Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

אנו מודים לד"ר ג'ינפה יינג וד"ר קריסטין קאנו על דיונים מועילים וסיוע טכני. DSL הוא מלגאי סנט בלדריק ומכיר בתמיכת קרן סנט בלדריק (634706). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי קרן וולש (AQ-2001-20190330) ל-DSL, קרן מקס ומיני טומרלין וולקר (מענק חוקר צעיר של קרן וולקר ל-DSL), קרנות סטארט-אפ של UTHSA ל-DSL, ומלגת בוגר גריהי בבריאות ילדים ל-CNJ. עבודה זו מבוססת על מחקר שנערך במתקני הליבה של ביולוגיה מבנית, חלק מליבות המחקר המוסדיות במרכז למדעי הבריאות של אוניברסיטת טקסס בסן אנטוניו בתמיכת משרד סגן הנשיא למחקר ומרכז הסרטן מייס גילוי תרופות וביולוגיה מבנית משאב משותף (NIH P30 CA054174).

דרישות כלליות לפרוטוקול: מתקני טיהור חלבונים, ספקטרומטר UV-Vis, ספקטרומטר NMR שדה גבוה ותוכנת הפעלה, תוכנת ניתוח לאחר עיבוד כולל; NMRPipe32, Sparky33, (או CCPN Analysis34, או NMRViewJ35).
1. ביטוי רקומביננטי וטיהור חלבון למדידות PRE
<ol><li>עצבו מבנה ביט?...

הוצגה שיטה לאפיון אינטראקציות חולפות הקיימות באוכלוסיות נמוכות בין חלבונים בעלי הפרעה מהותית לבין שותפים קושרים שונים באמצעות PRE. בדוגמה המוצגת, החלבון הוא שיוך עצמי, ולכן PRE עשוי לנבוע משילוב של אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות. שיטה זו מורחבת בקלות לדגימות הטרוגניות שבהן נית?...

