Name: paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins
Uploaded: 2021-09-23T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Yararlı tartışmalar ve teknik yardım için Dr. Jinfa Ying ve Kristin Cano'ya teşekkür ederiz. DSL bir St. Baldrick's Scholar'dır ve St. Baldrick's Foundation'ın (634706) desteğini kabul eder. Bu çalışma kısmen DSL'ye Welch Vakfı (AQ-2001-20190330), Max ve Minnie Tomerlin Voelcker Fonu (DSL'ye Voelcker Vakfı Genç Araştırmacı Hibesi), DSL'ye UTHSA Başlangıç Fonları ve CNJ'ye Çocuk Sağlığı alanında Greehey Yüksek Lisans Bursu tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, San Antonio'daki Texas Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi'ndeki Kurumsal Araştırma Çekirdeklerinin bir parçası olan Yapısal Biyoloji Çekirdek Tesislerinde yürütülen ve Araştırma Başkan Yardımcılığı Ofisi ve Mays Kanser Merkezi İlaç Keşfi ve Yapısal Biyoloji Ortak Kaynağı (NIH P30 CA054174) tarafından desteklenen araştırmalara dayanmaktadır.

Protokol için genel gereksinimler: protein saflaştırma tesisleri, UV-Vis spektrometresi, yüksek alanlı NMR spektrometresi ve işletim yazılımı, işlem sonrası analiz yazılımı; NMRPipe32, Sparky 33 (veya CCPN Analizi 34 veya NMRViewJ35).
1. PRE ölçümleri için bir proteinin rekombinant ekspresyonu ve saflaştırılması
<ol><li>İlgilenilen protein için tek bir sistein kalıntısı ...

Kendinden düzensiz proteinler ve PRE kullanan çeşitli bağlanma ortakları arasında düşük popülasyonlarda var olan geçici etkileşimleri karakterize etmek için bir yöntem sunulmuştur. Gösterilen örnekte, protein kendi kendine ilişkilidir ve bu nedenle PRE, moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin bir kombinasyonundan kaynaklanabilir. Bu yöntem, iki farklı protein arasındaki etkileşimlerin karakterize edilebildiği heterojen numunelere kolayca genişletilebilir. Proteinin farklı bölgel...

