Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
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Ringraziamo i dottori Jinfa Ying e Kristin Cano per le utili discussioni e l'assistenza tecnica. DSL è un St. Baldrick's Scholar e riconosce il sostegno della St. Baldrick's Foundation (634706). Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Welch Foundation (AQ-2001-20190330) a DSL, dal Max and Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant to DSL), UTHSA Start-Up Funds a DSL e da una Greehey Graduate Fellowship in Children's Health a CNJ. Questo lavoro si basa sulla ricerca condotta nelle Structural Biology Core Facilities, parte dei nuclei di ricerca istituzionali presso l'Health Science Center dell'Università del Texas a San Antonio supportati dall'Ufficio del Vice Presidente per la Ricerca e dal Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Requisiti generali per il protocollo: impianti di purificazione delle proteine, spettrometro UV-Vis, spettrometro NMR ad alto campo e software operativo, software di analisi post-elaborazione compreso; NMRPipe32, Sparky33, (o CCPN Analysis34, o NMRViewJ35).
1. Espressione ricombinante e purificazione di una proteina per misure PRE
<ol><li>Progettare un costrutto di espressione per la proteina di i...

È stato presentato un metodo per caratterizzare le interazioni transitorie che esistono in popolazioni basse tra proteine intrinsecamente disordinate e vari partner di legame che utilizzano PRE. Nell'esempio mostrato, la proteina è auto-associante, e quindi la PRE può derivare da una combinazione di interazioni inter e intramolecolari. Questo metodo è facilmente esteso a campioni eterogenei in cui le interazioni tra due diverse proteine possono essere caratterizzate. Informazioni complementari su come interagiscono l...