הפרעה פנימית (ID) מתארת חלבונים (IDPs) או אזורים בתוך חלבונים (IDR) שאינם מתקפלים באופן ספונטני למבנים יציבים, משניים או שלישוניים, אך פעילים ביולוגית. באופן כללי, תפקידם של IDP / IDR הוא להקל על אינטראקציות ספציפיות אך הפיכות עם ביומולקולות בתנאים פיזיולוגיים1. לפיכך, עקורים ו-IDR מעורבים במגוון תפקודים תאיים, כולל גיוס, ארגון וייצוב של קומפלקסים מרובי חלבונים, למשל, הרכבה ופעילות של הספליסוזום2, גיוס וארגון רכיבים באתרים של נזק לדנ"א3, ארגון וייצוב הגיוס של מתחמי שעתוק4, או של מעצב הכרומטין BAF5. בנוסף, עקורים נמצאים בקשרי איתות, כאשר הפקרותם לשותפים כובלים שונים מאפשרת להם לתווך העברת מידע דרך רשתות חלבונים תאיות6. עבודה שנעשתה לאחרונה חשפה גם נטייה של אזורי IDR לקשר את עצמם ליצירת עיבויים ביומולקולריים באמצעות תהליך של הפרדת פאזה נוזלית-נוזלית7. רבות מהפונקציות הנ"ל המערבות ID נחשבות כיום גם ככוללות היבט כלשהו של היווצרות עיבוי8. למרות חשיבותו של ID להרכבה ביומולקולרית מורכבת, ייצוב, פיגומים והעברת אותות, קשה לזהות את הפרטים האטומיים של האינטראקציות הספציפיות שלהם מכיוון שבדרך כלל עקורים ו- IDR אינם ניתנים לחקירה מבנית באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגני.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא טכניקה אידיאלית לחקר זיהוי מכיוון שהיא אינה תלויה בנוכחותם של הרכבים מבניים קשיחים או הומוגניים אלא מדווחת על הסביבה המקומית המיידית של גרעינים בודדים. תדירות התהודה, או השינוי הכימי, של גרעין במולקולה נתונה מושפעת משדות מגנטיים חלשים הנגרמים על ידי הפיזור האלקטרוני המקומי, שבתורו תלוי באורכי קשר, זוויות, קרבה של גרעינים אחרים, אינטראקציות עם שותפים קושרים וגורמים אחרים9. לפיכך, כל גרעין פועל כבדיקה מבנית ייחודית, ספציפית לאתר, הרגישה לשינויים בסביבתו הכימית המקומית. למרות יתרונות אלה, NMR היא טכניקה בתפזורת, והשינוי הכימי שנצפה הוא הממוצע של כל הסביבות שנדגמו על ידי גרעין מסוים. מגוון טכניקות NMR, שרבות מהן מתוארות בגיליון זה, פותחו כדי לשחזר מידע מבני, דינמי וקינטי על קונפורמציות ביומולקולריות בעלות אנרגיה גבוהה המאוכלסות נמוך הכלולות בשינוי הכימי הממוצע10,11. למרות שהם מאוכלסים באופן ארעי, זיהוי וכימות של מצבים אלה חשובים לקביעת הפרטים של מנגנונים פונקציונליים12. לדוגמה, במקרה של עקורים ו-IDRs, ההרכב הקונפורמטיבי עשוי להיות מוטה למדגם מועדף של קונפורמציות המועילות ליצירת מתחמי מפגש עם שותפים מחייבים פיזיולוגיים. זיהוי מצבים אלה, כמו גם זיהוי של אינטראקציות ודינמיקות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות ספציפיות לשאריות, חשובים כדי לקבוע את המנגנונים המבניים הבסיסיים של תפקוד חלבונים והיווצרות מורכבת.
פרוטוקול לשימוש ב-NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית (PRE) כדי לחקור מצבים ארעיים המאוכלסים באוכלוסייה נמוכה החשובים להיווצרות קומפלקסים ביומולקולריים בתיווך IDP / IDR מתואר13. גישה זו שימושית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון חולפות, כגון אלה המקדמות הרכבה של סיבי עמילואיד מ-α-סינוקלאין 14,15 או הקשר העצמי של FUS16, כמו גם לאפיון אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות כגון בין חלבוני איתות17. מוצגת דוגמה לשיוך עצמי של IDP, שבו אינטראקציות בין-מולקולריות ספציפיות ותוך-מולקולריות גורמות למצבים דחוסים מועדפים, כמו גם אינטראקציות ספציפיות לאתר המניעות אסוציאציה עצמית.
ה-PRE נובע מהאינטראקציה הדיפולרית המגנטית של גרעין למרכז פאראמגנטי עם טנזור G איזוטרופי, המסופק בדרך כלל בצורה של אלקטרון לא מזווג על קבוצת חנקן אוקסיד או כאטום מתכת פאראמגנטי18 (איור 1). בעוד אטומים עם טנזור G אנאיזוטרופי מייצרים גם אפקט PRE, ניתוח של מערכות אלה קשה יותר בשל השפעות מבלבלות שנתרמו על ידי משמרות מגע מדומה (PCS) או צימוד דיפולרי שיורי (RDC)13,19. עוצמת האינטראקציה בין גרעין למרכז פאראמגנטי תלויה במרחק <r-6> בין השניים. אינטראקציה זו גורמת לעלייה בקצב ההרפיה הגרעינית, מה שגורם להרחבת קווים הניתנים לגילוי אפילו עבור אינטראקציות ארוכות טווח (~ 10-35 Å), מכיוון שהמומנט המגנטי של האלקטרון הבלתי מזווג הוא כה חזק20,21. זיהוי מצבים ארעיים עם PRE אפשרי אם מתקיימים שני התנאים הבאים; (1) האינטראקציה הארעית היא בחליפין מהיר על ציר הזמן של NMR (השינוי הכימי שנצפה הוא ממוצע משוקלל אוכלוסייה של המדינות