Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Vi takker Dr. Jinfa Ying og Kristin Cano for nyttige diskusjoner og teknisk assistanse. DSL er en St. Baldrick's Scholar og anerkjenner støtten fra St. Baldrick's Foundation (634706). Dette arbeidet ble delvis støttet av Welch Foundation (AQ-2001-20190330) til DSL, Max og Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant til DSL), UTHSA Start-Up Funds til DSL, og et Greehey Graduate Fellowship in Children's Health til CNJ. Dette arbeidet er basert på forskning utført i Structural Biology Core Facilities, en del av institusjonelle forskningskjerner ved University of Texas Health Science Center i San Antonio støttet av kontoret til visepresidenten for forskning og Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Generelle krav til protokollen: proteinrenseanlegg, UV-Vis-spektrometer, høyfelts NMR-spektrometer og driftsprogramvare, programvare for etterbehandlingsanalyse inkludert; NMRPipe32, Sparky 33, (eller CCPN Analysis 34, eller NMRViewJ35).
1. Rekombinant ekspresjon og rensing av et protein for PRE-målinger
<ol><li>Design en uttrykkskonstruksjon for proteinet av interesse slik at det er en enkelt c...

En metode for å karakterisere forbigående interaksjoner som eksisterer ved lave populasjoner mellom iboende uordnede proteiner og ulike bindingspartnere ved bruk av PRE har blitt presentert. I eksemplet vist er proteinet selvassosierende, og dermed kan PRE oppstå fra en kombinasjon av inter- og intramolekylære interaksjoner. Denne metoden utvides lett til heterogene prøver der interaksjonene mellom to forskjellige proteiner kan karakteriseres. Utfyllende informasjon om hvordan forskjellige regioner av proteinet samh...