Il disturbo intrinseco (ID) descrive proteine (IDP) o regioni all'interno delle proteine (IDR) che non si ripiegano spontaneamente in strutture secondarie o terziarie stabili ma sono biologicamente attive. In generale, la funzione degli IDP/IDR è quella di facilitare interazioni specifiche ma reversibili con le biomolecole in condizioni fisiologiche1. Pertanto, gli IDP e gli IDR sono coinvolti in una serie di funzioni cellulari, tra cui il reclutamento, l'organizzazione e la stabilizzazione di complessi multiproteici, ad esempio, l'assemblaggio e l'attività dello spliceosoma2, il reclutamento e l'organizzazione dei componenti nei siti di danno al DNA3, l'organizzazione e la stabilizzazione del reclutamento dei complessi di trascrizione4 o del rimodellatore della cromatina BAF5. Inoltre, gli IDP si trovano nei nessi di segnalazione in cui la loro promiscuità per diversi partner di legame consente loro di mediare il trasferimento di informazioni attraverso le reti proteiche cellulari6. Recenti lavori hanno anche rivelato una propensione per le regioni IDR ad auto-associare condensati biomolecolari formanti attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido7. Molte delle funzioni sopra menzionate che coinvolgono l'ID sono ora pensate per coinvolgere alcuni aspetti della formazione di condensa8. Nonostante l'importanza dell'ID per l'assemblaggio di complessi biomolecolari, la stabilizzazione, l'impalcatura e la trasduzione del segnale, i dettagli atomici delle loro interazioni specifiche sono difficili da identificare poiché gli IDP e gli IDR non sono tipicamente suscettibili di indagini strutturali utilizzando la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica criogenica.
La risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica ideale per studiare l'ID in quanto non dipende dalla presenza di insiemi strutturali rigidi o omogenei, ma riferisce sull'ambiente locale immediato dei singoli nuclei. La frequenza di risonanza, o spostamento chimico, di un nucleo in una data molecola è influenzata da deboli campi magnetici indotti dalla distribuzione elettronica locale, che a sua volta dipende dalle lunghezze di legame, dagli angoli, dalla vicinanza di altri nuclei, dalle interazioni con i partner di legame e da altri fattori9. Pertanto, ogni nucleo agisce come una sonda strutturale unica e specifica del sito sensibile ai cambiamenti nel suo ambiente chimico locale. Nonostante questi vantaggi, la NMR è una tecnica di massa e lo spostamento chimico osservato è la media di tutti gli ambienti campionati da un particolare nucleo. Una serie di tecniche NMR, molte delle quali sono descritte in questo numero, sono state sviluppate per recuperare informazioni strutturali, dinamiche e cinetiche su conformazioni biomolecolari ad alta energia e scarsamente popolate contenute nello spostamento chimico medio10,11. Sebbene popolati transitoriamente, l'identificazione e la quantificazione di questi stati sono importanti per determinare i dettagli dei meccanismi funzionali12. Ad esempio, nel caso degli IDP e degli IDR, l'insieme conformazionale può essere distorto per campionare preferenzialmente conformazioni che sono produttive per la formazione di complessi di incontro con partner di legame fisiologici. L'individuazione di questi stati, così come l'identificazione delle interazioni e dinamiche inter- e intra-molecolari specifiche del residuo, sono importanti per determinare i meccanismi strutturali sottostanti alla funzione e alla formazione delle proteine.
Viene descritto un protocollo per l'utilizzo della NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico (PRE) per studiare stati transitori e scarsamente popolati importanti per la formazione di complessi biomolecolari mediati da IDP/IDR13. Questo approccio è utile per studiare le interazioni transitorie proteina-proteina come quelle che promuovono l'assemblaggio di fibrille amiloidi da α-sinucleina 14,15 o l'autoassociazione di FUS16, nonché per caratterizzare specifiche interazioni proteina-proteina come tra proteine di segnalazione17. Viene presentato un esempio di IDP auto-associante, in cui specifiche interazioni inter- e intra-molecolari si traducono in stati preferenzialmente compattati e interazioni sito-specifiche che guidano l'auto-associazione.
Il PRE deriva dall'interazione dipolare magnetica di un nucleo ad un centro paramagnetico con un tensore g isotropo, comunemente fornito sotto forma di un elettrone spaiato su un gruppo nitroxide o come atomo metallico paramagnetico18 (Figura 1). Mentre gli atomi con tensori g anisotropi producono anche un effetto PRE, l'analisi di questi sistemi è più difficile a causa degli effetti confondenti forniti dagli spostamenti pseudo-di contatto (PCS) o dall'accoppiamento dipolare residuo (RDC)13,19. La forza dell'interazione tra un nucleo e il centro paramagnetico dipende dalla distanza <r-6> tra i due. Questa interazione si traduce in un aumento dei tassi di rilassamento nucleare, che causa un allargamento della linea rilevabile anche per interazioni a lungo raggio (~10-35 Å), perché il momento magnetico dell'elettrone spaiato è così forte20,21. Il rilevamento di stati transitori con il PRE è possibile se sono soddisfatte le seguenti due condizioni; (1) l'interazione transitoria è in rapido scambio sulla scala temporale NMR (lo spostamento chimico osservato è una media ponderata per la popolazione degli stati di scambio); e (2) la distanza tra nuclei e centro paramagnetico è più breve nello stato popolato transitoriamente che nello stato maggiore11. Il PRE trasversale è indicato con Γ2 e, per motivi pratici, è calcolato dalla differenza nei tassi di rilassamento trasversale 1H tra un campione contenente un centro paramagnetico e un controllo diamagnetico. Per una trattazione approfondita della teoria del PRE e dei relativi spostamenti pseudo-di contatto nei regimi di scambio rapido e lento, si rimanda il lettore alle recensioni complete di Clore e collaboratori13,22. Qui, viene considerata solo la situazione in cui 1H N-Γ2 è nel regime di scambio veloce, dove a causa della dipendenza r-6 del PRE, il tasso di rilassamento osservato è correlato sia alla distanza a cui il centro paramagnetico si avvicina al nucleo sia alla quantità di tempo che trascorre in quella conformazione. Pertanto, le conformazioni transitorie che non implicano un approccio ravvicinato producono un piccolo PRE mentre interazioni più strette, anche se di breve durata, produrranno un PRE più grande.
