Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
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Agradecemos a las Dras. Jinfa Ying y Kristin Cano por sus útiles discusiones y asistencia técnica. DSL es un St. Baldrick's Scholar y agradece el apoyo de la Fundación St. Baldrick's (634706). Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Welch (AQ-2001-20190330) para DSL, el Fondo Max y Minnie Tomerlin Voelcker (Beca para Jóvenes Investigadores de la Fundación Voelcker para DSL), los Fondos de Puesta en Marcha de UTHSA para DSL y una Beca de Posgrado Greehey en Salud Infantil para CNJ. Este trabajo se basa en la investigación realizada en las Instalaciones Centrales de Biología Estructural, parte de los Núcleos de Investigación Institucional en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, con el apoyo de la Oficina del Vicepresidente de Investigación y el Recurso Compartido de Descubrimiento de Fármacos y Biología Estructural del Centro Oncológico Mays (NIH P30 CA054174).

Requisitos generales para el protocolo: instalaciones de purificación de proteínas, espectrómetro UV-Vis, espectrómetro de RMN de alto campo y software operativo, software de análisis de posprocesamiento que incluye; NMRPipe32, Sparky33, (o CCPN Analysis 34, o NMRViewJ35).
1. Expresión recombinante y purificación de una proteína para mediciones de PRE
<ol><li>Diseñe una construcción de e...

Se ha presentado un método para caracterizar las interacciones transitorias que existen en poblaciones bajas entre proteínas intrínsecamente desordenadas y varios socios de unión utilizando PRE. En el ejemplo mostrado, la proteína se asocia a sí misma y, por lo tanto, el PRE puede surgir de una combinación de interacciones intermoleculares e intramoleculares. Este método se extiende fácilmente a muestras heterogéneas en las que se pueden caracterizar las interacciones entre dos proteínas diferentes. La informa...

