Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Vi tackar Drs. Jinfa Ying och Kristin Cano för hjälpsamma diskussioner och teknisk hjälp. DSL är en St. Baldrick's Scholar och erkänner stödet från St. Baldrick's Foundation (634706). Detta arbete stöddes delvis av Welch Foundation (AQ-2001-20190330) till DSL, Max och Minnie Tomerlin Voelcker Fund (Voelcker Foundation Young Investigator Grant till DSL), UTHSA Start-Up Funds till DSL och ett Greehey Graduate Fellowship in Children's Health till CNJ. Detta arbete bygger på forskning som bedrivs i strukturbiologins kärnfaciliteter, en del av de institutionella forskningskärnorna vid University of Texas Health Science Center i San Antonio med stöd av kontoret för vice president för forskning och Mays Cancer Center Drug Discovery and Structural Biology Shared Resource (NIH P30 CA054174).

Allmänna krav för protokollet: proteinreningsanläggningar, UV-Vis-spektrometer, NMR-spektrometer med högt fält och operativsystem, programvara för efterbehandlingsanalys inklusive; NMRPipe32, Sparky 33, (eller CCPN-analys34 eller NMRViewJ35).
1. Rekombinant uttryck och rening av ett protein för PRE-mätningar
<ol><li>Designa en uttryckskonstruktion för proteinet av intresse så att det fin...

En metod för att karakterisera övergående interaktioner som finns vid låga populationer mellan inneboende oordnade proteiner och olika bindningspartners med hjälp av PRE har presenterats. I det visade exemplet är proteinet självassocierande och därför kan PRE uppstå genom en kombination av inter- och intramolekylära interaktioner. Denna metod utvidgas lätt till heterogena prover där interaktionerna mellan två olika proteiner kan karakteriseras. Kompletterande information om hur olika regioner av proteinet i...