Per gli IDP, il PRE viene utilizzato per misurare e differenziare le interazioni che si verificano all'interno di una singola molecola (intramolecolare) e tra molecole separate (intermolecolari). Attaccando un centro paramagnetico a una proteina NMR visibile (ad esempio, 15N-marcata) o NMR invisibile (ad esempio, abbondanza naturale 14N), è possibile determinare la fonte (inter- o intra-molecolare) del PRE (Figura 2). La mutagenesi sito-diretta che introduce un residuo di cisteina è un approccio conveniente per attaccare un centro paramagnetico (spin-label) a una proteina23. Sono stati proposti diversi tipi di molecole per l'uso come etichette di spin, tra cui la chelazione dei metalli (a base di EDTA) e i radicali liberi (a base di nitroxide)24. Sono state descritte varie etichette di spin nitroxide e sono disponibili con diverse sostanze chimiche reattive alla cisteina come metanetiosolfonato, maleimmide e iodoacetamide25,26 (Figura 1). La flessibilità intrinseca del tag o del linker può essere problematica per alcune analisi e, in queste situazioni, sono state proposte diverse strategie per limitare il movimento del tag, ad esempio aggiungendo gruppi chimici ingombranti o l'uso di un secondo linker per ancorare il tag alla proteina (attacco a due siti)27, 28. Inoltre, i tag disponibili in commercio possono contenere proteine diastereomeriche, ma generalmente ciò non contribuirà al PRE29 osservato. L'uso del 3-Maleimido-PROXYL legato ad una cisteina libera tramite chimica maleimmide è descritto poiché è prontamente disponibile, economico, non reversibile e l'agente riducente tris(2-carbossietil)fosfina (TCEP) può essere mantenuto nella soluzione per tutta la reazione di etichettatura. Poiché 3-Maleimido-PROXYL ha un tensore g isotropo, non vengono indotti PCS o RDC e le stesse assegnazioni di spostamento chimico possono essere utilizzate sia per i campioni paramagnetici che diamagnetici13.
L'1HN-T 2 viene misurato utilizzando una strategia a due punti temporali (T a, Tb) che in precedenza ha dimostrato di essere accurata quanto la raccolta di una serie di evoluzione completa composta da 8 a 12 punti temporali30. Il primo punto temporale (T a) è fissato il più vicino possibile allo zero e la lunghezza ottimale del secondo punto temporale dipende dalla grandezza del PRE più grande atteso per un dato campione e può essere stimato da: Tb ~ 1,15 / (R 2,dia + Γ 2) dove R 2,dia rappresenta l'R 2 del campione diamagnetico13. Se la grandezza dei PRE più grandi è sconosciuta, impostare T b a ~ una volta l'1H T 2 della proteina è una buona stima iniziale e ulteriormente ottimizzata regolando T2 per migliorare il segnale al rumore. Questa strategia di misurazione a due punti riduce significativamente il tempo sperimentale necessario per misurare i PR e consente di calcolare la media del segnale, in particolare perché vengono utilizzati campioni relativamente diluiti per ridurre al minimo gli effetti dei contatti non specifici tra le molecole. Una sequenza di impulsi basata su HSQC viene utilizzata per misurare 1H N-T2 ed è stata descritta in dettaglio altrove30. Per una migliore sensibilità, gli impulsi duri dei trasferimenti INEPT avanti e indietro possono essere sostituiti con impulsi sagomati; in alternativa, la sequenza viene prontamente convertita in una lettura basata su TROSY31. Poiché gli IDP hanno tipicamente tassi di rilassamento trasversale molto più lunghi con conseguenti larghezze di linea più strette (a causa del disturbo intrinseco) rispetto alle proteine globulari di dimensioni simili, lunghi tempi di acquisizione nella dimensione indiretta possono essere utilizzati per migliorare la risoluzione spettrale e alleviare la limitazione della dispersione dello spostamento chimico inerente agli IDP.
PRE è uno strumento utile per studiare le interazioni proteina-proteina e proteina-acido nucleico, in particolare le interazioni che sono transitorie o scarsamente popolate. Viene fornito un protocollo dettagliato per la preparazione di un campione NMR adatto alla misurazione dei PRE, comprese le fasi per la purificazione delle proteine, l'etichettatura dello spin diretto al sito, l'impostazione e la calibrazione del programma di impulsi, l'elaborazione e l'interpretazione dei dati NMR. Importanti considerazioni sperimentali sono notate in tutto ciò che può influire sulla qualità dei dati e sui risultati sperimentali, compresa la concentrazione del campione, la selezione dell'etichetta di spin e la rimozione dei componenti paramagnetici.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Le proteine intrinsecamente disordinate e le regioni intrinsecamente disordinate all'interno delle proteine costituiscono una parte ampia e funzionalmente significativa del proteoma umano. La natura altamente flessibile di queste sequenze consente loro di formare interazioni deboli, a lungo raggio e transitorie con diversi partner biomolecolari. Interazioni specifiche ma a bassa affinità promuovono il legame promiscuo e consentono a un singolo segmento intrinsecamente disordinato di interagire con una moltitudine di siti target. A causa della natura transitoria di queste interazioni, possono essere difficili da caratterizzare con metodi di biologia strutturale che si basano sulle proteine per formare una singola conformazione predominante. La NMR di miglioramento del rilassamento paramagnetico è uno strumento utile per identificare e definire la base strutturale delle interazioni deboli e transitorie. Viene descritto un protocollo dettagliato per l'utilizzo del potenziamento del rilassamento paramagnetico per caratterizzare i complessi di incontro scarsamente popolati che si formano tra proteine intrinsecamente disordinate e la loro proteina, acido nucleico o altri partner biomolecolari.

