Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
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Agradecemos aos Drs. Jinfa Ying e Kristin Cano pelas discussões úteis e assistência técnica. A DSL é St. Baldrick's Scholar e reconhece o apoio da St. Baldrick's Foundation (634706). Este trabalho foi apoiado em parte pela Fundação Welch (AQ-2001-20190330) para DSL, o Fundo Max e Minnie Tomerlin Voelcker (Voelcker Foundation Young Investigator Grant para DSL), UTHSA Start-Up Funds para DSL, e uma bolsa de pós-graduação Greehey em Saúde Infantil para CNJ. Este trabalho é baseado em pesquisas conduzidas nas Instalações do Núcleo de Biologia Estrutural, parte dos Núcleos de Pesquisa Institucionais do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Texas em San Antonio, apoiados pelo Escritório do Vice-Presidente de Pesquisa e pelo Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Requisitos gerais para o protocolo: instalações de purificação de proteínas, espectrômetro UV-Vis, espectrômetro de RMN de alto campo e software operacional, software de análise pós-processamento, incluindo; NMRPipe32, Sparky 33, (ou CCPN Analysis 34, ou NMRViewJ35).
1. Expressão recombinante e purificação de uma proteína para medições de PRE
<ol><li>Projetar uma construção de exp...

Um método para caracterizar interações transitórias que existem em populações baixas entre proteínas intrinsecamente desordenadas e vários parceiros de ligação usando PRE foi apresentado. No exemplo mostrado, a proteína é auto-associativa e, portanto, a PRE pode surgir de uma combinação de interações inter e intramoleculares. Este método é prontamente estendido para amostras heterogêneas onde as interações entre duas proteínas diferentes podem ser caracterizadas. Informações complementares sobre c...