İçsel bozukluk (ID), kendiliğinden stabil ikincil veya üçüncül yapılara katlanmayan, ancak biyolojik olarak aktif olan proteinleri (IDP'ler) veya proteinler (IDR'ler) içindeki bölgeleri tanımlar. Genel olarak, IDP/IDR'lerin işlevi, fizyolojik koşullarda biyomoleküllerle spesifik ancak geri dönüşümlü etkileşimleri kolaylaştırmaktır1. Bu nedenle, IDP'ler ve IDR'ler, çoklu protein komplekslerinin işe alınması, organizasyonu ve stabilizasyonu dahil olmak üzere bir dizi hücresel fonksiyonda yer alır, örneğin, splisozom2'nin montajı ve aktivitesi, DNA hasarı3 bölgelerinde bileşenlerin işe alınması ve organizasyonu, transkripsiyon komplekslerinin4 veya kromatin yeniden şekillendirici BAF5'in işe alınmasının organizasyonu ve stabilizasyonu. Ek olarak, IDP'ler, farklı bağlanma ortakları için rastgele cinsel ilişkilerinin hücresel protein ağları aracılığıyla bilgi aktarımına aracılık etmelerini sağladığı sinyal bağlantı noktalarında bulunur6. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, IDR bölgelerinin sıvı-sıvı faz ayırma işlemi yoluyla biyomoleküler kondensatlar oluşturarak kendi kendine birleşme eğilimini de ortaya koymuştur7. ID'yi içeren yukarıda bahsedilen işlevlerin birçoğunun artık kondens oluşumunun bir yönünü de içerdiği düşünülmektedir8. ID'nin biyomoleküler kompleks montajı, stabilizasyonu, iskelesi ve sinyal iletimi için önemine rağmen, IDP'ler ve IDR'ler tipik olarak x-ışını kristalografisi veya kriyojenik elektron mikroskobu kullanılarak yapısal araştırmalara uygun olmadığından, spesifik etkileşimlerinin atomik ayrıntılarının tanımlanması zordur.
Nükleer manyetik rezonans (NMR), sert veya homojen yapısal toplulukların varlığına bağlı olmadığı, ancak tek tek çekirdeklerin yakın yerel ortamı hakkında rapor verdiği için ID'yi araştırmak için ideal bir tekniktir. Belirli bir moleküldeki bir çekirdeğin rezonans frekansı veya kimyasal kayması, yerel elektronik dağılımın neden olduğu zayıf manyetik alanlardan etkilenir ve bu da bağ uzunluklarına, açılarına, diğer çekirdeklerin yakınlığına, bağlanma ortaklarıyla etkileşimlere ve diğer faktörlerebağlıdır 9. Böylece, her çekirdek, yerel kimyasal ortamındaki değişikliklere duyarlı, benzersiz, bölgeye özgü bir yapısal prob görevi görür. Bu avantajlara rağmen, NMR bir yığın tekniğidir ve gözlemlenen kimyasal kayma, belirli bir çekirdek tarafından örneklenen tüm ortamların ortalamasıdır. Birçoğu bu sayıda açıklanan bir dizi NMR tekniği, ortalama kimyasal kaymada10,11 bulunan yüksek enerjili, düşük nüfuslu biyomoleküler konformasyonlar hakkında yapısal, dinamik ve kinetik bilgileri geri kazanmak için geliştirilmiştir. Geçici olarak doldurulmuş olmasına rağmen, bu durumların tanımlanması ve ölçülmesi, işlevsel mekanizmaların ayrıntılarını belirlemek için önemlidir12. Örneğin, IDP'ler ve IDR'ler söz konusu olduğunda, konformasyonel topluluk, fizyolojik bağlanma ortaklarıyla karşılaşma komplekslerinin oluşumu için üretken olan konformasyonları tercihen örneklemek için önyargılı olabilir. Bu durumların tespiti ve kalıntıya özgü moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin ve dinamiklerin tanımlanması, protein fonksiyonunun ve kompleks oluşumunun altında yatan yapısal mekanizmaları belirlemek için önemlidir.
IDP/IDR aracılı biyomoleküler komplekslerin oluşumu için önemli olan geçici, düşük nüfuslu durumları araştırmak için paramanyetik gevşeme geliştirme (PRE) NMR'yi kullanmak için bir protokol açıklanmaktadır13. Bu yaklaşım, α-sinüklein 14,15'ten amiloid fibrillerin montajını veya FUS16'nın kendi kendine birleşmesini destekleyenler gibi geçici protein-protein etkileşimlerini incelemek ve ayrıca sinyal proteinleri 17 arasındaki gibi spesifik protein-protein etkileşimlerini karakterize etmek için kullanışlıdır. Spesifik moleküller arası ve moleküller arası etkileşimlerin tercihli olarak sıkıştırılmış durumların yanı sıra kendi kendine birleşmeyi yönlendiren bölgeye özgü etkileşimlerle sonuçlandığı, kendi kendini ilişkilendiren bir IDP örneği sunulmaktadır.
PRE, bir çekirdeğin, genellikle bir nitroksit grubu üzerinde eşleşmemiş bir elektron şeklinde veya bir paramanyetik metal atomu18 olarak sağlanan izotropik bir g-tensörü ile bir paramanyetik merkeze manyetik dipolar etkileşiminden kaynaklanır (Şekil 1). Anizotropik g-tensörlü atomlar da bir PRE etkisi üretirken, bu sistemlerin analizi, yalancı temas kaymaları (PCS) veya artık dipolar eşleşmenin (RDC) katkıda bulunduğu karıştırıcı etkiler nedeniyle daha zordur13,19. Bir çekirdek ile paramanyetik merkez arasındaki etkileşimin gücü, ikisi arasındaki <r-6> mesafesine bağlıdır. Bu etkileşim, nükleer gevşeme oranlarında bir artışa neden olur, bu da uzun menzilli etkileşimler (~ 10-35 Å) için bile tespit edilebilir çizgi genişlemesine neden olur, çünkü eşleşmemiş elektronun manyetik momenti çok güçlüdür20,21. PRE ile geçici durumların tespiti, aşağıdaki iki koşulun karşılanması durumunda mümkündür; (1) geçici etkileşim, NMR zaman ölçeğinde hızlı bir değişim içindedir (gözlemlenen kimyasal kayma, değiş tokuş durumlarının nüfus ağırlıklı ortalamasıdır); ve (2) çekirdeklerin paramanyetik merkez mesafesi, geçici nüfuslu durumda ana durum11'den daha kısadır. Enine PRE, Γ2 ile gösterilir ve pratik amaçlar için, bir paramanyetik merkez içeren bir numune ile bir diyamanyetik kontrol arasındaki 1H enine gevşeme oranlarındaki farktan hesaplanır. Hızlı ve yavaş değişim rejimlerinde PRE teorisinin ve ilgili sözde temas kaymalarının derinlemesine bir tedavisi için, okuyucu Clore ve çalışma arkadaşları13,22 tarafından yapılan kapsamlı incelemelere yönlendirilir. Burada sadece 1H N-Γ2'nin hızlı değişim rejiminde olduğu durum dikkate alınır, burada PRE'nin r-6 bağımlılığı nedeniyle, gözlenen gevşeme oranı hem paramanyetik merkezin çekirdeğe yaklaştığı mesafe hem de bu konformasyonda geçirdiği süre ile ilgilidir. Bu nedenle, yakın bir yaklaşım içermeyen geçici konformasyonlar küçük bir PRE üretirken, daha yakın etkileşimler, kısa ömürlü olsa bile, daha büyük bir PRE üretecektir.