Intrinsic disorder (ID) beskriver proteiner (IDP) eller regioner i proteiner (IDR) som ikke spontant brettes inn i stabile sekundære eller tertiære strukturer, men er biologisk aktive. Generelt er funksjonen til IDP/IDR å legge til rette for spesifikke, men reversible interaksjoner med biomolekyler ved fysiologiske forhold1. Dermed er internt fordrevne og IDR involvert i en rekke cellulære funksjoner, inkludert rekruttering, organisering og stabilisering av multiproteinkomplekser, for eksempel montering og aktivitet av spleiseosom2, rekruttering og organisering av komponenter på steder med DNA-skade3, organisering og stabilisering av rekruttering av transkripsjonskomplekser4, eller av kromatinremodeler BAF5. I tillegg finnes internt fordrevne ved signalnexuser der deres promiskuitet for forskjellige bindingspartnere gjør dem i stand til å formidle informasjonsoverføring gjennom cellulære proteinnettverk6. Nylig arbeid har også avslørt en tilbøyelighet for IDR-regioner til selvassosierende dannelse av biomolekylære kondensater gjennom prosessen med væske-væskefaseseparasjon7. Mange av de nevnte funksjonene som involverer ID antas nå også å innebære et aspekt av kondensatdannelse8. Til tross for betydningen av ID for biomolekylær kompleks montering, stabilisering, stillas og signaltransduksjon, er atomdetaljene i deres spesifikke interaksjoner vanskelige å identifisere siden internt fordrevne og IDR vanligvis ikke er mottagelige for strukturelle undersøkelser ved hjelp av røntgenkrystallografi eller kryogen elektronmikroskopi.
Kjernemagnetisk resonans (NMR) er en ideell teknikk for å undersøke ID, da den ikke er avhengig av tilstedeværelsen av stive eller homogene strukturelle ensembler, men rapporterer om det umiddelbare lokale miljøet til individuelle kjerner. Resonansfrekvensen, eller kjemisk skifte, av en kjerne i et gitt molekyl påvirkes av svake magnetfelt indusert av den lokale elektroniske fordelingen, som igjen er avhengig av bindingslengder, vinkler, nærhet av andre kjerner, interaksjoner med bindingspartnere og andre faktorer9. Dermed fungerer hver kjerne som en unik, stedsspesifikk strukturell sonde som er følsom for endringer i sitt lokale kjemiske miljø. Til tross for disse fordelene er NMR en bulkteknikk, og det observerte kjemiske skiftet er gjennomsnittet av alle miljøene som er samplet av en bestemt kjerne. En rekke NMR-teknikker, hvorav mange er beskrevet i dette nummeret, er utviklet for å gjenopprette strukturell, dynamisk og kinetisk informasjon om høy energi, lavt befolkede biomolekylære konformasjoner som finnes i gjennomsnittlig kjemisk skift10,11. Selv om de er forbigående befolket, er identifisering og kvantifisering av disse tilstandene viktige for å bestemme detaljene i funksjonelle mekanismer12. For eksempel, når det gjelder internt fordrevne og IDR, kan det konformasjonelle ensemblet være partisk til fortrinnsvis prøvekonformasjoner som er produktive for dannelsen av møtekomplekser med fysiologiske bindingspartnere. Påvisning av disse tilstandene, samt identifisering av restspesifikke inter- og intramolekylære interaksjoner og dynamikk, er viktig for å bestemme de underliggende strukturelle mekanismene for proteinfunksjon og kompleksdannelse.
En protokoll for bruk av paramagnetisk avslapningsforbedring (PRE) NMR for å undersøke forbigående, lavt befolkede tilstander som er viktige for dannelsen av IDP/IDR-medierte biomolekylære komplekser er beskrevet13. Denne tilnærmingen er nyttig for å studere forbigående protein-protein-interaksjoner som de som fremmer montering av amyloidfibriller fra α-synuclein 14,15 eller selvforeningen til FUS16, samt å karakterisere spesifikke protein-protein-interaksjoner som mellom signalproteiner17. Et eksempel på en selvassosierende IDP presenteres, der spesifikke inter- og intramolekylære interaksjoner resulterer i fortrinnsvis komprimerte tilstander samt stedsspesifikke interaksjoner som driver selvassosiasjon.
PRE oppstår fra den magnetiske dipolare interaksjonen mellom en kjerne og et paramagnetisk senter med en isotrop g-tensor, vanligvis levert i form av et uparret elektron på en nitroxidgruppe eller som et paramagnetisk metallatom18 (figur 1). Mens atomer med anisotrope g-tensorer også produserer en PRE-effekt, er analyse av disse systemene vanskeligere på grunn av forvirrende effekter bidratt av pseudokontaktskiftene (PCS) eller gjenværende dipolar kobling (RDC)13,19. Styrken av samspillet mellom en kjerne og det paramagnetiske senteret er avhengig av <r-6> avstanden mellom de to. Denne interaksjonen resulterer i en økning i kjernefysiske avslapningshastigheter, noe som fører til at påviselig linjeutvidelse selv for langdistanseinteraksjoner (~ 10-35 Å), fordi det magnetiske momentet til det uparede elektronet er så sterkt20,21. Påvisning av forbigående tilstander med PRE er mulig hvis følgende to betingelser er oppfylt; (1) den forbigående interaksjonen er i rask utveksling på NMR-tidsskalaen (observert kjemisk skift er et populasjonsvektet gjennomsnitt av utvekslingstilstandene); og (2) kjernene til paramagnetisk senteravstand er kortere i forbigående befolket tilstand enn i hovedstaten11. Den tverrgående PRE er betegnet Γ2 og beregnes for praktiske formål ut fra forskjellen i 1H tverrgående relaksasjonshastigheter mellom en prøve som inneholder et paramagnetisk senter og en diamagnetisk kontroll. For en grundig behandling av teorien om PRE og relaterte pseudokontaktskift i raske og langsomme utvekslingsregimer, henvises leseren til de omfattende vurderingene av Clore og medarbeidere13,22. Her vurderes bare situasjonen der 1H N-Γ2 er i det raske utvekslingsregimet, hvor på grunn av r-6-avhengigheten av PRE, er den observerte avslapningshastigheten relatert til både avstanden som det paramagnetiske senteret nærmer seg kjernen, samt hvor mye tid det bruker i den konformasjonen. Derfor vil forbigående konformasjoner som ikke involverer en nær tilnærming produsere en liten PRE, mens nærmere interaksjoner, selv om de er kortvarige, vil produsere en større PRE.
