Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Мы благодарим докторов Джинфа Ин и Кристин Кано за полезные дискуссии и техническую помощь. DSL является стипендиатом St. Baldrick's Scholar и выражает признательность за поддержку Фонда St. Baldrick's Foundation (634706). Эта работа была частично поддержана Фондом Уэлча (AQ-2001-20190330) для DSL, Фондом Макса и Минни Томерлин Фолькер (грант Фонда Волкера для молодых исследователей для DSL), стартовыми фондами UTHSA для DSL и стипендией Грихи для выпускников в области детского здоровья для CNJ. Эта работа основана на исследованиях, проведенных в Центре структурной биологии, входящем в состав Институциональных исследовательских центров Научного центра здоровья Техасского университета в Сан-Антонио, при поддержке Офиса вице-президента по исследованиям и Общего ресурса по разработке лекарств и структурной биологии Онкологического центра Мэйса (NIH P30 CA054174).

Общие требования к протоколу: оборудование для очистки белков, УФ-ВИД спектрометр, высокопольный ЯМР-спектрометр и операционное программное обеспечение, в том числе программное обеспечение для анализа постобработки; NMRPipe32, Sparky 33 (или CCPN Analysis 34, или NMRViewJ35).<sup class=...

Представлен метод характеристики переходных взаимодействий, существующих в малых популяциях между внутренне неупорядоченными белками и различными партнерами связывания с использованием PRE. В показанном примере белок является самоассоциативным, и, таким образом, PRE может возникать в ...

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Внутренне неупорядоченные белки и внутренне неупорядоченные участки внутри белков составляют большую и функционально значимую часть протеома человека. Высокая гибкость этих последовательностей позволяет им формировать слабые, дальние и переходные взаимодействия с различными биомолекулярными партнерами. Специфические, но низкоаффинные взаимодействия способствуют беспорядочному связыванию и позволяют одному внутренне неупорядоченному сегменту взаимодействовать с множеством целевых сайтов. Из-за переходного характера этих взаимодействий их может быть трудно охарактеризовать методами структурной биологии, которые полагаются на белки для формирования единой, преобладающей конформации. ЯМР с усилением парамагнитной релаксации является полезным инструментом для идентификации и определения структурных основ слабых и переходных взаимодействий. Описан подробный протокол использования усиления парамагнитной релаксации для характеристики малонаселенных комплексов встреч, которые образуются между внутренне неупорядоченными белками и их белком, нуклеиновой кислотой или другими биомолекулярными партнерами.

Внутримолекулярные 1H N-Γ2 PRE регистрировали на самоассоциирующем, внутренне неупорядоченном фрагменте (остатки 171-264), полученном из домена низкой сложности РНК-связывающего белка EWSR142 (рис. 3). Ожидается, что остатки, находящиеся в непос?...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Представлен протокол применения ЯМР-спектроскопии с усилением парамагнитной релаксации для выявления слабых и переходных меж- и внутримолекулярных взаимодействий в внутренне неупорядоченных белках.

Усиление парамагнитной релаксации для обнаружения и характеристики самоассоциаций внутренне неупорядоченных белков