A desordem intrínseca (DI) descreve proteínas (IDPs) ou regiões dentro de proteínas (IDRs) que não se dobram espontaneamente em estruturas secundárias ou terciárias estáveis, mas são biologicamente ativas. Geralmente, a função das IDPs/IDRs é facilitar interações específicas, porém reversíveis, com biomoléculas em condições fisiológicas1. Assim, IDPs e IDRs estão envolvidas em uma variedade de funções celulares, incluindo recrutamento, organização e estabilização de complexos multiproteicos, por exemplo, a montagem e atividade do spliceossomo2, recrutamento e organização de componentes em locais de dano ao DNA3, organização e estabilização do recrutamento de complexos de transcrição4, ou do remodelador de cromatina BAF5. Além disso, os IDPs são encontrados em nexos de sinalização, onde sua promiscuidade para diferentes parceiros de ligação lhes permite mediar a transferência de informações através de redes de proteínas celulares6. Trabalhos recentes também revelaram uma propensão para regiões IDR se auto-associarem formando condensados biomoleculares através do processo de separação de fases líquido-líquido7. Acredita-se que muitas das funções acima mencionadas envolvendo ID também envolvam algum aspecto da formação do condensado8. Apesar da importância do ID para montagem de complexos biomoleculares, estabilização, andaimes e transdução de sinal, os detalhes atômicos de suas interações específicas são difíceis de identificar, uma vez que IDPs e IDRs normalmente não são passíveis de investigações estruturais usando cristalografia de raios X ou microscopia eletrônica criogênica.
A ressonância magnética nuclear (RMN) é uma técnica ideal para investigar a DI, pois não depende da presença de conjuntos estruturais rígidos ou homogêneos, mas relata o ambiente local imediato de núcleos individuais. A frequência de ressonância, ou deslocamento químico, de um núcleo em uma dada molécula é influenciada por campos magnéticos fracos induzidos pela distribuição eletrônica local, que por sua vez é dependente de comprimentos de ligação, ângulos, proximidade de outros núcleos, interações com parceiros de ligação e outros fatores9. Assim, cada núcleo atua como uma sonda estrutural única, sítio-específica, sensível a mudanças em seu ambiente químico local. Apesar dessas vantagens, a RMN é uma técnica de massa, e o deslocamento químico observado é a média de todos os ambientes amostrados por um determinado núcleo. Uma série de técnicas de RMN, muitas das quais são descritas neste número, foi desenvolvida para recuperar informações estruturais, dinâmicas e cinéticas sobre conformações biomoleculares de alta energia e baixa densidade populacional contidas no deslocamento químico médio10,11. Embora transitoriamente povoados, a identificação e quantificação desses estados são importantes para determinar os detalhes dos mecanismos funcionais12. Por exemplo, no caso de IDPs e IDRs, o conjunto conformacional pode ser enviesado para amostras preferenciais de conformações que são produtivas para a formação de complexos de encontro com parceiros de ligação fisiológicos. A detecção desses estados, bem como a identificação das interações e dinâmicas inter e intramoleculares específicas do resíduo, são importantes para determinar os mecanismos estruturais subjacentes da função proteica e da formação de complexos.
Um protocolo para o uso de RMN de realce de relaxação paramagnética (PRE) para investigar estados transitórios e pouco povoados importantes para a formação de complexos biomoleculares mediados por IDP/IDR é descrito13. Essa abordagem é útil para estudar as interações proteína-proteína transitórias, como as que promovem a montagem de fibrilas amiloides a partir da α-sinucleína 14,15 ou a autoassociação de USF16, bem como para caracterizar interações proteína-proteína específicas, como entre proteínas sinalizadoras17. Um exemplo de PDI auto-associado é apresentado, onde interações inter e intramoleculares específicas resultam em estados preferencialmente compactados, bem como interações sítio-específicas que impulsionam a auto-associação.