Intrinsic disorder (ID) beskriver proteiner (IDP) eller regioner inom proteiner (IDR) som inte spontant veckas i stabila sekundära eller tertiära strukturer men är biologiskt aktiva. I allmänhet är IDP/IDR:s funktion att underlätta specifika men reversibla interaktioner med biomolekyler vid fysiologiska förhållanden1. Således är IDP och IDR involverade i en rad cellulära funktioner, inklusive rekrytering, organisation och stabilisering av multiproteinkomplex, till exempel montering och aktivitet av spliceosome2, rekrytering och organisering av komponenter på platser för DNA-skada3, organisation och stabilisering av rekryteringen av transkriptionskomplex4 eller av kromatinremodelern BAF5. Dessutom finns internflyktingar vid signalering av nexuses där deras promiskuitet för olika bindningspartners gör det möjligt för dem att förmedla informationsöverföring via cellulära proteinnätverk6. Nyligen utfört arbete har också avslöjat en benägenhet för IDR-regioner att självassociera bildande biomolekylära kondensat genom processen med vätske-vätskefasseparation7. Många av de ovan nämnda funktionerna som involverar ID anses nu också involvera någon aspekt av kondensatbildning8. Trots betydelsen av ID för biomolekylär komplex montering, stabilisering, byggnadsställningar och signaltransduktion är de atomära detaljerna för deras specifika interaktioner svåra att identifiera eftersom IDP och IDR vanligtvis inte är mottagliga för strukturella undersökningar med röntgenkristallografi eller kryogen elektronmikroskopi.
Kärnmagnetisk resonans (NMR) är en idealisk teknik för att undersöka ID eftersom den inte är beroende av närvaron av styva eller homogena strukturella ensembler utan rapporterar om den omedelbara lokala miljön hos enskilda kärnor. Resonansfrekvensen, eller kemisk förskjutning, av en kärna i en given molekyl påverkas av svaga magnetfält inducerade av den lokala elektroniska distributionen, som i sin tur är beroende av bindningslängder, vinklar, närhet till andra kärnor, interaktioner med bindningspartners och andra faktorer9. Således fungerar varje kärna som en unik, platsspecifik strukturell sond som är känslig för förändringar i sin lokala kemiska miljö. Trots dessa fördelar är NMR en bulkteknik, och den observerade kemiska förskjutningen är genomsnittet av alla miljöer som provtas av en viss kärna. En rad NMR-tekniker, av vilka många beskrivs i detta nummer, har utvecklats för att återvinna strukturell, dynamisk och kinetisk information om högenergi, lågbefolkade biomolekylära konformationer som ingår i det genomsnittliga kemiska skiftet10,11. Även om de är tillfälligt befolkade är identifiering och kvantifiering av dessa tillstånd viktiga för att bestämma detaljerna i funktionella mekanismer12. Till exempel, när det gäller internflyktingar och fördjupade granskningar, kan konformationsensemblen vara partisk för att företrädesvis provkonformationer som är produktiva för bildandet av möteskomplex med fysiologiska bindningspartners. Detektion av dessa tillstånd, liksom identifiering av restspecifika inter- och intramolekylära interaktioner och dynamik, är viktiga för att bestämma de underliggande strukturella mekanismerna för proteinfunktion och komplex bildning.
Ett protokoll för att använda paramagnetisk relaxation enhancement (PRE) NMR för att undersöka övergående, lågbefolkade tillstånd som är viktiga för bildandet av IDP/IDR-medierade biomolekylära komplex beskrivs13. Detta tillvägagångssätt är användbart för att studera de övergående protein-proteininteraktionerna, såsom de som främjar sammansättningen av amyloidfibriller från α-synuklein 14,15 eller självföreningen av FUS16, samt för att karakterisera specifika protein-proteininteraktioner såsom mellan signalproteiner17. Ett exempel på en självassocierande IDP presenteras, där specifika inter- och intramolekylära interaktioner resulterar i företrädesvis komprimerade tillstånd samt platsspecifika interaktioner som driver självassociation.
PRE uppstår från den magnetiska dipolära interaktionen mellan en kärna och ett paramagnetiskt centrum med en isotrop g-tensor, vanligen levererad i form av en oparad elektron på en nitroxidgrupp eller som en paramagnetisk metallatom18 (figur 1). Medan atomer med anisotropa g-tensorer också ger en PRE-effekt, är analys av dessa system svårare på grund av förvirrande effekter som bidrar med pseudokontaktskift (PCS) eller kvarvarande dipolkoppling (RDC)13,19. Styrkan hos interaktionen mellan en kärna och det paramagnetiska centrumet är beroende av <r-6> avståndet mellan de två. Denna interaktion resulterar i en ökning av kärnavslappningshastigheter, vilket orsakar detekterbar linjebreddning även för långväga interaktioner (~ 10-35 Å), eftersom det magnetiska momentet för den oparade elektronen är så starkt20,21. Påvisande av övergående tillstånd med försäkrat värde är möjligt om följande två villkor är uppfyllda: (1) den transienta interaktionen är i snabbt utbyte på NMR-tidsskalan (observerad kemisk förskjutning är ett populationsviktat genomsnitt av utbytestillstånden); och (2) avståndet mellan kärnor och paramagnetiskt centrum är kortare i det tillfälligt befolkade tillståndet än i huvudtillståndet11. Den tvärgående PRE betecknas Γ2 och beräknas för praktiska ändamål utifrån skillnaden i 1H tvärgående avslappningshastigheter mellan ett prov innehållande ett paramagnetiskt centrum och en diamagnetisk styrning. För en fördjupad behandling av teorin om PRE och relaterade pseudokontaktförskjutningar i snabba och långsamma utbytesregimer hänvisas läsaren till de omfattande recensionerna av Clore och medarbetare13,22. Här beaktas endast situationen där 1H N-Γ2 är i den snabba utbytesregimen, där på grund av PR: s r-6-beroende är den observerade avkopplingshastigheten relaterad till både avståndet till vilket det paramagnetiska centrumet närmar sig kärnan såväl som den tid den spenderar i den konformationen. Därför ger transienta konformationer som inte involverar ett nära tillvägagångssätt en liten PRE medan närmare interaktioner, även om de är kortlivade, kommer att producera en större PRE.