המחליפות); ו-(2) מרחק הגרעינים למרכז הפאראמגנטי קצר יותר במצב המאוכלס באופן ארעי מאשר במצב העיקרי11. ה- PRE הרוחבי מסומן Γ2 ולמטרות מעשיות מחושב מההפרש בקצבי הרפיה רוחביים של 1H בין דגימה המכילה מרכז פאראמגנטי לבין בקרה דיאמגנטית. לטיפול מעמיק בתיאוריה של PRE ושינויים פסאודו-קונטאזטיים הקשורים אליה במשטרי חליפין מהירים ואיטיים מופנה הקורא לסקירות המקיפות של קלור ועמיתיו13,22. כאן, רק המצב שבו 1H N-Γ2 נמצא במשטר החליפין המהיר נחשב, שבו בגלל התלות r-6 של PRE, קצב ההרפיה שנצפה קשור הן למרחק שאליו המרכז הפאראמגנטי מתקרב לגרעין והן לכמות הזמן שהוא מבלה באותה קונפורמציה. לכן, קונפורמציות ארעיות שאינן כרוכות בגישה קרובה מייצרות PRE קטן בעוד שאינטראקציות קרובות יותר, גם אם קצרות מועד, ייצרו PRE גדול יותר.
עבור עקורים, ה- PRE משמש למדידה ולהבחנה של האינטראקציות המתרחשות בתוך מולקולה אחת (תוך מולקולרית) ובין מולקולות נפרדות (בין מולקולרית). על-ידי הצמדת מרכז פאראמגנטי לחלבון NMR גלוי (למשל, 15N-מסומן) או NMR בלתי נראה (למשל, שפע טבעי 14N), ניתן לקבוע את המקור (הבין-מולקולרי או התוך-מולקולרי) של ה-PRE (איור 2). מוטגנזה מכוונת אתר המציגה שאריות ציסטאין היא גישה נוחה להצמדת מרכז פאראמגנטי (תווית ספין) לחלבון23. מספר סוגים של מולקולות הוצעו לשימוש כתוויות ספין, כולל כלאט מתכת (מבוסס EDTA) ורדיקל חופשי (מבוסס חנקן)24. תוויות שונות של ספין חנקן תוארו והן זמינות עם כימיות תגובתיות שונות לציסטאין כגון מתאתיוסולפונט, מלימיד ויודואצטמיד25,26 (איור 1). גמישות מובנית של התג או של המקשר עלולה להיות בעייתית עבור ניתוחים מסוימים, ובמצבים אלה הוצעו אסטרטגיות שונות להגבלת תנועת התג, כגון על ידי הוספת קבוצות כימיות מגושמות או שימוש במקשר שני כדי לעגן את התג לחלבון (חיבור לשני אתרים)27, 28. בנוסף, תגים זמינים מסחרית עשויים להכיל חלבונים דיאסטריאומריים אך בדרך כלל זה לא יתרום ל- PRE29 שנצפה. השימוש ב-3-Maleimido-PROXYL המחובר לציסטאין חופשי באמצעות כימיה של maleimide מתואר מכיוון שהוא זמין, חסכוני, בלתי הפיך, וניתן לשמור על החומר המחזר tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) בתמיסה לאורך כל תגובת התוויה. מכיוון של-3-Maleimido-PROXYL יש טנזור G איזוטרופי, לא מושרים PCS או RDC, וניתן להשתמש באותן הקצאות שינוי כימיות הן עבור הדגימות הפאראמגנטיות והן עבור הדגימות הדיאמגנטיות13.
1H N-T2 נמדד באמצעות אסטרטגיית שתי נקודות זמן (T a, Tb) שהוכחה בעבר כמדויקת כמו איסוף סדרת אבולוציה מלאה המורכבת מ-8 עד 12 נקודות זמן30. נקודת הזמן הראשונה (T a) מוגדרת קרוב לאפס כמעשית, והאורך האופטימלי של נקודת הזמן השנייה תלוי בגודל ה-PRE הגדול ביותר הצפוי עבור מדגם נתון וניתן להעריך אותו מ: Tb ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) כאשר R 2,dia מייצג את R 2 של המדגם הדיאמגנטי13. אם סדר הגודל של ה- PREs הגדולים ביותר אינו ידוע, הגדרת T b ל~ פי 1H T 2 של החלבון היא הערכה ראשונית טובה וממוטבת עוד יותר על ידי התאמת T2 כדי לשפר את האות לרעש. אסטרטגיית מדידה דו-נקודתית זו מפחיתה באופן משמעותי את זמן הניסוי הדרוש למדידת PREs ומאפשרת זמן לממוצע אותות רב יותר, במיוחד מכיוון שדגימות מדוללות יחסית משמשות למזעור ההשפעות של מגעים לא ספציפיים בין מולקולות. רצף פולסים מבוסס HSQC משמש למדידת 1HN-T 2 ותואר בפירוט במקום אחר30. לשיפור הרגישות, ניתן להחליף את הפולסים הקשיחים של העברות INEPT קדימה ואחורה בפולסים מעוצבים; לחלופין, הרצף מומר בקלות לקריאה31 מבוססת TROSY. מכיוון שלעקורים יש בדרך כלל שיעורי הרפיה רוחביים ארוכים בהרבה וכתוצאה מכך רוחב קו צר יותר (בשל ההפרעה המובנית) מאשר חלבונים כדוריים בגודל דומה, ניתן להשתמש בזמני רכישה ארוכים בממד העקיף כדי לשפר את הרזולוציה הספקטרלית ולהקל על מגבלת פיזור השינוי הכימי הטבועה בעקורים.
PRE הוא כלי שימושי לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון וחלבון-חומצות גרעין, במיוחד אינטראקציות חולפות או מאוכלסות נמוך. מצורף פרוטוקול מפורט להכנת דגימת NMR המתאימה למדידת PREs, כולל שלבים לטיהור חלבונים, תיוג ספין מכוון אתר, הגדרה וכיול של תוכנית הדופק, עיבוד ופענוח נתוני NMR. לאורך כל הדרך מצוינים שיקולים ניסיוניים חשובים שעשויים להשפיע על איכות הנתונים ותוצאות הניסוי, כולל ריכוז הדגימה, בחירת תווית הספין והסרת רכיבים פאראמגנטיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