O PRE surge da interação dipolar magnética de um núcleo a um centro paramagnético com um tensor g isotrópico, comumente fornecido na forma de um elétron não pareado em um grupo de nitróxidos ou como um átomo de metal paramagnético18 (Figura 1). Enquanto átomos com tensores g anisotrópicos também produzem um efeito PRE, a análise desses sistemas é mais difícil devido aos efeitos de confusão contribuídos pelos deslocamentos de pseudocontato (PCS) ou acoplamento dipolar residual (RDC)13,19. A força da interação entre um núcleo e o centro paramagnético é dependente da distância <r-6> entre os dois. Essa interação resulta em um aumento nas taxas de relaxação nuclear, o que causa um alargamento detectável da linha mesmo para interações de longo alcance (~10-35 Å), porque o momento magnético do elétron não pareado é muito forte20,21. A detecção de estados transitórios com o PRE é possível se as duas condições seguintes forem atendidas; (1) a interação transitória está em troca rápida na escala de tempo de RMN (o deslocamento químico observado é uma média ponderada pela população dos estados de troca); e (2) a distância núcleos/centro paramagnético é menor no estado transitoriamente povoado do que no estadomaior11. O PRE transversal é indicado Γ2 e, para fins práticos, é calculado a partir da diferença nas taxas de relaxação transversal de 1H entre uma amostra contendo um centro paramagnético e um controle diamagnético. Para um tratamento aprofundado da teoria da PRE e dos respectivos deslocamentos de pseudocontato em regimes de troca rápida e lenta, remete-se o leitor às revisões abrangentes de Clore e colaboradores 13,22. Aqui, considera-se apenas a situação em que 1H N-Γ2 está no regime de troca rápida, onde devido à dependência r-6 do PRE, a taxa de relaxamento observada está relacionada tanto com a distância a que o centro paramagnético se aproxima do núcleo quanto com a quantidade de tempo que ele gasta nessa conformação. Portanto, conformações transitórias que não envolvem uma abordagem próxima produzem um PRE pequeno, enquanto interações mais próximas, mesmo que de curta duração, produzirão um PRE maior.
Para IDPs, o PRE é usado para medir e diferenciar as interações que ocorrem dentro de uma única molécula (intramolecular) e entre moléculas separadas (intermolecular). Ao anexar um centro paramagnético a uma proteína de RMN visível (por exemplo, marcada com 15N) ou invisível de RMN (por exemplo, abundância natural de 14N), a fonte (inter ou intramolecular) do PRE pode ser determinada (Figura 2). A mutagênese sítio-dirigida que introduz um resíduo de cisteína é uma abordagem conveniente para anexar um centro paramagnético (spin-label) a uma proteína23. Vários tipos de moléculas têm sido propostos para uso como spin labels, incluindo quelantes de metais (à base de EDTA) e radicais livres (à base de nitróxido)24. Vários marcadores de spin de nitroóxido foram descritos e estão disponíveis com diferentes químicas reativas à cisteína, como metanetiossulfonato, maleimida e iodoacetamida25,26 (Figura 1). A flexibilidade inerente do tag ou do linker pode ser problemática para certas análises e, nessas situações, diferentes estratégias têm sido propostas para limitar o movimento do tag, como a adição de grupos químicos volumosos ou o uso de um segundo ligante para ancorar o tag à proteína (dois locais de fixação)27, 28º. Além disso, etiquetas comercialmente disponíveis podem conter proteínas diastereoméricas, mas geralmente isso não contribuirá para a PRE observada29. O uso do 3-Maleimido-PROXYL ligado a uma cisteína livre via química da maleimida é descrito por ser prontamente disponível, custo-efetivo, não reversível, e o agente redutor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) pode ser mantido na solução durante toda a reação de marcação. Como o 3-Maleimido-PROXYL possui um tensor g isotrópico, nenhum PCS ou RDCs é induzido, e as mesmas atribuições de deslocamento químico podem ser usadas tanto para as amostras paramagnéticas quanto diamagnéticas13.