För internflyktingar används PRE för att mäta och differentiera de interaktioner som sker inom en enda molekyl (intramolekylär) och mellan separata molekyler (intermolekylär). Genom att fästa ett paramagnetiskt centrum på ett NMR-synligt (t.ex. 15N-märkt) eller NMR-osynligt (t.ex. naturligt överflöd 14N) protein kan källan (inter- eller intramolekylär) för PRE bestämmas (figur 2). Platsriktad mutagenes som introducerar en cysteinrest är ett bekvämt tillvägagångssätt för att fästa ett paramagnetiskt centrum (spin-label) till ett protein23. Flera typer av molekyler har föreslagits för användning som spinnetiketter, inklusive metallkelaterande (EDTA-baserad) och fri radikal (nitroxidbaserad)24. Olika nitroxidspinnetiketter har beskrivits och finns med olika cysteinreaktiva kemier såsom metantisulfonat, maleimid, och jodacetamid25,26 (figur 1). Taggens eller länkarens inneboende flexibilitet kan vara problematisk för vissa analyser, och i dessa situationer har olika strategier föreslagits för att begränsa taggens rörelse, t.ex. genom att lägga till skrymmande kemiska grupper eller använda en andra länkare för att förankra taggen i proteinet (två platsfästen)27. 28. Dessutom kan kommersiellt tillgängliga taggar innehålla diastereomera proteiner, men i allmänhet bidrar detta inte till den observerade PRE29. Användningen av 3-maleimido-PROXYL bunden till ett fritt cystein via maleimidkemi beskrivs eftersom det är lättillgängligt, kostnadseffektivt, icke-reversibelt och reduktionsmedlet tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) kan bibehållas i lösningen under hela märkningsreaktionen. Eftersom 3-Maleimido-PROXYL har en isotrop g-tensor induceras inga PCS eller RDC, och samma kemiska skiftuppdrag kan användas för både paramagnetiska och diamagnetiska prover13.
1HN-T 2 mäts med hjälp av en tvåpunktsstrategi (T a, Tb) som tidigare har visat sig vara lika exakt som att samla in en fullständig evolutionsserie bestående av 8 till 12 tidpunkter30. Den första tidpunkten (T a) sätts så nära noll som praktiskt möjligt, och den optimala längden på den andra tidpunkten är beroende av storleken på den största förväntade PRE för ett givet prov och kan uppskattas från: Tb ~ 1,15/(R 2,dia + Γ 2) där R 2,dia representerar R 2 i det diamagnetiska provet13. Om storleken på de största PRE: erna är okänd är inställning av T b till ~ en gånger 1H T 2 av proteinet en bra initial uppskattning och optimeras ytterligare genom att justera T2 för att förbättra signalen till brus. Denna tvåpunktsmätstrategi minskar avsevärt den experimentella tiden som krävs för att mäta PRE och ger tid för mer signalmedelvärde, särskilt eftersom relativt utspädda prover används för att minimera effekterna av icke-specifika kontakter mellan molekyler. En HSQC-baserad pulssekvens används för att mäta 1H N-T2 och har beskrivits i detaljnågon annanstans 30. För förbättrad känslighet kan de hårda pulserna för de främre och bakre olämpliga överföringarna ersättas med formade pulser. alternativt konverteras sekvensen lätt till en TROSY-baserad avläsning31. Eftersom internflyktingar vanligtvis har mycket längre tvärgående avslappningshastigheter som resulterar i smalare linjebredder (på grund av den inneboende störningen) än globulära proteiner av liknande storlek, kan långa förvärvstider i den indirekta dimensionen användas för att förbättra spektralupplösningen och lindra den kemiska skiftdispersionsbegränsningen som är inneboende för internflyktingar.
PRE är ett användbart verktyg för att studera protein-protein och protein-nukleinsyrainteraktioner, särskilt interaktioner som är övergående eller lågt befolkade. Ett detaljerat protokoll för beredning av ett NMR-prov som är lämpligt för mätning av PRE, inklusive steg för proteinrening, platsstyrd spinnmärkning, inställning och kalibrering av pulsprogrammet, bearbetning och tolkning av NMR-data, tillhandahålls. Viktiga experimentella överväganden noteras genomgående som kan påverka datakvalitet och experimentella resultat, inklusive provkoncentration, val av spin-etikett och avlägsnande av paramagnetiska komponenter.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Inneboende oordnade proteiner och inneboende oordnade regioner inom proteiner utgör en stor och funktionellt signifikant del av det mänskliga proteomet. Den mycket flexibla karaktären hos dessa sekvenser gör att de kan bilda svaga, långväga och övergående interaktioner med olika biomolekylära partners. Specifika interaktioner med men ändå låg affinitet främjar promiskuös bindning och gör det möjligt för ett enda inneboende oordnat segment att interagera med en mängd målplatser. På grund av den övergående karaktären hos dessa interaktioner kan de vara svåra att karakterisera med strukturbiologiska metoder som förlitar sig på proteiner för att bilda en enda, dominerande konformation. Paramagnetisk avslappningsförbättring NMR är ett användbart verktyg för att identifiera och definiera den strukturella grunden för svaga och övergående interaktioner. Ett detaljerat protokoll för att använda paramagnetisk avslappningsförbättring för att karakterisera de lågbefolkade möteskomplexen som bildas mellan inneboende oordnade proteiner och deras protein, nukleinsyra eller andra biomolekylära partners beskrivs.