IDP'ler için PRE, tek bir molekül içinde (molekül içi) ve ayrı moleküller (termoleküler) arasında meydana gelen etkileşimleri ölçmek ve ayırt etmek için kullanılır. Bir NMR görünür (örneğin, 15N-etiketli) veya NMR görünmez (örneğin, doğal bolluk 14N) proteinine bir paramanyetik merkez ekleyerek, PRE'nin kaynağı (moleküller arası veya moleküller arası) belirlenebilir (Şekil 2). Bir sistein kalıntısı ekleyen bölgeye yönelik mutajenez, bir proteine bir paramanyetik merkez (spin-label) eklemek için uygun bir yaklaşımdır23. Metal şelatlama (EDTA bazlı) ve serbest radikal (nitroksit bazlı) dahil olmak üzere spin etiketleri olarak kullanılmak üzere çeşitli molekül türleri önerilmiştir24. Çeşitli nitroksit spin etiketleri tanımlanmıştır ve methanetiosülfonat, maleimid ve iyodoasetamid25,26 gibi farklı sistein reaktif kimyaları ile mevcuttur (Şekil 1). Etiketin veya bağlayıcının doğal esnekliği belirli analizler için sorunlu olabilir ve bu durumlarda, etiketin hareketini sınırlamak için hacimli kimyasal gruplar eklemek veya etiketi proteine sabitlemek için ikinci bir bağlayıcının kullanılması gibi farklı stratejiler önerilmiştir (iki bölge eki)27, 28. Ek olarak, ticari olarak temin edilebilen etiketler diastereomerik proteinler içerebilir, ancak genellikle bu, gözlemlenen PRE29'a katkıda bulunmayacaktır. Maleimid kimyası yoluyla serbest bir sisteine bağlanan 3-Maleimido-PROXYL'in kullanımı, kolayca temin edilebildiği, uygun maliyetli, geri dönüşümsüz olduğu ve indirgeyici ajan tris (2-karboksietil) fosfin (TCEP) etiketleme reaksiyonu boyunca çözelti içinde tutulabildiği için açıklanmaktadır. 3-Maleimido-PROXYL izotropik bir g-tensöre sahip olduğundan, hiçbir PCS veya RDC indüklenmez ve aynı kimyasal kayma atamaları hem paramanyetik hem de diyamanyetik numuneleriçin kullanılabilir 13.
1H N-T2, daha önce 8 ila 12 zaman noktasından oluşan tam bir evrim serisini toplamak kadar doğru olduğu gösterilen iki zaman noktası stratejisi (T a, Tb) kullanılarak ölçülür30. İlk zaman noktası (T a) pratik olarak sıfıra yakın olarak ayarlanır ve ikinci zaman noktasının optimum uzunluğu, belirli bir numune için beklenen en büyük PRE'nin büyüklüğüne bağlıdır ve şu şekilde tahmin edilebilir: Tb ~ 1.15/(R 2,dia + Γ 2) burada R2,dia, diyamanyetik numunenin R2'sini temsil eder13. En büyük PRE'lerin büyüklüğü bilinmiyorsa, Tb'yi proteinin 1 H T2'sinin ~bir katına ayarlamak iyi bir başlangıç tahminidir ve sinyali gürültüye iyileştirmek için T2'yi ayarlayarak daha da optimize edilir. Bu iki noktalı ölçüm stratejisi, PRE'leri ölçmek için gereken deneysel süreyi önemli ölçüde azaltır ve özellikle moleküller arasındaki spesifik olmayan temasların etkilerini en aza indirmek için nispeten seyreltik numuneler kullanıldığından, daha fazla sinyal ortalaması için zaman sağlar. 1H N-T2'yi ölçmek için HSQC tabanlı bir darbe dizisi kullanılır ve başka bir yerdeayrıntılı olarak açıklanmıştır 30. Daha iyi hassasiyet için, ileri ve geri BECERIKLİ transferlerin sert darbeleri şekilli darbelerle değiştirilebilir; alternatif olarak, dizi kolayca TROSY tabanlı bir okuma31'e dönüştürülür. IDP'ler tipik olarak, benzer büyüklükteki küresel proteinlerden daha dar çizgi genişliklerine (doğal bozukluk nedeniyle) neden olan çok daha uzun enine gevşeme oranlarına sahip olduklarından, spektral çözünürlüğü iyileştirmek ve IDP'lerin doğasında bulunan kimyasal kayma dağılım sınırlamasını hafifletmek için dolaylı boyutta uzun alım süreleri kullanılabilir.
PRE, protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimlerini, özellikle geçici veya düşük nüfuslu etkileşimleri incelemek için yararlı bir araçtır. Protein saflaştırma, sahaya yönelik spin etiketleme, nabız programının ayarlanması ve kalibre edilmesi, NMR verilerinin işlenmesi ve yorumlanması dahil olmak üzere PRE'leri ölçmek için uygun bir NMR numunesinin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlanır. Numune konsantrasyonu, spin etiketinin seçimi ve paramanyetik bileşenlerin çıkarılması dahil olmak üzere veri kalitesini ve deneysel sonucu etkileyebilecek önemli deneysel hususlar not edilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m and 0.22 &#181;m syringe filters</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SLHVM33RS 
			SLGVR33RS</td>
			<td>Filter lysate before first purification step and before size exclusion chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm Petri Dish</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>FB0875713</td>
			<td>Agar plates for bacterial transformation.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>14N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>576794</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15N Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>299251</td>
			<td>Use of 15N in M9 medium will produce an NMR visible protein, 14N will produces an NMR invisible protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 L Fernbach baffled flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431523</td>
			<td>Bacterial expression culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Maleimido-Proxyl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>253375</td>
			<td>Nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14-432-22</td>
			<td>Solution/protein storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon centrifugal filter</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>UFC900308</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillan</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5354</td>
			<td>Antibiotic for a selective marker, exact choice depends on the expression construct plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance</td>
			<td>Oahus</td>
			<td>30061978</td>
			<td>Explorer Pro, for weighing reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>AX1775</td>
			<td>Reduces nitroxide spin label</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sterilize glassware and culture media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge bottles</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>010-1459</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge, hand-crank</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>0241C68</td>