O 1HN-T 2 é medido usando uma estratégia de dois pontos de tempo (T a, Tb) que já se mostrou tão precisa quanto coletar uma série completa de evolução consistindo de 8 a 12 pontos de tempo30. O primeiro ponto de tempo (T a) é definido tão próximo de zero quanto possível, e o comprimento ótimo do segundo ponto de tempo é dependente da magnitude do maior PRE esperado para uma dada amostra e pode ser estimado a partir de: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) onde R 2,dia representa o R 2 da amostra diamagnética13. Se a magnitude dos maiores PREs é desconhecida, definir T b para ~ uma vez o 1H T 2 da proteína é uma boa estimativa inicial e ainda mais otimizada ajustando T2 para melhorar o sinal ao ruído. Essa estratégia de medição de dois pontos reduz significativamente o tempo experimental necessário para medir PREs e permite tempo para mais médias de sinal, particularmente porque amostras relativamente diluídas são usadas para minimizar os efeitos de contatos não específicos entre moléculas. Uma sequência de pulso baseada em HSQC é usada para medir 1H N-T2 e foi descrita em detalhes em outra publicação30. Para melhorar a sensibilidade, os pulsos duros das transferências INEPT para frente e para trás podem ser substituídos por pulsos moldados; alternativamente, a sequência é prontamente convertida para uma leitura baseada em TROSY31. Uma vez que os IDPs tipicamente têm taxas de relaxamento transversal muito mais longas, resultando em larguras de linha mais estreitas (devido à desordem inerente) do que proteínas globulares de tamanho semelhante, longos tempos de aquisição na dimensão indireta podem ser usados para melhorar a resolução espectral e aliviar a limitação de dispersão de deslocamento químico inerente aos IDPs.
PRE é uma ferramenta útil para estudar interações proteína-proteína e proteína-ácido nucleico, particularmente interações que são transitórias ou pouco povoadas. Um protocolo detalhado para a preparação de uma amostra de RMN adequada para medir PREs, incluindo etapas para purificação de proteínas, marcação de spin direcionada ao local, configuração e calibração do programa de pulso, processamento e interpretação dos dados de RMN, é fornecido. Considerações experimentais importantes são observadas ao longo do tempo que podem afetar a qualidade dos dados e os resultados experimentais, incluindo a concentração da amostra, a seleção do spin-label e a remoção de componentes paramagnéticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Proteínas intrinsecamente desordenadas e regiões intrinsecamente desordenadas dentro das proteínas compõem uma grande e funcionalmente significativa parte do proteoma humano. A natureza altamente flexível dessas sequências permite que elas formem interações fracas, de longo alcance e transitórias com diversos parceiros biomoleculares. Interações específicas, mas de baixa afinidade, promovem ligação promíscua e permitem que um único segmento intrinsecamente desordenado interaja com uma infinidade de locais-alvo. Devido à natureza transitória dessas interações, elas podem ser difíceis de caracterizar por métodos de biologia estrutural que dependem de proteínas para formar uma única conformação predominante. A RMN de aumento por relaxação paramagnética é uma ferramenta útil para identificar e definir a base estrutural de interações fracas e transitórias. Um protocolo detalhado para o uso de aprimoramento de relaxamento paramagnético para caracterizar os complexos de encontro pouco povoados que se formam entre proteínas intrinsecamente desordenadas e sua proteína, ácido nucleico ou outros parceiros biomoleculares é descrito.