Intramolekylära 1H N-Γ2 PREs registrerades på ett självassocierande, inneboende oordnat fragment (rester 171-264) härrörande från lågkomplexitetsdomänen för det RNA-bindande proteinet EWSR142 (figur 3). Resthalter i sekventiell närhet till fästpunkten för spinnetiketter (t.ex. rest 178 eller 260 i figur 3) förväntas breddas avsevärt och kan inte detekteras i spektrumet. Rester som ...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Ett protokoll för tillämpning av paramagnetisk relaxation enhancement NMR-spektroskopi för att detektera svaga och övergående inter- och intramolekylära interaktioner i inneboende oordnade proteiner presenteras.

Paramagnetisk avslappningsförbättring för att upptäcka och karakterisera självassociationer av inneboende oordnade proteiner

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Den paramagnetiska avslappningsförbättringstekniken kan användas för att karakterisera och mäta intermolekylära avstånd och kvantifiera övergående och / eller lågt befolkade biomolekylära interaktioner. Här har vi tillämpat denna teknik för att fånga interaktioner som föregår proteinkondensation. PREs känslighet möjliggör identifiering, detektion och kvantifiering av atomupplösningstillstånd som förblir osynliga och otillgängliga för andra NMR-tekniker.Viktiga steg i detta protokoll inkluderar att ta bort den okonjugerade kväveoxidspinnetiketten och noggrant analysera spektra för att noggrant mäta topphöjden. Dessutom måste försiktighet iakttas under NMR-experimentinställning och pulskalibrering. Till att börja med, tillsätt 3-maleimido-PROXYL från en stamlösning vid 20 gånger molär överskott av det 15N isotopiskt märkta proteinet av intresse.Inkubera över natten vid rumstemperatur eller fyra grader Celsius skyddad från ljus och syre och med mild gungning eller nutation. Följande dag, ta bort etiketten för icke-reagerat free spin för att förhindra icke-specifikt PRE med hjälp av icke-specifikt lösningsmedels-PRE med antingen omfattande dialys av proteinprovet eller med gelfiltrering. Använd sedan Ellmans reagens för att kvantifiera fria sulfhydrylgrupper i lösningen.Mät absorbansen med hjälp av en mikroplattläsare och konstruera standardkurvan. För att mäta intramolekylär PRE, bereda 15N isotopanrikat spinnmärkt protein till en koncentration av minst 100 mikromolar, men inte mer än 300 mikromolar, i en buffert lämplig för NMR. Använd sedan en lång stamglaspipett eller mikropipett och överför NMR-provet till ett fem millimeter NMR-rör som är lämpligt för användning i högfältsmagneter.Placera provet i magneten. Lås på deuteriumsignalen med hjälp av låskommandot och justera och matcha protonkanalen enligt anläggningsprotokoll. Justera sedan mellanläggen med hjälp av den övre mellanläggsunderstrykningsrutinen för att optimera undertryckandet av lösningsmedelssignalen.Kalibrera sedan protonpulsen med P-OPT-programmet. Kalibrera sedan 15N-pulsen mot ett standardprov. Bestäm rätt dämpning för formade pulser med hjälp av formverktygets subrutin.Öppna sedan lämplig pulsformfil genom att klicka på mappikonen. De formade pulserna finns i avsnittet pulsparametrar i förvärvsparametrar. När du har läst in pulsdefinitionsfilen klickar du på Analysera vågform följt av Integrera form.Mata in den kalibrerade protonen 90 graders hård puls, önskad form, pulslängd och rotation. Beräkna sedan effektnivån för den formade pulsen genom att lägga till förändringen av effektnivån till dämpningen för den kalibrerade 90 graders pulsen. Spela in en standard proton 15N HSQC för att optimera svepbredd, bärfrekvens och kontrollera vattendämpning.Slutligen justerar du svepbredden och antalet indirekta dimensionssteg med SW- och TD-kommandona eller direkt i lämpliga dialogrutor. Kalibrera de formade pulserna enligt tidigare demonstration. Ange sedan de kalibrerade pulslängderna i avsnittet pulsparametrar på fliken Förvärvsparametrar.För att mäta amidprotonen T2 med hjälp av metoden