חלבונים בעלי אי-סדר פנימי ואזורים בעלי אי-סדר פנימי בתוך חלבונים מהווים חלק גדול ומשמעותי מבחינה תפקודית של הפרוטאום האנושי. האופי הגמיש מאוד של רצפים אלה מאפשר להם ליצור אינטראקציות חלשות, ארוכות טווח וחולפות עם שותפים ביומולקולריים מגוונים. אינטראקציות ספציפיות אך בעלות זיקה נמוכה מקדמות קשירה מופקרת ומאפשרות לפלח יחיד בעל הפרעה מהותית לקיים אינטראקציה עם מספר רב של אתרי יעד. בגלל האופי הארעי של אינטראקציות אלה, קשה לאפיין אותן באמצעות שיטות ביולוגיות מבניות המסתמכות על חלבונים כדי ליצור קונפורמציה אחת דומיננטית. NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית הוא כלי שימושי לזיהוי והגדרה של הבסיס המבני של אינטראקציות חלשות וחולפות. מתואר פרוטוקול מפורט לשימוש בשיפור הרפיה פאראמגנטי כדי לאפיין את קומפלקסי המפגש המאוכלסים בצפיפות נמוכה הנוצרים בין חלבונים בעלי הפרעה פנימית לבין החלבון, חומצת הגרעין או שותפים ביומולקולריים אחרים שלהם.