I PREs intramolecolari 1H N-Γ2 sono stati registrati su un frammento auto-associante, intrinsecamente disordinato (residui 171-264) derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR142 (Figura 3). Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin (ad esempio, il residuo 178 o 260 nella figura 3) siano significativamen...

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Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Viene presentato un protocollo per l'applicazione della spettroscopia NMR di potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare interazioni inter- e intra-molecolari deboli e transitorie in proteine intrinsecamente disordinate.

Potenziamento del rilassamento paramagnetico per rilevare e caratterizzare le auto-associazioni di proteine intrinsecamente disordinate

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

La tecnica di potenziamento del rilassamento paramagnetico può essere utilizzata per caratterizzare e misurare le distanze intermolecolari e quantificare interazioni biomolecolari transitorie e/o scarsamente popolate. Qui, abbiamo applicato questa tecnica per catturare le interazioni che precedono la condensazione delle proteine. La sensibilità dei PRE consente l'identificazione della risoluzione atomica, il rilevamento e la quantificazione di stati dinamici che rimangono invisibili e inaccessibili ad altre tecniche NMR.I passaggi chiave di questo protocollo includono la rimozione dell'etichetta di spin nitroxide non coniugato e l'analisi attenta degli spettri per misurare con precisione l'altezza del picco. Inoltre, è necessario prestare attenzione durante la configurazione dell'esperimento NMR e la calibrazione degli impulsi. Per iniziare, aggiungere 3-maleimido-PROXYL da una soluzione madre a 20 volte l'eccesso molare della proteina di interesse marcata isotopicamente 15N.Incubare durante la notte a temperatura ambiente o quattro gradi Celsius al riparo dalla luce e dall'ossigeno e con un leggero dondolio o nutazione. Il giorno seguente, rimuovere l'etichetta di centrifuga libera non reagita per evitare che il solvente non specifico PRE utilizzi una dialisi estesa del campione proteico o la filtrazione su gel. Quindi utilizzare il reagente di Ellman per quantificare i gruppi sulfidrilici liberi nella soluzione.Misurare l'assorbanza utilizzando un lettore di micropiastre e costruire la curva standard. Per misurare la PRE intramolecolare, preparare una proteina marcata con spin arricchita isotopicamente 15N ad una concentrazione di almeno 100 micromolari, ma non superiore a 300 micromolari, in un tampone adatto per la NMR. Quindi, utilizzando una pipetta di vetro a gambo lungo o una micropipetta, trasferire il campione NMR in un tubo NMR da cinque millimetri appropriato per l'uso in magneti ad alto campo.Posizionare il campione nel magnete. Blocca il segnale del deuterio usando il comando di blocco e sintonizza e abbina il canale protonico secondo i protocolli della struttura. Quindi regolare gli spessori utilizzando la subroutine di spessore superiore per ottimizzare la soppressione del segnale del solvente.Quindi, calibrare l'impulso protonico utilizzando il programma P-OPT. Quindi calibrare l'impulso 15N rispetto a un campione standard. Determinare l'attenuazione corretta per gli impulsi sagomati utilizzando la subroutine dello strumento forma.Quindi aprire il file di forma a impulsi appropriato facendo clic sull'icona della cartella. Gli impulsi sagomati si trovano nella sezione dei parametri di impulso dei parametri di acquisizione. Dopo aver caricato il file di definizione dell'impulso, fare clic su Analizza forma d'onda, quindi su Integra forma.Immettere l'impulso duro di 90 gradi del protone calibrato, la lunghezza dell'impulso di forma desiderata e la rotazione. Quindi calcolare il livello di potenza dell'impulso sagomato aggiungendo la variazione del livello di potenza all'attenuazione per l'impulso calibrato di 90 gradi. Registrare un protone 15N HSQC standard per ottimizzare la larghezza di sweep, la frequenza portante e controllare la soppressione dell'acqua.Infine, regolate la larghezza della sweep e il numero di incrementi di quota indiretti utilizzando i comandi SW e TD o direttamente nelle finestre di dialogo appropriate. Calibrare gli impulsi sagomati come dimostrato