For internt fordrevne brukes PRE til å måle og differensiere interaksjonene som forekommer i et enkelt molekyl (intramolekylært) og mellom separate molekyler (intermolekylært). Ved å feste et paramagnetisk senter til et NMR synlig (f.eks. 15N-merket) eller NMR usynlig (f.eks. naturlig mengde 14N) protein, kan kilden (inter- eller intramolekylær) til PRE bestemmes (figur 2). Stedsrettet mutagenese som introduserer en cysteinrest er en praktisk tilnærming for å feste et paramagnetisk senter (spin-label) til et protein23. Flere typer molekyler har blitt foreslått for bruk som spinnetiketter, inkludert metallchelaterende (EDTA-basert) og frie radikaler (nitroksidbasert)24. Ulike nitroxidspinnetiketter er beskrevet og er tilgjengelige med forskjellige cysteinreaktive kjemikalier som metanetiosulfonat, maleimid og jodoacetamid25,26 (figur 1). Iboende fleksibilitet av taggen eller linkeren kan være problematisk for visse analyser, og i disse situasjonene har forskjellige strategier blitt foreslått for å begrense bevegelsen av taggen, for eksempel ved å legge til store kjemiske grupper eller bruk av en annen linker for å forankre taggen til proteinet (to stedsvedlegg)27, 28. I tillegg kan kommersielt tilgjengelige tagger inneholde diastereomere proteiner, men generelt vil dette ikke bidra til den observerte PRE29. Bruken av 3-Maleimido-PROXYL festet til en fri cystein via maleimidkjemi er beskrevet siden den er lett tilgjengelig, kostnadseffektiv, ikke-reversibel, og reduksjonsmiddelet tris(2-karboksyetyl)fosfin (TCEP) kan opprettholdes i løsningen gjennom hele merkingsreaksjonen. Siden 3-Maleimido-PROXYL har en isotrop g-tensor, induseres ingen PCS eller RDC, og de samme kjemiske skiftoppgavene kan brukes til både de paramagnetiske og diamagnetiske prøvene13.
1HN-T 2 måles ved hjelp av en topunktsstrategi (T a, Tb) som tidligere har vist seg å være like nøyaktig som å samle en full evolusjonsserie bestående av 8 til 12 tidspunkter30. Det første tidspunktet (T a) er satt så nær null som praktisk mulig, og den optimale lengden på det andre tidspunktet er avhengig av størrelsen på den største forventede PRE for en gitt prøve og kan estimeres fra: Tb ~ 1,15 / (R 2, dia + Γ 2) hvor R 2, dia representerer R 2 i den diamagnetiske prøven13. Hvis størrelsen på de største PREene er ukjent, er innstillingen T b til ~ en ganger 1 H T 2 av proteinet et godt innledende estimat og ytterligere optimalisert ved å justere T2 for å forbedre signalet til støy. Denne topunkts målestrategien reduserer betydelig den eksperimentelle tiden som kreves for å måle PREs og gir tid til mer signalgjennomsnitt, spesielt siden relativt fortynnede prøver brukes til å minimere effekten av ikke-spesifikke kontakter mellom molekyler. En HSQC-basert pulssekvens brukes til å måle 1H N-T2 og er beskrevet i detalj andre steder30. For forbedret følsomhet kan de harde pulsene til INEPT-overføringene forover og bak erstattes med formede pulser; alternativt er sekvensen lett konvertert til en TROSY-basert avlesning31. Siden internflyktninger vanligvis har mye lengre tverrrelaksasjonshastigheter, noe som resulterer i smalere linjebredder (på grunn av den iboende lidelsen) enn kuleformede proteiner av tilsvarende størrelse, kan lange innsamlingstider i den indirekte dimensjonen brukes til å forbedre spektraloppløsningen og lindre den kjemiske skiftdispersjonsbegrensningen som er iboende for internt fordrevne.
PRE er et nyttig verktøy for å studere protein-protein og protein-nukleinsyre-interaksjoner, spesielt interaksjoner som er forbigående eller lite befolket. En detaljert protokoll for fremstilling av en NMR-prøve egnet for måling av PREs, inkludert trinn for proteinrensing, stedsrettet spinnmerking, oppsett og kalibrering av pulsprogrammet, behandling og tolkning av NMR-dataene, er gitt. Viktige eksperimentelle hensyn er notert gjennomgående som kan påvirke datakvalitet og eksperimentelt utfall, inkludert prøvekonsentrasjon, valg av spinnetikett og fjerning av paramagnetiske komponenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Intrinsically forstyrrede proteiner og iboende uordnede regioner i proteiner utgjør en stor og funksjonelt signifikant del av det menneskelige proteomet. Den svært fleksible naturen til disse sekvensene tillater dem å danne svake, langdistanse og forbigående interaksjoner med forskjellige biomolekylære partnere. Spesifikke, men likevel interaksjoner med lav affinitet fremmer promiskuøs binding og gjør det mulig for et enkelt iboende uordnet segment å samhandle med en rekke målnettsteder. På grunn av den forbigående karakteren av disse interaksjonene, kan de være vanskelige å karakterisere ved strukturelle biologiske metoder som er avhengige av proteiner for å danne en enkelt, dominerende konformasjon. Paramagnetisk avspenningsforbedring NMR er et nyttig verktøy for å identifisere og definere det strukturelle grunnlaget for svake og forbigående interaksjoner. En detaljert protokoll for bruk av paramagnetisk avslapningsforbedring for å karakterisere de lite befolkede møtekompleksene som dannes mellom iboende uordnede proteiner og deres protein, nukleinsyre eller andre biomolekylære partnere er beskrevet.