El trastorno intrínseco (DI) describe proteínas (IDP) o regiones dentro de las proteínas (IDR) que no se pliegan espontáneamente en estructuras secundarias o terciarias estables, sino que son biológicamente activas. En general, la función de los IDP/IDR es facilitar interacciones específicas pero reversibles con biomoléculas en condiciones fisiológicas1. Por lo tanto, las IDP y las IDR están involucradas en una variedad de funciones celulares, incluido el reclutamiento, la organización y la estabilización de complejos multiproteicos, por ejemplo, el ensamblaje y la actividad del espliceosoma2, el reclutamiento y la organización de componentes en los sitios de daño del ADN3, la organización y estabilización del reclutamiento de complejos de transcripción4 o del remodelador de cromatina BAF5. Además, los IDP se encuentran en nexos de señalización donde su promiscuidad para diferentes socios de unión les permite mediar en la transferencia de información a través de redes de proteínas celulares6. Trabajos recientes también han revelado una propensión de las regiones IDR a autoasociarse formando condensados biomoleculares a través del proceso de separación de fases líquido-líquido7. Muchas de las funciones mencionadas anteriormente que involucran el DI también se cree que involucran algún aspecto de la formación de condensado8. A pesar de la importancia de la identificación para el ensamblaje de complejos biomoleculares, la estabilización, el andamiaje y la transducción de señales, los detalles atómicos de sus interacciones específicas son difíciles de identificar, ya que las IDP y las IDR no suelen ser susceptibles de investigaciones estructurales mediante cristalografía de rayos X o microscopía electrónica criogénica.
La resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica ideal para investigar el DI, ya que no depende de la presencia de conjuntos estructurales rígidos u homogéneos, sino que informa sobre el entorno local inmediato de los núcleos individuales. La frecuencia de resonancia, o cambio químico, de un núcleo en una molécula dada está influenciada por campos magnéticos débiles inducidos por la distribución electrónica local, que a su vez depende de las longitudes de enlace, los ángulos, la proximidad de otros núcleos, las interacciones con los socios de unión yotros factores. Por lo tanto, cada núcleo actúa como una sonda estructural única y específica del sitio sensible a los cambios en su entorno químico local. A pesar de estas ventajas, la RMN es una técnica a granel, y el cambio químico observado es el promedio de todos los ambientes muestreados por un núcleo en particular. Se han desarrollado una serie de técnicas de RMN, muchas de las cuales se describen en este número, para recuperar información estructural, dinámica y cinética sobre conformaciones biomoleculares de alta energía y poco pobladas contenidas en el desplazamiento químico promedio10,11. Aunque transitoriamente poblados, la identificación y cuantificación de estos estados son importantes para determinar los detalles de los mecanismos funcionales12. Por ejemplo, en el caso de IDPs e IDRs, el conjunto conformacional puede estar sesgado para muestrear preferentemente conformaciones que son productivas para la formación de complejos de encuentro con compañeros de unión fisiológicos. La detección de estos estados, así como la identificación de las interacciones y dinámicas inter e intramoleculares específicas del residuo, son importantes para determinar los mecanismos estructurales subyacentes de la función de las proteínas y la formación de complejos.
Se describe un protocolo para el uso de la RMN de mejora de la relajación paramagnética (PRE) para investigar estados transitorios poco poblados importantes para la formación de complejos biomoleculares mediados por IDP/IDR13. Este enfoque es útil para estudiar las interacciones transitorias proteína-proteína, como las que promueven el ensamblaje de fibrillas amiloides a partir de la α-sinucleína 14,15 o la autoasociación de FUS16, así como para caracterizar interacciones proteína-proteínas específicas, como entre proteínas de señalización17. Se presenta un ejemplo de un IDP autoasociado, en el que las interacciones inter e intramoleculares específicas dan lugar a estados preferentemente compactados, así como a interacciones específicas del sitio que impulsan la autoasociación.
El PRE surge de la interacción dipolar magnética de un núcleo a un centro paramagnético con un tensor g isótropo, comúnmente suministrado en forma de un electrón desapareado en un grupo nitrógeno o como un átomo metálico paramagnético18 (Figura 1). Mientras que los átomos con tensores g anisotrópicos también producen un efecto PRE, el análisis de estos sistemas es más difícil debido a los efectos de confusión aportados por los desplazamientos de pseudocontacto (PCS) o el acoplamiento dipolar residual (RDC)13,19. La fuerza de la interacción entre un núcleo y el centro paramagnético depende de la distancia <r-6> entre los dos. Esta interacción da como resultado un aumento en las tasas de relajación nuclear, lo que provoca un ensanchamiento de la línea detectable incluso para interacciones de largo alcance (~10-35 Å), porque el momento magnético del electrón desapareado es muy fuerte20,21. La detección de estados transitorios con el PRE es posible si se cumplen las dos condiciones siguientes; (1) la interacción transitoria está en intercambio rápido en la escala de tiempo de RMN (el desplazamiento químico observado es un promedio ponderado por población de los estados de intercambio); y (2) la distancia entre los núcleos y el centro paramagnético es más corta en el estado transitoriamente poblado que en el estado principal11. El PRE transversal se denota Γ2 y, a efectos prácticos, se calcula a partir de la diferencia en las tasas de relajación transversal de 1H entre una muestra que contiene un centro paramagnético y un control diamagnético. Para un tratamiento en profundidad de la teoría del PRE y los cambios de pseudocontacto relacionados en regímenes de intercambio rápido y lento, se remite al lector a las revisiones exhaustivas de Clore y colaboradores13,22. Aquí, solo se considera la situación en la que 1H N-Γ 2 se encuentra en el régimen de intercambio rápido, donde debido a la dependencia r-6 del PRE, la tasa de relajación observada está relacionada tanto con la distancia a la que el centro paramagnético se acerca al núcleo como con la cantidad de tiempo que pasa en esa conformación. Por lo tanto, las conformaciones transitorias que no implican un acercamiento cercano producen un PRE pequeño, mientras que las interacciones más cercanas, incluso si son de corta duración, producirán un PRE más grande.