			<td>Boekel hand-driven, low-speed centrifuge with 15 mL buckets that can accommodate NMR tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chelex 100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C7901</td>
			<td>Remove contaminating paramagnetic compounds from buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer workstation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Linux or Mac OS compatable with NMR data processing and analysis software packages such as NMRPipe and Sparky</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>151882</td>
			<td>Needed for NMR lock signal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9434</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibasic Sodium Phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5136</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ellman&#39;s reagent (5,5-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22582</td>
			<td>Quantification of free cystiene residues</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed centrifuge tubes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>3114-0050</td>
			<td>Used to clear bacterial lysate.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-field NMR instrument (600 - 800 MHz)</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Equiped with a multichannel cryogenic probe and temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAC column, HisTrap FF</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>17528601</td>
			<td>Initial fractionation of crude bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl B-D-thiogalactoside (IPTG)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>I6758</td>
			<td>Induces protein expression for genes under control of lac operator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>22700025</td>
			<td>Items are used for transforming E. coli to express protein of interest, substitions for any of these items with like products is acceptable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12780052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7318300</td>
			<td>BioRad BioLogic is used for low-pressure chomatograph such as running IMAC columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium pressure chromatography system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>7880007</td>
			<td>BioRad NGC equipped with a multi-wavelength detector, pH and conductivity monitors, and automatic fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM vitamin solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M6895</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidizer</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>EmulsiFlex-C3</td>
			<td>Provides rapid and efficient bacterial cell lysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipettes</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td>Calibrated set of micropippetters with properly fitting disposable tips (available from multiple manufacturers e.g. Eppendorf)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monobasic potassium phosphate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1551139</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR pipettes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>255688</td>
			<td>To remove sample from NMR tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NMR sample tube</td>
			<td>NewEra</td>
			<td>NE-SL5</td>
			<td>Suitable for high-field NMR spectrometers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preparative Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Avanti J-HC</td>
			<td>Harvest E. coli cells after recombinant protein expression</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round bottom polystyrene centrifuge tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352057</td>
			<td>Clear bacterial lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaking incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>S44I200005</td>
			<td>Temperature controlled growth of E. coli starter and expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td>M9 media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicating water bath and vacuum source</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Used to degas buffer solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>FB505110</td>
			<td>Used for bacterial cell lysis or shearing bacterial DNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>OD600 Diluphotometer</td>
			<td>Monitor growth of E.coli protein expression cultures</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 16/600 size exculsion colum</td>
			<td>Cytvia</td>
			<td>28989333</td>
			<td>Final protein purification step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Topspin software, version 3.2 or later</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td>Operating software for the NMR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transformation competent E. coli cells</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>C600003</td>
			<td>One Shot BL21 Star (DE3) chemically competent E. coli, other strains may be compatable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>20490</td>
			<td>Reducing agent compatable with some sulfhydryl-reactive conjugations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV-Vis spectrophotometer</td>
			<td>Implen</td>
			<td>NP80</td>
			<td>Measure protein concentration.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath, temperature controlled</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>FSGPD25</td>
			<td>For heat shock step of bacterial transformation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast extract</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>Y1625</td>
			<td>For supplementing M9 media if required</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paramagnetic relaxation enhancement for detecting and characterizing self-associations of intrinsically disordered proteins