Intramolecular 1H N-Γ2 PREs תועדו על מקטע בעל שיוך עצמי והפרעה מהותית (שאריות 171-264) שמקורו בתחום הסיבוכיות הנמוכה של החלבון קושר הרנ"א EWSR142 (איור 3). שאריות בסמיכות רציפה לנקודת החיבור של תווית הספין (לדוגמה, שאריות 178 או 260 באיור 3) צפויו...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

מוצג פרוטוקול ליישום ספקטרוסקופיית NMR לשיפור הרפיה פאראמגנטית לזיהוי אינטראקציות בין-מולקולריות ותוך-מולקולריות חלשות וחולפות בחלבונים בעלי אי-סדר מהותי.

שיפור הרפיה פאראמגנטית לאיתור ואפיון אסוציאציות עצמיות של חלבונים לא מסודרים במהותם

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

ניתן להשתמש בטכניקת שיפור ההרפיה הפאראמגנטית כדי לאפיין ולמדוד מרחקים בין-מולקולריים ולכמת אינטראקציות ביומולקולריות חולפות ו/או מאוכלסות נמוך. כאן, יישמנו טכניקה זו כדי ללכוד אינטראקציות שקדמו לעיבוי חלבונים. הרגישות של PREs מאפשרת זיהוי, גילוי וכימות של רזולוציה אטומית של מצבים דינמיים שנותרים בלתי נראים ובלתי נגישים לטכניקות NMR אחרות.השלבים העיקריים בפרוטוקול זה כוללים הסרת תווית ספין החנקן הבלתי מצומד וניתוח זהיר של הספקטרום כדי למדוד במדויק את גובה השיא. בנוסף, יש לנקוט משנה זהירות במהלך הגדרת ניסוי NMR וכיול הדופק. כדי להתחיל, הוסף 3-maleimido-PROXYL מתמיסת מלאי בעודף מולארי פי 20 של 15N חלבון איזוטופי של עניין.יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורת החדר או בארבע מעלות צלזיוס המוגנות מפני אור וחמצן ובעזרת נדנוד או אגוז עדינים. למחרת, הסר את תווית הספין החופשי ללא תגובה כדי למנוע PRE ממס לא ספציפי באמצעות דיאליזה נרחבת של דגימת החלבון או באמצעות סינון ג'ל. לאחר מכן השתמש בריאגנט של אלמן כדי לכמת קבוצות סולפידריל חופשיות בתמיסה.מדוד את הספיגה באמצעות קורא microplate ולבנות את העקומה הסטנדרטית. כדי למדוד PRE, הכינו ספין 15N מועשר איזוטופית בחלבון המסומן בספין לריכוז של לפחות 100 מיקרומולארי, אך לא יותר מ-300 מיקרומולארי, בחיץ המתאים ל-NMR. לאחר מכן באמצעות פיפטה מזכוכית גזע ארוכה או מיקרופיפטה, מעבירים את דגימת ה- NMR לצינור NMR של חמישה מילימטר המתאים לשימוש במגנטים בעלי שדה גבוה.הניחו את הדגימה במגנט. נעילה על אות הדאוטריום באמצעות פקודת הנעילה וכוונון והתאמה של תעלת הפרוטון בהתאם לפרוטוקולי המתקן. לאחר מכן התאם את ה- shims באמצעות שגרת ה- shim העליונה כדי לייעל את דיכוי אות הממס.לאחר מכן, כיילו את פולס הפרוטון באמצעות תוכנית P-OPT. לאחר מכן כיילו את פולס 15N כנגד דגימה סטנדרטית. קבע את ההנחתה הנכונה עבור פולסים מעוצבים באמצעות שגרת הכלי צורה.לאחר מכן פתח את קובץ צורת הדופק המתאים על ידי לחיצה על סמל התיקיה. הפולסים המעוצבים נמצאים בסעיף פרמטרי הדופק של פרמטרי רכישה. לאחר טעינת קובץ הגדרת הדופק, לחצו על 'נתח צורת גל' ולאחר מכן לחצו על 'שלב צורה'.הזן את הפרוטון המכויל בפולס קשה של 90 מעלות, את הצורה הרצויה, את אורך הדופק ואת הסיבוב. לאחר מכן חשב את רמת ההספק של הדופק המעוצב על ידי הוספת שינוי רמת הכוח להנחתה עבור הדופק המכויל של 90 מעלות. הקלט פרוטון 15N HSQC סטנדרטי כדי למטב את רוחב הטאטוא, תדירות הנשא ולבדוק את דיכוי המים.