in precedenza. Quindi immettere le lunghezze di impulso calibrate nella sezione dei parametri di impulso della scheda Parametri di acquisizione.Per misurare il protone ammidico T2 utilizzando l'approccio a due punti di ritardo temporale, impostare i ritardi temporali modificando il file di elenco VD. Il primo ritardo è impostato su 0,01 millisecondi. Utilizzando la relazione con il PER massimo previsto, scegliere il secondo ritardo.Quindi determinare un valore adatto confrontando i primi incrementi del primo e del secondo spettro di ritardo e regolando il secondo ritardo in modo tale che il segnale decada tra il 40 e il 50% del suo valore iniziale. Determinare il numero di punti complessi da registrare e il numero di scansioni per una media del segnale sufficiente. Quindi utilizzare il comando EXPT per calcolare il tempo dell'esperimento e avviare l'esperimento con il comando ZG. Dopo aver sciolto l'ascorbato di sodio nel tampone NMR, regolare il pH in modo che corrisponda a quello del tampone NMR originale.Quindi aggiungere l'acido ascorbico al tubo NMR con un eccesso molare di 10 volte superiore alla concentrazione dell'etichetta di spin posizionando una goccia sotto il bordo del tubo. Tappare il tubo e capovolgere con attenzione per mescolare. Centrifugare a 200-400 G per 10-20 secondi in una centrifuga a manovella per depositare il campione sul fondo del tubo.Dopo aver avvolto il tubo in un foglio, lasciare che la reazione proceda per almeno tre ore. Quindi registrare il protone ammidico T2 sul campione diamagnetico utilizzando gli stessi parametri utilizzati per il campione paramagnetico. I PRE di protoni gamma ammidici intramolecolari sono stati registrati su un frammento intrinsecamente disordinato auto-associante derivato dal dominio a bassa complessità della proteina legante l'RNA EWSR1.Si prevede che i residui in stretta prossimità sequenziale del punto di attacco dell'etichetta di spin siano significativamente ampliati e non siano rilevabili nello spettro. I residui che erano distanziati sequenzialmente dal punto di attacco ma mostravano una gamma migliorata erano spazialmente vicini all'etichetta di spin. Nel caso di proteine intrinsecamente disordinate, la registrazione e l'analisi dei purei produrrà informazioni sui contatti intramolecolari e sulle superfici di interazione transitoria.La combinazione di misurazioni PRE con altri metodi biofisici come la diffusione dinamica della luce, la cromatografia ad esclusione dimensionale, l'ultracentrifugazione analitica e i metodi computazionali può fornire informazioni più approfondite. La misura PRE aiuta a caratterizzare lo stato transitorio scarsamente popolato. Questo approccio potrebbe essere ampliato per caratterizzare interazioni importanti per una miriade di processi biologici come il riconoscimento molecolare, la selezione conformazionale allosterica e i processi di assemblaggio, incluso l'assemblaggio di organelli senza membrana tramite separazione di fase.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l&#39;identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Ricerca

Biochimica

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso di risonanza paramagnetica elettronica in campioni biologici a temperatura ambiente e 77 K

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Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b ricombinante completamente elaborato: isolamento e caratterizzazione delle proteine di Farnesylated e Metylated

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caratterizzare le proteine cellulari con l'ossidazione fotochimica veloce all'incell delle proteine

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Sezionamento trasversale di riso maturo (Oryza sativa L.) Kernel per la scansione di immagini al microscopio elettronico utilizzando le punte delle pipette come supporto per l'immobilizzazione

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 di cui: la commissione per i N CPMG Relaxation Dispersion per lo studio delle dinamiche conformazionali proteiche sulla scala cronologica μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Aspetti pratici della preparazione del campione e della configurazione di 1H R1ρ Esperimenti di dispersione di rilassamento dell'RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...