Proteinler içindeki doğal olarak düzensiz proteinler ve içsel olarak düzensiz bölgeler, insan proteomunun büyük ve işlevsel olarak önemli bir bölümünü oluşturur. Bu dizilerin oldukça esnek doğası, çeşitli biyomoleküler ortaklarla zayıf, uzun menzilli ve geçici etkileşimler oluşturmalarına izin verir. Spesifik ancak düşük afiniteli etkileşimler, rastgele bağlanmayı teşvik eder ve özünde düzensiz tek bir segmentin çok sayıda hedef bölgeyle etkileşime girmesini sağlar. Bu etkileşimlerin geçici doğası nedeniyle, tek ve baskın bir konformasyon oluşturmak için proteinlere dayanan yapısal biyoloji yöntemleriyle karakterize edilmeleri zor olabilir. Paramanyetik gevşeme geliştirme NMR, zayıf ve geçici etkileşimlerin yapısal temelini tanımlamak ve tanımlamak için yararlı bir araçtır. Doğası gereği düzensiz proteinler ile bunların proteini, nükleik asidi veya diğer biyomoleküler ortakları arasında oluşan düşük nüfuslu karşılaşma komplekslerini karakterize etmek için paramanyetik gevşeme geliştirmesini kullanmak için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Molekül içi 1HN-Γ 2 PRE'ler, RNA bağlayıcı protein EWSR142'nin düşük karmaşıklık alanından türetilen, kendi kendine birleşen, içsel olarak düzensiz bir fragman (kalıntılar 171-264) üzerine kaydedildi (Şekil 3). Spin-etiket bağlantı noktasına yakın sıralı kalıntıların (örneğin, Şekil 3'teki kalıntı 178 veya 260) önemli ölçüde genişlemesi beklenir ve spektrumd...