לבסוף, התאם את רוחב הניקוי ואת מספר הפרשי הממדים העקיפים באמצעות הפקודות SW ו- TD או ישירות בתיבות הדו-שיח המתאימות. כייל את הפולסים המעוצבים כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן הזן את אורכי הדופק המכוילים במקטע פרמטרי הדופק בכרטיסייה פרמטרים של רכישה.כדי למדוד את פרוטון האמיד T2 באמצעות גישת שתי נקודות השהיית הזמן, הגדר את השהיות הזמן על-ידי עריכת קובץ הרשימה VD. ההשהיה הראשונה מוגדרת ל- 0.01 אלפיות השנייה. באמצעות הקשר ל- PRE, המרבי הצפוי, בחר את ההשהיה השנייה.לאחר מכן קבע ערך מתאים על-ידי השוואת ההפרשים הראשונים של ספקטרום ההשהיה הראשון והשני והתאמת ההשהיה השנייה כך שהאות דועך ל-40% עד 50% מערכו ההתחלתי. קבע את מספר הנקודות המורכבות להקלטה ואת מספר הסריקות לממוצע אות מספיק. לאחר מכן השתמש בפקודה EXPT כדי לחשב את זמן הניסוי והתחל את הניסוי עם הפקודה ZG. לאחר המסת נתרן אסקורבט במאגר NMR, התאם את ה- pH כך שיתאים לזה של מאגר ה- NMR המקורי.לאחר מכן הוסף את החומצה האסקורבית לצינור NMR בעודף מולארי פי 10 מעל ריכוז תווית הספין על ידי הנחת טיפה מתחת לשפת הצינור. מכסים את הצינור והופכים בזהירות כדי לערבב. סובבו במהירות של 200 עד 400 גרם במשך 10 עד 20 שניות בצנטריפוגה ידנית כדי ליישב את הדגימה בתחתית הצינור.לאחר עטיפת הצינור בנייר כסף, לאפשר את התגובה להמשיך לפחות שלוש שעות. לאחר מכן רשום פרוטון אמיד T2 על הדגימה הדיאמגנטית באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לדגימה הפאראמגנטית. גמא פרוטון תוך מולקולרי אמיד PREs תועדו על מקטע בעל שיוך עצמי בעל הפרעה פנימית הנגזר מתחום הסיבוכיות הנמוכה של חלבון קושר RNA EWSR1.שאריות בסמיכות רציפה לנקודת החיבור של תווית הספין צפויות להתרחב משמעותית ואינן ניתנות לגילוי בספקטרום. שאריות שהיו במרווחים רציפים מנקודת החיבור אך הראו גמא משופר היו קרובות מרחבית לתווית הספין. במקרה של חלבונים בעלי הפרעה מהותית, הקלטה וניתוח של מחית יניבו מידע על מגעים תוך-מולקולריים ומשטחי אינטראקציה חולפים.שילוב מדידות PRE עם שיטות ביופיזיקליות אחרות כגון פיזור אור דינמי, כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל, אולטרה-צנטריפוגה אנליטית ושיטות חישוביות יכול לספק תובנות עמוקות יותר. מדידת PRE מסייעת באפיון מצב ארעי המאוכלס בדלילות. ניתן להרחיב גישה זו כדי לאפיין אינטראקציות חשובות למספר עצום של תהליכים ביולוגיים כגון זיהוי מולקולרי, ברירה קונפורמטיבית אלוסטרית ותהליכי הרכבה, כולל הרכבת אברונים חסרי קרום באמצעות הפרדת פאזות.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

ספקטרוסקופיה הגרעיני תהודה מגנטית עבור זיהוי של Phosphorylations המרובה של חלבונים לא תקינים מהותיים

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

השימוש אלקטרון תהודה פאראמגנטיים בדגימות ביולוגיות-טמפרטורת הסביבה ו- 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

צביעת כסף פלורסנט של חלבונים בג'לים לזיהוי

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

ביטוי, טיהור, התגבשות ואנזים אנזימים המכילים חלבונים בתחום הידרוקלז

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

עיבוד מלא של רקומביננטי KRAS4b: בידוד ואפיון של חלבון הפרג והמתילנטי

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...