélioration de la relaxation paramagnétique pour caractériser les complexes de rencontre faiblement peuplés qui se forment entre les protéines intrinsèquement désordonnées et leurs protéines, acides nucléiques ou autres partenaires biomoléculaires est décrit.

Des PRE intramoléculaires 1H N-Γ 2 ont été enregistrées sur un fragment auto-associatif, intrinsèquement désordonné (résidus 171-264) dérivé du domaine de faible complexité de la protéine de liaison à l’ARN EWSR142 (Figure 3). Les résidus à proximité séquentielle étroite du point de fixation de l’étiquette de spin (p. ex. résidus 178 ou 260 à la figure 3) devraient être ...

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Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Un protocole pour l’application de la spectroscopie RMN d’amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter les interactions inter- et intramoléculaires faibles et transitoires dans les protéines intrinsèquement désordonnées est présenté.

Amélioration de la relaxation paramagnétique pour détecter et caractériser des auto-associations de protéines intrinsèquement désordonnées

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

La technique d’amélioration de la relaxation paramagnétique peut être utilisée pour caractériser et mesurer les distances intermoléculaires et quantifier les interactions biomoléculaires transitoires et / ou faiblement peuplées. Ici, nous avons appliqué cette technique pour capturer les interactions qui précèdent la condensation des protéines. La sensibilité des PRE permet l’identification, la détection et la quantification de la résolution atomique de l’état dynamique qui restent invisibles et inaccessibles aux autres techniques de RMN.Les étapes clés de ce protocole comprennent le retrait de l’étiquette de spin du nitroxide non conjugué et l’analyse minutieuse des spectres pour mesurer avec précision la hauteur du pic. De plus, il faut faire preuve de prudence lors de la configuration de l’expérience RMN et de l’étalonnage des impulsions. Pour commencer, ajoutez le 3-maleimido-PROXYL à partir d’une solution mère à 20 fois l’excès molaire de la protéine 15N marquée isotopiquement d’intérêt.Incuber pendant la nuit à température ambiante ou à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière et de l’oxygène et avec un léger balancement ou nutation. Le lendemain, retirez l’étiquette de rotation libre sans réaction pour empêcher l’ERP de solvant non spécifique en utilisant soit une dialyse extensive de l’échantillon de protéines, soit en utilisant la filtration sur gel. Utilisez ensuite le réactif d’Ellman pour quantifier les groupes sulfhydryles libres dans la solution.Mesurez l’absorbance à l’aide d’un lecteur de microplaques et construisez la courbe standard. Pour mesurer le PRE intramoléculaire, préparer une protéine de spin marquée au 15N enrichie isotopiquement à une concentration d’au moins 100 micromolaires, mais pas plus de 300 micromolaires, dans un tampon adapté à la RMN. Ensuite, à l’aide d’une pipette en verre à longue tige ou d’une micropipette, transférer l’échantillon RMN dans un tube RMN de cinq millimètres approprié pour une utilisation dans des aimants à champ élevé.Placez l’échantillon dans l’aimant. Verrouillez le signal de deutérium à l’aide de la commande de verrouillage et réglez et faites correspondre le canal protonique selon les protocoles de l’installation. Ajustez ensuite les cales à l’aide du sous-programme de cale supérieure pour optimiser la suppression du signal de solvant.Ensuite, calibrez l’impulsion de protons à l’aide du programme P-OPT. Ensuite, étalonnez l’impulsion 15N par rapport à un échantillon standard. Déterminez l’atténuation correcte pour les impulsions façonnées à l’aide de la sous-routine de l’outil de forme.Ouvrez ensuite le fichier de forme d’impulsion approprié en cliquant sur l’icône de dossier. Les impulsions façonnées se trouvent dans la section des paramètres d’impulsion des paramètres d’acquisition. Après avoir chargé le fichier de définition d’impulsion, cliquez sur Analyser la forme d’onde, puis sur Intégrer la forme.Entrez l’impulsion dure de 90 degrés du proton étalonné, la longueur d’impulsion de forme souhaitée et la rotation. Calculez ensuite le niveau de puissance de l’impulsion façonnée en ajoutant le changement de niveau de puissance à l’atténuation pour l’impulsion calibrée de 90 degrés. Enregistrez un HSQC proton 15N standard pour optimiser la largeur de balayage, la fréquence porteuse et vérifier la suppression de l’eau.Enfin, réglez la largeur du