med två tidsfördröjningspunkter, ställ in tidsfördröjningarna genom att redigera VD-listfilen. Den första fördröjningen är inställd på 0,01 millisekunder. Använd relationen till det förväntade maximala PRE och välj den andra fördröjningen.Bestäm sedan ett lämpligt värde genom att jämföra de första stegen i det första och andra fördröjningsspektra och justera den andra fördröjningen så att signalen sönderfaller till mellan 40 och 50% av sitt ursprungliga värde. Bestäm antalet komplexa punkter som ska spelas in och antalet skanningar för tillräcklig signalmedelvärde. Använd sedan kommandot EXPT för att beräkna experimenttiden och starta experimentet med kommandot ZG. Efter upplösning av natriumaskorbat i NMR-bufferten, justera pH-värdet så att det matchar det för den ursprungliga NMR-bufferten.Tillsätt sedan askorbinsyran till NMR-röret med ett 10 gånger molärt överskott över koncentrationen av spinnetiketten genom att placera en droppe under rörets kant. Täck röret och vänd försiktigt för att blanda. Snurra vid 200 till 400 G i 10 till 20 sekunder i en handvevad centrifug för att sedimentera provet i botten av röret.Efter inslagning av röret i folie, låt reaktionen fortsätta i minst tre timmar. Registrera sedan amidproton T2 på det diamagnetiska provet med samma parametrar som används för det paramagnetiska provet. Intramolekylära amidprotongammas PREs registrerades på ett självassocierande inneboende oordnat fragment härrörande från domänen med låg komplexitet hos RNA-bindande proteinet EWSR1.Rester i sekventiell närhet till fästpunkten för spinnetiketten förväntas breddas avsevärt och kan inte detekteras i spektrumet. Rester som var sekventiellt åtskilda från fästpunkten men visade förbättrad gamma var rumsligt nära spinnetiketten. När det gäller inneboende oordnade proteiner kommer registrering och analys av puréer att ge information om intramolekylära kontakter och övergående interaktionsytor.Att kombinera PRE-mätningar med andra biofysiska metoder som dynamisk ljusspridning, storleksuteslutningskromatografi, analytisk ultracentrifugering och beräkningsmetoder kan ge djupare insikter. PRE-mätning hjälper till att karakterisera övergående glesbefolkat tillstånd. Detta tillvägagångssätt kan utvidgas för att karakterisera interaktioner som är viktiga för otaliga biologiska processer såsom molekylär igenkänning, allosterisk konformationsselektion och monteringsprocesser inklusive montering av membranfria organeller via fasseparation.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Kärnmagnetisk resonansspektroskopi för identifiering av flera fosforyleringar av egen Oordnade proteiner

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Användning av elektron paramagnetiska resonans i biologiska prover vid omgivningstemperatur och 77 K

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Fluorescerande silverfärgning av proteiner i polyakrylamidgeler

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttryck, rening, kristallisering, och enzym analyser av Fumarylacetoacetat Hydrolase Domain-innehållande proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisera enskilda protein aggregat med infraröd Nanospektroskopi och atomkraft mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Fullständigt bearbetat rekombinant KRAS4b: isolerar och karakteriserar det farnesylerade och metylerade proteinet

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Tvärgående sektionering av moget ris (Oryza sativa L.) Kärnor för skanning av elektronmikroskopiavbildning med pipettespetsar som immobiliseringsstöd

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 (på 5) N CPMG Avslappningsdispersion för undersökning av proteinkonformationsdynamik på tidsskalan μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Praktiska aspekter av provberedning och installation av 1H R 1ρ avslappningsdispersionsexperiment av RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...