Intramolekylære 1H N-Γ2 PREs ble registrert på et selvassosierende, iboende uordnet fragment (rester 171-264) avledet fra lavkompleksitetsdomenet til RNA-bindende protein EWSR142 (figur 3). Rester i umiddelbar sekvensiell nærhet til spinnetikettfestepunktet (f.eks. rester 178 eller 260 i figur 3) forventes å bli betydelig utvidet og kan ikke påvises i spekteret. Rester som er sekvensielt for...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

En protokoll for anvendelse av paramagnetisk avslapningsforbedring NMR-spektroskopi for å oppdage svake og forbigående inter- og intramolekylære interaksjoner i iboende uordnede proteiner presenteres.

Paramagnetisk avslapningsforbedring for å oppdage og karakterisere selvforeninger av iboende uordnede proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Den paramagnetiske avslapningsforbedringsteknikken kan brukes til å karakterisere og måle intermolekylære avstander og kvantifisere forbigående og / eller lavt befolkede biomolekylære interaksjoner. Her har vi brukt denne teknikken til å fange interaksjoner som går foran proteinkondensering. Følsomheten til PREs muliggjør identifisering av atomoppløsning, deteksjon og kvantifisering av dynamisk tilstand som forblir usynlig og utilgjengelig for andre NMR-teknikker.Viktige trinn i denne protokollen inkluderer å fjerne den ukonjugerte nitroxidspinnetiketten og analysere spektrene nøye for å måle topphøyde nøyaktig. I tillegg må det utvises forsiktighet under oppsett av NMR-eksperiment og pulskalibrering. For å begynne, tilsett 3-maleimido-PROXYL fra en stamløsning ved 20 ganger molært overskudd av det 15N isotopisk merkede proteinet av interesse.Inkuber over natten ved romtemperatur eller fire grader Celsius, beskyttet mot lys og oksygen, og med forsiktig gynging eller muttering. Neste dag, fjern den ikke-reagerte frie spinnetiketten for å forhindre uspesifikk løsningsmiddel PRE ved bruk av enten omfattende dialyse av proteinprøven eller ved bruk av gelfiltrering. Bruk deretter Ellmans reagens for å kvantifisere frie sulfhydrylgrupper i løsningen.Mål absorbansen ved hjelp av en mikroplateleser og konstruer standardkurven. For å måle intramolekylær PRE, klargjør 15N isotopisk beriket spinnmerket protein til en konsentrasjon på minst 100 mikromolar, men ikke mer enn 300 mikromolar, i en buffer egnet for NMR. Bruk deretter en lang stamglasspipette eller mikropipette til å overføre NMR-prøven til et fem millimeter NMR-rør som er egnet for bruk i høyfeltmagneter.Plasser prøven i magneten. Lås på deuteriumsignalet ved hjelp av låsekommandoen og juster og match protonkanalen i henhold til anleggsprotokoller. Juster deretter mellomleggene ved hjelp av underrutinen for toppmellomlegg for å optimalisere undertrykkelse av løsemiddelsignal.Deretter kalibrerer du protonpulsen ved hjelp av P-OPT-programmet. Kalibrer deretter 15N-pulsen mot en standardprøve. Bestem riktig demping for formede pulser ved hjelp av underrutinen for formverktøyet.Åpne deretter den aktuelle pulsformfilen ved å klikke på mappeikonet. De formede pulser finnes i pulsparameterdelen av oppkjøpsparametere. Etter at du har lastet inn pulsdefinisjonsfilen, klikker du Analyser bølgeform, etterfulgt av Integrer form.Skriv inn det kalibrerte protonet 90 graders hard puls, ønsket formpulslengde og rotasjon. Beregn deretter effektnivået til den formede pulsen ved å legge til endringen av effektnivået til dempingen for den kalibrerte 90 graders pulsen. Ta opp en standard proton 15N HSQC for å optimalisere feiebredde, bærefrekvens og kontrollere vannundertrykkelse.Til slutt justerer du oppryddingsbredden og antall indirekte dimensjonsintervaller ved hjelp av SW- og TD-kommandoene eller direkte i de aktuelle dialogboksene. Kalibrer de formede pulsene som vist tidligere. Skriv deretter inn de kalibrerte