PREs 1 HN-Γ 2 intramolecularesforam registrados em um fragmento auto-associado, intrinsecamente desordenado (resíduos 171-264) derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR142 (Figura 3). Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação do rótulo de spin (por exemplo, resíduos 178 ou 260 na Figura 3) sejam significativamente ...

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Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Um protocolo para a aplicação de espectroscopia de RMN de realce por relaxação paramagnética para detectar interações inter e intramoleculares fracas e transitórias em proteínas intrinsecamente desordenadas é apresentado.

Aprimoramento do relaxamento paramagnético para detecção e caracterização de auto-associações de proteínas intrinsecamente desordenadas

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

A técnica de realce por relaxação paramagnética pode ser utilizada para caracterizar e medir distâncias intermoleculares e quantificar interações biomoleculares transitórias e/ou pouco povoadas. Aqui, aplicamos essa técnica para capturar interações que precedem a condensação de proteínas. A sensibilidade dos PREs permite a identificação, detecção e quantificação de resolução atômica de estados dinâmicos que permanecem invisíveis e inacessíveis a outras técnicas de RMN.As principais etapas deste protocolo incluem a remoção da etiqueta de spin de nitroóxido não conjugado e a análise cuidadosa dos espectros para medir com precisão a altura do pico. Além disso, deve-se ter cautela durante a instalação do experimento de RMN e calibração do pulso. Para começar, adicione 3-maleimido-PROXYL de uma solução estoque a 20 vezes o excesso molar da proteína marcada isotopicamente 15N de interesse.Incubar durante a noite à temperatura ambiente ou quatro graus Celsius protegido da luz e do oxigénio e com balanço suave ou nutação. No dia seguinte, remova o rótulo de spin livre não reagido para evitar PRE de solvente não específico usando diálise extensiva da amostra de proteína ou filtração em gel. Em seguida, use o reagente de Ellman para quantificar grupos sulfidrila livres na solução.Meça a absorbância usando um leitor de microplacas e construa a curva padrão. Para medir a PRE intramolecular, preparar proteína marcada com spin isotopicamente enriquecida com 15N para uma concentração de pelo menos 100 micromolares, mas não superior a 300 micromolares, em um tampão adequado para RMN. Em seguida, usando uma pipeta de vidro de haste longa ou micropipeta, transfira a amostra de RMN para um tubo de RMN de cinco milímetros apropriado para uso em ímãs de alto campo.Coloque a amostra no ímã. Bloqueie o sinal de deutério usando o comando lock e sintonize e combine o canal de prótons de acordo com os protocolos da instalação. Em seguida, ajuste os calços usando a sub-rotina do calço superior para otimizar a supressão do sinal do solvente.Em seguida, calibre o pulso de prótons usando o programa P-OPT. Em seguida, calibre o pulso de 15N contra uma amostra padrão. Determine a atenuação correta para pulsos moldados usando a sub-rotina da ferramenta de forma.Em seguida, abra o arquivo de forma de pulso apropriado clicando no ícone de pasta. Os pulsos em forma são encontrados na seção de parâmetros de pulso dos parâmetros de aquisição. Depois de carregar o arquivo de definição de pulso, clique em Analisar Forma de Onda, seguido por Integrar Forma.Insira o próton calibrado pulso duro de 90 graus, o comprimento de pulso de forma desejado e a rotação. Em seguida, calcule o nível de potência do pulso em forma adicionando a mudança do nível de potência à atenuação para o pulso calibrado de 90 graus. Registre um HSQC de próton 15N padrão para otimizar a largura de varredura, a frequência da portadora e verificar a supressão de água.Finalmente, ajuste a largura da varredura e o número de incrementos de dimensão indireta usando os comandos SW e TD ou diretamente nas caixas de diálogo apropriadas. Calibre os pulsos em forma conforme demonstrado anteriormente. Em seguida, insira os comprimentos de pulso calibrados na seção de parâmetros de pulso na guia Parâmetros de aquisição.Para medir o próton amida T2 usando a abordagem de dois pontos de atraso de tempo, defina os atrasos de tempo editando o arquivo de lista VD. O primeiro atraso é definido como 0,01 milissegundos. Usando a relação com o PRE máximo esperado, escolha o segundo atraso.Em seguida, determine um valor adequado comparando os primeiros incrementos do primeiro e segundo espectros de atraso e ajustando o segundo atraso de tal forma que o sinal decaia para entre 40 a 50% do seu valor inicial. Determine o número de pontos complexos a serem registrados e o número de varreduras para obter uma média de sinal suficiente. Em seguida, use o comando EXPT para calcular o tempo de experimento e iniciar o experimento com o comando ZG. Depois de dissolver o ascorbato de sódio no tampão de RMN, ajuste o pH para corresponder ao do tampão de RMN original.Em seguida, adicione o ácido ascórbico ao tubo de RMN em um excesso molar de 10 vezes sobre a concentração do rótulo de spin, colocando uma gotícula abaixo da borda do tubo. Tampe o tubo e inverta cuidadosamente para misturar. Gire a 200 a 400 G por 10 a 20 segundos em uma centrífuga manual para fixar a amostra no fundo do tubo.Depois de envolver o tubo em papel alumínio, deixe a reação prosseguir por pelo menos três horas. Em seguida, registre o próton amida T2 na amostra diamagnética usando os mesmos parâmetros usados para a amostra paramagnética. Os PREs gama de prótons amida intramoleculares foram registrados em um fragmento auto-associado intrinsecamente desordenado derivado do domínio de baixa complexidade da proteína ligadora de RNA EWSR1.Espera-se que os resíduos em estreita proximidade sequencial com o ponto de fixação da etiqueta de spin sejam significativamente ampliados e não sejam detectáveis no espectro. Os resíduos que foram espaçados sequencialmente a partir do ponto de fixação, mas mostraram gama aumentada, estavam espacialmente próximos ao rótulo de spin. No caso de proteínas intrinsecamente desordenadas, o registro e a análise de purês produzirão informações sobre contatos intramoleculares e superfícies de interação transitórias.A combinação de medições PRE com outros métodos biofísicos, como espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de exclusão de tamanho, ultracentrifugação analítica e métodos computacionais, pode fornecer insights mais profundos. A medição do PRE auxilia na caracterização de um estado transitório escassamente povoado. Esta abordagem pode ser expandida para caracterizar interações importantes para uma miríade de processos biológicos, tais como reconhecimento molecular, seleção conformacional alostérica e processos de montagem, incluindo a montagem de organelas sem membrana via separação de fases.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear para a identificação de múltiplas fosfolarização de intrinsecamente desordenados Proteínas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Bioquímica

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso de ressonância paramagnética electrónica em amostras biológicas em temperatura ambiente e 77 K

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Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

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Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterização de agregados proteicos individuais por Nanoespectroscopia infravermelha e microscopia de força atômica

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Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b recombinante totalmente processado: Isolando e caracterizando a proteína farnesylated e metilada

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Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

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Aspectos práticos da preparação e configuração da amostra de 1H R1ρ Experimentos de dispersão de relaxamento do RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...