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Метод усиления парамагнитной релаксации может быть использован для характеризации и измерения межмолекулярных расстояний и количественной оценки переходных и/или малонаселенных биомолекулярных взаимодействий. Здесь мы применили этот метод для захвата взаимодействий, которые предшествуют конденсации белка. Чувствительность PRE позволяет идентифицировать, обнаруживать и количественно определять динамическое состояние с атомарным разрешением, которое остается невидимым и недоступным для других методов ЯМР.Ключевые шаги в этом протоколе включают удаление несопряженной спиновой метки нитроксида и тщательный анализ спектров для точного измерения пиковой высоты. Кроме того, необходимо соблюдать осторожность при постановке эксперимента ЯМР и калибровке импульса. Для начала добавьте 3-малеимидо-ПРОКСИЛ из исходного раствора с 20-кратным молярным превышением интересующего изотопно меченого белка 15N.Инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре или четырех градусах Цельсия, защищенные от света и кислорода и с легким покачиванием или нутацией. На следующий день удалите непрореагировавшую этикетку свободного отжима, чтобы предотвратить попадание неспецифического растворителя PRE с помощью либо обширного диализа образца белка, либо с помощью гелевой фильтрации. Затем используйте реактив Эллмана для количественного определения свободных сульфгидрильных групп в растворе.Измерьте абсорбцию с помощью микропланшетного ридера и постройте стандартную кривую. Для измерения внутримолекулярного PRE готовят изотопно обогащенный спин-меченый белок 15N до концентрации не менее 100 мкмольных, но не более 300 мкмольных, в буфере, подходящем для ЯМР. Затем с помощью стеклянной пипетки или микропипетки с длинным стержнем перенесите образец ЯМР в пятимиллиметровую ЯМР-трубку, подходящую для использования в высокопольных магнитах.Поместите образец в магнит. Зафиксируйте дейтериевый сигнал с помощью команды lock, настройте и сопоставьте протонный канал в соответствии с протоколами объекта. Затем отрегулируйте регулировочные шайбы с помощью подпрограммы top spat, чтобы оптимизировать подавление сигнала растворителя.Далее откалибруйте протонный импульс с помощью программы P-OPT. Затем откалибруйте импульс 15Н по стандартному образцу. Определите правильное затухание для сформированных импульсов с помощью подпрограммы инструмента «Форма».Затем откройте соответствующий файл фигуры импульса, щелкнув значок папки. Сформированные импульсы находятся в разделе параметров импульсов параметров сбора. После загрузки файла определения импульса нажмите кнопку Analyze Waveform (Анализ формы сигнала), а затем Integrate Shape (Интегрировать форму).Введите откалиброванный жесткий импульс протона под углом 90 градусов, желаемую форму длины импульса и вращение. Затем рассчитайте уровень мощности сформированного импульса, добавив изменение уровня мощности к затуханию для откалиброванного импульса под углом 90 градусов. Запишите стандартный протонный 15N HSQC для оптимизации ширины развертки, несущей частоты и проверки водоподавления.Наконец, отрегулируйте ширину сдвига и количество косвенных приращений размеров с помощью команд SW и TD или непосредственно в соответствующих диалоговых окнах. Откалибруйте сформированные импульсы, как показано выше. Затем введите откалиброванную длину импульса в разделе «Параметры импульса» на вкладке «Параметры сбора».Чтобы измерить амидный протон Т2 с помощью подхода с двумя точками задержки времени, задайте временные задержки, отредактировав файл списка VD. Первая задержка устанавливается равной 0,01 миллисекунды. Используя отношение к ожидаемому максимальному PRE, выберите вторую задержку.Затем определите подходящее значение, сравнив первые приращения первого и второго спектров задержки и отрегулировав вторую задержку таким образом, чтобы сигнал затухал до 40-50% от его начального значения. Определите количество сложных точек для записи и количество сканирований для достаточного усреднения сигнала. Затем используйте команду EXPT для вычисления времени эксперимента и запустите эксперимент с помощью команды ZG. После растворения аскорбата натрия в буфере ЯМР отрегулируйте рН в соответствии с исходным буфером ЯМР.Затем добавьте аскорбиновую кислоту в ЯМР-пробирку с 10-кратным молярным превышением концентрации спиновой метки, поместив каплю ниже края пробирки. Закройте тюбик крышкой и осторожно переверните, чтобы перемешать. Вращайте при 200–400 G в течение 10–20 секунд в центрифуге с ручным приводом, чтобы образец оседал на дне пробирки.Завернув пробирку в фольгу, дайте реакции протекать не менее трех часов. Затем запишите амидный протон Т2 на диамагнитном образце, используя те же параметры, что и для парамагнитного образца. Внутримолекулярные амидные протонные гамма-ПЭ регистрировались на самоассоциативном внутренне неупорядоченном фрагменте, полученном из домена низкой сложности РНК-связывающего белка EWSR1.Ожидается, что остатки, находящиеся в непосредственной последовательной близости от точки прикрепления спиновой метки, будут значительно расширены и не будут обнаруживаться в спектре. Остатки, которые были последовательно удалены от точки присоединения, но показали усиленную гамму, были пространственно близки к спиновой метке. В случае внутренне неупорядоченных белков регистрация и анализ пюре даст информацию о внутримолекулярных контактах и поверхностях переходных взаимодействий.Сочетание измерений PRE с другими биофизическими методами, такими как динамическое рассеяние света, эксклюзионная хроматография, аналитическое ультрацентрифугирование и вычислительные методы, может обеспечить более глубокое понимание. Измерение PRE помогает охарактеризовать переходное малонаселенное состояние. Этот подход может быть расширен для характеристики взаимодействий, важных для множества биологических процессов, таких как молекулярное распознавание, аллостерический конформационный отбор и процессы сборки, включая сборку безмембранных органелл с помощью фазового разделения.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Использование электронного парамагнитного резонанса в биологических образцах при окружающей температуре и 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Люминесцентные серебряные пятная белков в полиакриламидных гелей

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Выражение, очищение, кристаллизация и ферментные анализы Fumarylacetoacetate Hydrolase Домен-содержащих белков

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Полностью обработанный рекомбинантный KRAS4b: изолирование и характеристика фарнезилатного и метилового белка

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Характеристика клеточных белков с в-клеточной быстрой фотохимической окисления белков

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Поперечное секционирование зрелого риса (Oryza sativa L.) Ядра для сканирующей электронной микроскопии с использованием наконечников пипеток в качестве поддержки иммобилизации

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 15 N CPMG Релаксационная дисперсия для исследования конформационной динамики белка на шкале времени мкс-мс

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Практические аспекты пробоподготовки и настройки экспериментовпо релаксационной дисперсии РНК 1 H R1ρ

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...