Watch this Scientific Journal Video about Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins at JoVE.com

Paramagnetic Relaxation Enhancement for Detecting and Characterizing Self-Associations of Intrinsically Disordered Proteins

Doğası gereği düzensiz proteinlerde zayıf ve geçici moleküller arası ve moleküller arası etkileşimleri tespit etmek için paramanyetik gevşeme geliştirme NMR spektroskopisinin uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

İçsel Olarak Düzensiz Proteinlerin Kendi Kendine İlişkilerini Tespit Etmek ve Karakterize Etmek için Paramanyetik Gevşeme Geliştirmesi

Intrinsically disordered proteins and intrinsically disordered regions within proteins make up a large and functionally significant part of the human ...

Paramanyetik gevşeme geliştirme tekniği, moleküller arası mesafeleri karakterize etmek ve ölçmek ve geçici ve/veya düşük nüfuslu biyomoleküler etkileşimleri ölçmek için kullanılabilir. Burada, protein yoğunlaşmasından önceki etkileşimleri yakalamak için bu tekniği uyguladık. PRE'lerin hassasiyeti, diğer NMR teknikleri tarafından görünmez ve erişilemez kalan dinamik durumun atomik çözünürlüğün tanımlanmasını, algılanmasını ve ölçülmesini sağlar.Bu protokoldeki temel adımlar, konjuge olmayan nitroksit spin etiketinin çıkarılmasını ve tepe yüksekliğini doğru bir şekilde ölçmek için spektrumların dikkatlice analiz edilmesini içerir. Ek olarak, NMR deney kurulumu ve darbe kalibrasyonu sırasında dikkatli olunmalıdır. Başlamak için, ilgilenilen 15N izotopik olarak etiketlenmiş proteinin 20 katı molar fazlalığında bir stok çözeltisinden 3-maleimido-PROXYL ekleyin.Gece boyunca oda sıcaklığında veya dört santigrat derecede, ışıktan ve oksijenden korunarak ve hafif sallanma veya nütasyon ile inkübe edin. Ertesi gün, protein örneğinin kapsamlı diyalizini veya jel filtrasyonunu kullanarak spesifik olmayan çözücü PRE'yi önlemek için reaksiyona girmemiş serbest sıkma etiketini çıkarın. Ardından, çözeltideki serbest sülfhidril gruplarını ölçmek için Ellman reaktifini kullanın.Bir mikroplaka okuyucu kullanarak absorbansı ölçün ve standart eğriyi oluşturun. Molekül içi PRE'yi ölçmek için, NMR için uygun bir tamponda en az 100 mikromolar, ancak 300 mikromolar'dan fazla olmayan bir konsantrasyona 15N izotopik olarak zenginleştirilmiş spin etiketli protein hazırlayın. Daha sonra uzun saplı bir cam pipet veya mikropipet kullanarak NMR numunesini yüksek alanlı mıknatıslarda kullanıma uygun beş milimetrelik bir NMR tüpüne aktarın.Numuneyi mıknatısa yerleştirin. Lock komutunu kullanarak döteryum sinyalini kilitleyin ve proton kanalını tesis protokollerine göre ayarlayın ve eşleştirin. Ardından, solvent sinyali bastırmayı optimize etmek için üst şim alt yordamını kullanarak şimleri ayarlayın.Ardından, P-OPT programını kullanarak proton darbesini kalibre edin. Ardından 15N darbeyi standart bir örneğe göre kalibre edin. Şekil aracı alt yordamını kullanarak şekilli darbeler için doğru zayıflamayı belirleyin.Ardından klasör simgesine tıklayarak uygun darbe şekli dosyasını açın. Şekillendirilmiş darbeler, toplama parametrelerinin darbe parametreleri bölümünde bulunur. Darbe tanımlama dosyasını yükledikten sonra, Dalga Formunu Analiz Et'e ve ardından Şekli Entegre Et'e tıklayın.Kalibre edilmiş proton 90 derece sert darbeyi, istenen şekil darbe uzunluğunu ve dönüşü girin. Ardından, kalibre edilmiş 90 derecelik darbe için zayıflamaya güç seviyesi değişikliğini ekleyerek şekillendirilmiş darbenin güç seviyesini hesaplayın. Süpürme genişliğini, taşıyıcı frekansını optimize etmek ve su bastırmayı kontrol etmek için standart bir proton 15N HSQC kaydedin.Son olarak, SW ve TD komutlarını kullanarak veya doğrudan uygun iletişim kutularında tarama genişliğini ve dolaylı boyut artışlarının sayısını ayarlayın. Şekilli darbeleri daha önce gösterildiği gibi kalibre edin. Ardından, Toplama Parametreleri sekmesindeki darbe parametreleri bölümüne kalibre edilmiş darbe uzunluklarını girin.Amid proton T2'yi iki zaman gecikme