En el caso de los PDI, el PRE se utiliza para medir y diferenciar las interacciones que se producen dentro de una sola molécula (intramolecular) y entre moléculas separadas (intermolecular). Al unir un centro paramagnético a una proteína visible de RMN (p. ej., marcada con 15N) o invisible de RMN (p. ej., abundancia natural de 14N), se puede determinar la fuente (inter o intramolecular) del PRE (Figura 2). La mutagénesis dirigida al sitio que introduce un residuo de cisteína es un enfoque conveniente para unir un centro paramagnético (etiqueta de espín) a una proteína23. Se han propuesto varios tipos de moléculas para su uso como etiquetas de espín, incluyendo la quelación de metales (basada en EDTA) y la de radicales libres (basada en nitrógeno)24. Se han descrito varias etiquetas de centrifugado de nitrógeno y están disponibles con diferentes químicas reactivas a la cisteína, como metanetiosulfonato, maleimida y yodoacetamida25,26 (Figura 1). La flexibilidad inherente de la etiqueta o del enlazador puede ser problemática para ciertos análisis y, en estas situaciones, se han propuesto diferentes estrategias para limitar el movimiento de la marca, como la adición de grupos químicos voluminosos o el uso de un segundo enlazador para anclar la etiqueta a la proteína (unión de dos sitios)27, Artículo 28. Además, las etiquetas disponibles comercialmente pueden contener proteínas diastereoméricas, pero generalmente esto no contribuirá a la PRE29 observada. Se describe el uso del 3-Maleimido-PROXYL unido a una cisteína libre a través de la química de la maleimida, ya que está fácilmente disponible, es rentable, no reversible y el agente reductor tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) se puede mantener en la solución durante toda la reacción de marcado. Dado que el 3-maleimido-proxyl tiene un tensor g isotrópico, no se inducen PCS ni RDC, y se pueden utilizar las mismas asignaciones de desplazamiento químico tanto para las muestras paramagnéticas como para las diamagnéticas13.
El 1HN-T 2 se mide utilizando una estrategia de dos puntos de tiempo (T a, Tb) que previamente ha demostrado ser tan precisa como la recopilación de una serie de evolución completa que consta de 8 a 12 puntos de tiempo30. El primer punto de tiempo (T a) se establece lo más cerca posible de cero, y la longitud óptima del segundo punto de tiempo depende de la magnitud del mayor PRE esperado para una muestra dada y se puede estimar a partir de: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) donde R 2,dia representa el R 2 de la muestra diamagnética13. Si se desconoce la magnitud de los PRE más grandes, establecer T b en ~ una vez 1 HT 2 de la proteína es una buena estimación inicial y optimizarse aún más ajustando T2 para mejorar la señal a ruido. Esta estrategia de medición de dos puntos reduce significativamente el tiempo experimental requerido para medir los PRE y permite tiempo para un mayor promedio de señales, particularmente porque se utilizan muestras relativamente diluidas para minimizar los efectos de los contactos no específicos entre moléculas. Para medir 1H,N-T, 2 se utiliza una secuencia de impulsos basada en HSQC y se ha descrito en detalle en otro lugar30. Para mejorar la sensibilidad, los pulsos duros de las transferencias INEPT hacia adelante y hacia atrás pueden reemplazarse con pulsos con forma; alternativamente, la secuencia se convierte fácilmente en una lectura31 basada en TROSY. Dado que las IDP suelen tener tasas de relajación transversal mucho más largas, lo que da lugar a anchos de línea más estrechos (debido al desorden inherente) que las proteínas globulares de tamaño similar, se pueden utilizar tiempos de adquisición largos en la dimensión indirecta para mejorar la resolución espectral y aliviar la limitación de dispersión por desplazamiento químico inherente a las IDP.
PRE es una herramienta útil para estudiar las interacciones proteína-proteína y proteína-ácido nucleico, en particular las interacciones que son transitorias o poco pobladas. Se proporciona un protocolo detallado para la preparación de una muestra de RMN adecuada para medir los PRE, incluidos los pasos para la purificación de proteínas, el etiquetado de espín dirigido al sitio, la configuración y calibración del programa de pulsos, el procesamiento y la interpretación de los datos de RMN. A lo largo de todo el estudio se señalan importantes consideraciones experimentales que pueden afectar a la calidad de los datos y al resultado experimental, como la concentración de la muestra, la selección de la etiqueta de espín y la eliminación de los componentes paramagnéticos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Las proteínas intrínsecamente desordenadas y las regiones intrínsecamente desordenadas dentro de las proteínas constituyen una parte grande y funcionalmente significativa del proteoma humano. La naturaleza altamente flexible de estas secuencias les permite formar interacciones débiles, de largo alcance y transitorias con diversos socios biomoleculares. Las interacciones específicas pero de baja afinidad promueven la unión promiscua y permiten que un solo segmento intrínsecamente desordenado interactúe con una multitud de sitios diana. Debido a la naturaleza transitoria de estas interacciones, pueden ser difíciles de caracterizar mediante métodos de biología estructural que se basan en proteínas para formar una conformación única y predominante. La RMN de mejora de la relajación paramagnética es una herramienta útil para identificar y definir la base estructural de las interacciones débiles y transitorias. Se describe un protocolo detallado para el uso de la mejora de la relajación paramagnética para caracterizar los complejos de encuentro poco poblados que se forman entre las proteínas intrínsecamente desordenadas y sus proteínas, ácidos nucleicos u otros socios biomoleculares.