pulslengdene i delen for pulsparametere i kategorien Anskaffelsesparametere.For å måle amidprotonet T2 ved hjelp av totidsforsinkelsespunkttilnærmingen, angi tidsforsinkelsene ved å redigere VD-listefilen. Den første forsinkelsen er satt til 0,01 millisekunder. Bruk relasjonen til forventet maksimal PRE, og velg den andre forsinkelsen.Deretter bestemmer du en passende verdi ved å sammenligne de første trinnene i det første og andre forsinkelsesspekteret og justere den andre forsinkelsen slik at signalet henfaller til mellom 40 og 50% av den opprinnelige verdien. Bestem antall komplekse punkter som skal registreres og antall skanninger for tilstrekkelig signalgjennomsnitt. Bruk deretter kommandoen EXPT for å beregne eksperimenttiden og start eksperimentet med kommandoen ZG. Etter oppløsning av natriumaskorbat i NMR-bufferen, juster pH slik at den samsvarer med den opprinnelige NMR-bufferen.Deretter tilsettes askorbinsyren til NMR-røret ved et 10 ganger molært overskudd over konsentrasjonen av spinnetiketten ved å plassere en dråpe under rørets kant. Sett lokk på røret og vend forsiktig opp ned for å blande. Spinn ved 200 til 400 G i 10 til 20 sekunder i en håndsveivet sentrifuge for å avgjøre prøven i bunnen av røret.Etter å ha pakket røret i folie, la reaksjonen fortsette i minst tre timer. Ta deretter opp amidproton T2 på den diamagnetiske prøven ved å bruke de samme parametrene som brukes til den paramagnetiske prøven. Intramolekylære amidprotongammas PREs ble registrert på et selvassosierende iboende uordnet fragment avledet fra domenet med lav kompleksitet av RNA-bindingsproteinet EWSR1.Rester i umiddelbar sekvensiell nærhet til festepunktet for spinnetiketten forventes å bli betydelig utvidet og kan ikke påvises i spekteret. Rester som var sekvensielt fordelt fra festepunktet, men likevel viste forbedret gamma, var romlig nær spinnetiketten. Når det gjelder indre uordnede proteiner, vil registrering og analyse av pureer gi informasjon om intramolekylære kontakter og forbigående interaksjonsflater.Kombinere PRE-målinger med andre biofysiske metoder som dynamisk lysspredning, størrelsesekskluderingskromatografi, analytisk ultrasentrifugering og beregningsmetoder kan gi dypere innsikt. PRE-måling hjelper til med å karakterisere forbigående tynt befolket tilstand. Denne tilnærmingen kan utvides for å karakterisere interaksjoner som er viktige for utallige biologiske prosesser som molekylær anerkjennelse, allosterisk konformasjonsvalg og monteringsprosesser, inkludert montering av membranløse organeller via faseseparasjon.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear Magnetic Resonance spektroskopi for identifisering av flere Phosphorylations med egen Uordnede Proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Bruk av elektron spinn resonans i biologiske prøver omgivelsestemperatur og 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerende sølv farging av proteiner i polyakrylamid Gels

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakteriserer individuelle protein aggregater av infrarød Nanospectroscopy og Atomic Force mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullt behandlet rekombinant KRAS4b: isolere og karakteriserer Farnesylated og denaturert protein

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tverrgående seksjonering av eldre ris (Oryza sativa L.) Kjerner for skanning av elektronmikroskopiavbildning ved hjelp av pipettespisser som immobiliseringsstøtte

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 N CPMG avslapning dispersjon for undersøkelse av protein konformasjonsdynamikk på μs-ms tidsskala

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiske aspekter ved prøvepreparering og oppsett av 1H R1ρ avslapningsspredningsforsøk av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...