noktası yaklaşımını kullanarak ölçmek için, VD liste dosyasını düzenleyerek zaman gecikmelerini ayarlayın. İlk gecikme 0,01 milisaniye olarak ayarlanmıştır. Beklenen en yüksek PRE ile ilişkiyi kullanarak ikinci gecikmeyi seçin.Ardından, birinci ve ikinci gecikme spektrumlarının ilk artışlarını karşılaştırarak ve ikinci gecikmeyi, sinyal başlangıç değerinin %40 ila %50'si arasında düşecek şekilde ayarlayarak uygun bir değer belirleyin. Yeterli sinyal ortalaması için kaydedilecek karmaşık noktaların sayısını ve tarama sayısını belirleyin. Ardından deney süresini hesaplamak için EXPT komutunu kullanın ve denemeyi ZG komutuyla başlatın. Sodyum askorbat NMR tamponunda çözüldükten sonra, pH'ı orijinal NMR tamponununkine uyacak şekilde ayarlayın.Daha sonra askorbik asidi, tüpün kenarının altına bir damlacık yerleştirerek, spin etiketinin konsantrasyonunun 10 katı molar fazlalıkta NMR tüpüne ekleyin. Tüpü kapatın ve karıştırmak için dikkatlice ters çevirin. Numuneyi tüpün dibine yerleştirmek için elle çalıştırılan bir santrifüjde 10 ila 20 saniye boyunca 200 ila 400 G'de döndürün.Tüpü folyoya sardıktan sonra, reaksiyonun en az üç saat devam etmesine izin verin. Ardından, paramanyetik numune için kullanılan aynı parametreleri kullanarak diyamanyetik numune üzerine amid proton T2'yi kaydedin. Molekül içi amid proton gamaları PRE'leri, RNA bağlayıcı protein EWSR1'in düşük karmaşıklık alanından türetilen, kendi kendini ilişkilendiren, içsel olarak düzensiz bir fragman üzerine kaydedildi.Döndürme etiketi bağlantı noktasına yakın sıralı kalıntıların önemli ölçüde genişlemesi beklenir ve spektrumda tespit edilemez. Bağlantı noktasından sıralı olarak aralıklı olan ancak gelişmiş gama gösteren kalıntılar, uzamsal olarak spin etiketine yakındı. Doğası gereği düzensiz proteinler söz konusu olduğunda, pürelerin kaydedilmesi ve analiz edilmesi, molekül içi temaslar ve geçici etkileşim yüzeyleri hakkında bilgi verecektir.PRE ölçümlerini dinamik ışık saçılımı, boyut dışlama kromatografisi, analitik ultrasantrifüjleme ve hesaplama yöntemleri gibi diğer biyofiziksel yöntemlerle birleştirmek daha derin içgörüler sağlayabilir. PRE ölçümü, geçici seyrek nüfuslu durumu karakterize etmeye yardımcı olur. Bu yaklaşım, moleküler tanıma, allosterik konformasyonel seleksiyon ve faz ayırma yoluyla zarsız organellerin birleştirilmesi de dahil olmak üzere montaj süreçleri gibi sayısız biyolojik süreç için önemli olan etkileşimleri karakterize etmek için genişletilebilir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Use of Electron Paramagnetic Resonance in Biological Samples at Ambient Temperature and 77 K

Elektron Paramagnetic rezonans ortam sıcaklığı ve 77 K biyolojik örneklerde kullanımı

The accurate and specific detection of reactive oxygen species (ROS) in different cellular and tissue compartments is essential to the study of ...

Fluorescent Silver Staining of Proteins in Polyacrylamide Gels

Floresan gümüş Polyacrylamide jeller proteinlerin boyama

Silver staining is a colorimetric technique widely used to visualize protein bands in polyacrylamide gels following sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Fully Processed Recombinant KRAS4b: Isolating and Characterizing the Farnesylated and Methylated Protein

Tam İşlenmiş Rekombinant KRAS4b: Farnesile ve Metillenmiş Proteini Yalıtma ve Karakterize Etme

Protein prenylation is a key modification that is responsible for targeting proteins to intracellular membranes. KRAS4b, which is mutated in 22% of human ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Hücre İçi Hızlı Fotokimyasal Oksidasyon ile Hücresel Proteinlerin Karakterizasyonu

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the Ãƒâ€šÃ‚Âµs-ms Timescale

15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1ÃƒÂÃ‚Â Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA'nın 1 H R1φ Gevşeme Dispersiyon Deneylerinin Numune Hazırlama ve Kurulumunun Pratik Yönleri

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...