balayage et le nombre d’incréments de cotes indirectes à l’aide des commandes SW et TD ou directement dans les boîtes de dialogue appropriées. Calibrer les impulsions façonnées comme démontré précédemment. Entrez ensuite les longueurs d’impulsion calibrées dans la section Paramètres d’impulsion de l’onglet Paramètres d’acquisition.Pour mesurer le proton amide T2 en utilisant l’approche à deux points de retard, définissez les délais en modifiant le fichier de liste VD. Le premier délai est défini sur 0,01 milliseconde. En utilisant la relation avec le PRE maximal attendu, choisissez le deuxième délai.Ensuite, déterminez une valeur appropriée en comparant les premiers incréments des premier et deuxième spectres de retard et en ajustant le deuxième retard de telle sorte que le signal diminue entre 40 et 50% de sa valeur initiale. Déterminez le nombre de points complexes à enregistrer et le nombre de balayages pour une moyenne de signal suffisante. Utilisez ensuite la commande EXPT pour calculer la durée de l’expérience et démarrez l’expérience avec la commande ZG. Après avoir dissous l’ascorbate de sodium dans le tampon RMN, ajuster le pH pour qu’il corresponde à celui du tampon RMN d’origine.Ajoutez ensuite l’acide ascorbique dans le tube RMN à un excès molaire 10 fois supérieur à la concentration de l’étiquette de spin en plaçant une gouttelette sous le bord du tube. Boucher le tube et retourner soigneusement pour mélanger. Faire tourner à 200 à 400 g pendant 10 à 20 secondes dans une centrifugeuse à manivelle pour déposer l’échantillon au fond du tube.Après avoir enveloppé le tube dans du papier d’aluminium, laissez la réaction se dérouler pendant au moins trois heures. Enregistrez ensuite le proton amide T2 sur l’échantillon diamagnétique en utilisant les mêmes paramètres que ceux utilisés pour l’échantillon paramagnétique. Les PREs gammas intramoléculaires amide protonique ont été enregistrés sur un fragment intrinsèquement désordonné auto-associatif dérivé du domaine de faible complexité de la protéine de liaison à l’ARN EWSR1.Les résidus à proximité séquentielle étroite du point de fixation de l’étiquette de spin devraient être considérablement élargis et ne sont pas détectables dans le spectre. Les résidus qui étaient espacés séquentiellement à partir du point d’attache mais qui présentaient un gamma amélioré étaient spatialement proches de l’étiquette de spin. Dans le cas des protéines intrinsèquement désordonnées, l’enregistrement et l’analyse des purées fourniront des informations sur les contacts intramoléculaires et les surfaces d’interaction transitoires.La combinaison des mesures PRE avec d’autres méthodes biophysiques telles que la diffusion dynamique de la lumière, la chromatographie d’exclusion de taille, l’ultracentrifugation analytique et les méthodes informatiques peut fournir des informations plus approfondies. La mesure PRE aide à caractériser l’état transitoire peu peuplé. Cette approche pourrait être élargie pour caractériser les interactions importantes pour une myriade de processus biologiques tels que la reconnaissance moléculaire, la sélection conformationnelle allostérique et les processus d’assemblage, y compris l’assemblage d’organites sans membrane par séparation de phase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Spectroscopie par résonance magnétique nucléaire pour l&#39;identification des phosphorylations multiples de protéines intrinsèquement désordonnées

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Recherche

Biochimie

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Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expression, Purification, Cristallisation et Essais enzymatiques des protéines contenant du domaine de l'hydrolase fumarylacetoacetate

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b recombinant entièrement transformé : Isoler et caractériser les protéines farnestées et méthylées

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caractériser les protéines cellulaires avec l’oxydation photochimique rapide à cellule des protéines

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sectionnement transversal du riz mature (Oryza sativa L.) Noyaux pour l’imagerie par microscopie électronique à balayage à l’aide d’embouts de pipette comme support d’immobilisation

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Aspects pratiques de la préparation des échantillons et de la configuration des expériences de dispersion de relaxation 1H R1ρ de l’ARN

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...