Se registraron PREs intramoleculares 1HN-Γ 2 en un fragmento autoasociado, intrínsecamente desordenado (residuos 171-264) derivado del dominio de baja complejidad de la proteína de unión al ARN EWSR142 (Figura 3). Se espera que los residuos en estrecha proximidad secuencial al punto de fijación de la etiqueta giratoria (por ejemplo, el residuo 178 o 260 en la Figura 3) se amplíen significati...

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Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Se presenta un protocolo para la aplicación de espectroscopía de RMN de mejora de la relajación paramagnética para detectar interacciones inter e intramoleculares débiles y transitorias en proteínas intrínsecamente desordenadas.

Mejora de la relajación paramagnética para detectar y caracterizar las autoasociaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

La técnica de mejora de la relajación paramagnética se puede utilizar para caracterizar y medir distancias intermoleculares y cuantificar interacciones biomoleculares transitorias y/o poco pobladas. Aquí, hemos aplicado esta técnica para capturar las interacciones que preceden a la condensación de proteínas. La sensibilidad de los PRE permite la identificación, detección y cuantificación de la resolución atómica de estados dinámicos que permanecen invisibles e inaccesibles para otras técnicas de RMN.Los pasos clave de este protocolo incluyen la eliminación de la etiqueta de espín de nitrógeno no conjugado y el análisis cuidadoso de los espectros para medir con precisión la altura del pico. Además, se debe tener precaución durante la configuración del experimento de RMN y la calibración del pulso. Para comenzar, agregue 3-maleimido-PROXYL de una solución madre a 20 veces el exceso molar de la proteína de interés marcada isotópicamente con 15N.Incubar durante la noche a temperatura ambiente o cuatro grados centígrados, protegido de la luz y el oxígeno y con un suave balanceo o nutación. Al día siguiente, retire la etiqueta de giro libre sin reacción para evitar la aparición de disolventes no específicos mediante diálisis extensa de la muestra de proteínas o mediante filtración en gel. A continuación, utilice el reactivo de Ellman para cuantificar los grupos sulfhidrilo libres en la solución.Mida la absorbancia con un lector de microplacas y construya la curva estándar. Para medir el PRE intramolecular, prepare una proteína marcada con espín enriquecida isotópicamente con 15N a una concentración de al menos 100 micromolares, pero no más de 300 micromolares, en un tampón adecuado para RMN. Luego, con una pipeta de vidrio de tallo largo o una micropipeta, transfiera la muestra de RMN a un tubo de RMN de cinco milímetros apropiado para su uso en imanes de alto campo.Coloque la muestra en el imán. Bloquee la señal de deuterio usando el comando de bloqueo y sintonice y haga coincidir el canal de protones de acuerdo con los protocolos de la instalación. A continuación, ajuste las cuñas utilizando la subrutina de cuñas superior para optimizar la supresión de la señal del disolvente.A continuación, calibra el pulso de protones utilizando el programa P-OPT. A continuación, calibre el pulso de 15N con una muestra estándar. Determine la atenuación correcta para pulsos con forma utilizando la subrutina de la herramienta de forma.A continuación, abra el archivo de forma de pulso correspondiente haciendo clic en el icono de carpeta. Los pulsos con forma se encuentran en la sección de parámetros de pulso de los parámetros de adquisición. Después de cargar el archivo de definición de pulso, haga clic en Analizar forma de onda, seguido de Integrar forma.Ingrese el pulso duro de 90 grados del protón calibrado, la forma deseada, la longitud del pulso y la rotación. A continuación, calcule el nivel de potencia del pulso con forma sumando el cambio de nivel de potencia a la atenuación del pulso calibrado de 90 grados. Registre un HSQC de protón 15N estándar para optimizar el ancho de barrido, la frecuencia portadora y verificar la supresión de agua.Por último, ajuste la anchura de barrido y el número de incrementos de cota indirectos mediante los comandos SW y TD o directamente en los cuadros de diálogo correspondientes. Calibra los pulsos con forma como se ha demostrado anteriormente. A continuación, introduzca las longitudes de pulso calibradas en la sección de parámetros de pulso de la pestaña Parámetros de adquisición.Para medir el protón amida T2 utilizando el enfoque de dos puntos de retardo de tiempo, establezca los retardos de tiempo editando el archivo de lista VD. El primer retardo se establece en 0,01 milisegundos. Utilizando la relación con el PRE máximo esperado, elija el segundo retraso.A continuación, determine un valor adecuado comparando los primeros incrementos del primer y segundo espectros de retardo y ajustando el segundo retardo de modo que la señal decaiga entre el 40 y el 50% de su valor inicial. Determine el número de puntos complejos que se van a registrar y el número de escaneos para obtener un promedio de señal suficiente. A continuación, utilice el comando EXPT para calcular el tiempo del experimento e inicie el experimento con el comando ZG. Después de disolver el ascorbato de sodio en el tampón de RMN, ajuste el pH para que coincida con el del tampón de RMN original.A continuación, agregue el ácido ascórbico al tubo de RMN con un exceso de 10 veces molar sobre la concentración de la etiqueta de centrifugado colocando una gota debajo del borde del tubo. Tape el tubo e inviértalo con cuidado para mezclar. Girar a 200 a 400 G durante 10 a 20 segundos en una centrífuga manual para asentar la muestra en el fondo del tubo.Después de envolver el tubo en papel de aluminio, deje que la reacción continúe durante al menos tres horas. A continuación, registre el protón amida T2 en la muestra diamagnética utilizando los mismos parámetros utilizados para la muestra paramagnética. Se registraron PREs de protones de amida intramoleculares en un fragmento intrínsecamente desordenado autoasociado derivado del dominio de baja complejidad de la proteína de unión al ARN EWSR1.Se espera que los residuos en estrecha proximidad secuencial al punto de fijación de la etiqueta giratoria se amplíen significativamente y no sean detectables en el espectro. Los residuos que estaban espaciados secuencialmente desde el punto de unión, pero que mostraban una gamma mejorada, estaban espacialmente cerca de la etiqueta de espín. En el caso de proteínas intrínsecamente desordenadas, el registro y análisis de los purés proporcionará información sobre los contactos intramoleculares y las superficies de interacción transitorias.La combinación de las mediciones de PRE con otros métodos biofísicos, como la dispersión dinámica de la luz, la cromatografía de exclusión por tamaño, la ultracentrifugación analítica y los métodos computacionales, puede proporcionar una visión más profunda. La medición de PRE ayuda a caracterizar el estado transitorio escasamente poblado. Este enfoque podría ampliarse para caracterizar interacciones importantes para una miríada de procesos biológicos, como el reconocimiento molecular, la selección conformacional alostérica y los procesos de ensamblaje, incluido el ensamblaje de orgánulos sin membrana a través de la separación de fases.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Nuclear espectroscopía de resonancia magnética para la identificación de múltiples fosforilaciones de proteínas intrínsecamente desordenadas

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Investigación

Bioquímica

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Uso de resonancia paramagnética electrónica en muestras biológicas a temperatura ambiente y 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Tinción fluorescente de plata de proteínas en geles de poliacrilamida

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Expresión, purificación, cristalización y ensayos enzimáticos de proteínas que contienen el dominio de la hidrolasa fumarilacetoacetato

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caracterización de agregados de proteínas individuales por nanoespectroscopia infrarroja y microscopía de fuerza atómica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

KRAS4b recombinante totalmente procesado: Aislamiento y caracterización de la proteína farnesilada y metilada

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterización de proteínas celulares con oxidación fotoquímica rápida en las células de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

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Seccionamiento transversal de arroz maduro (Oryza sativa L.) Núcleos para imágenes de microscopía electrónica de barrido utilizando puntas de pipeta como soporte de inmovilización

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15. N CPMG Dispersión De Relajación Para La Investigación De La Dinámica Conformacional De Proteínas En La Escala De Tiempo μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Aspectos prácticos de la preparación de muestras y la configuración de 1H R1ρ Experimentos de dispersión de relajación de ARN

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...