Name: area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health (R01 AR067247) und zum Teil vom Delaware INBRE-Programm finanziert, unterstützt durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) von den National Institutes of Health und dem Bundesstaat Delaware. Der Inhalt des Manuskripts spiegelt nicht unbedingt die Ansichten der Förderagenturen wider.

1. Zellkultur und Bilderfassung
<ol><li>Kultur RAW264.7 Makrophagen bei 37 °C und 5% CO2 in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 5 μM β-Mercaptoethanol.<ol>
<li>Für die Monokultur-Bildgebung Kultur RAW264.7 Zellen bei einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 in einem 5 ml Zellkulturkolben mit 1 ml Medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur NIH/3T3-Zellen bei 37 °C und 5% CO2</su...

<ol>
	<li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection.">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li><li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN.">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li><li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection.">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).</li><li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+edge+detection.">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li><li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments.">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022)</li><li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB.">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li><li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation,+tissue+damage+and+organ+injury.">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li><li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis.">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).</li><li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides.">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022)</li><li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+invariant+circle+detection.">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li><li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Do&#287;an, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-analysis+based+readout+method+for+biochip:+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads,+micropads+and+patient+leukemia+cell.">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863 (2020).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images.">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li><li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity.">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).</li><li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts.">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li><li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing:+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes.">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li><li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalizing+cell+segmentation+and+quantification.">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).</li><li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index.">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li></ol>

Wir haben ein allgemeines flächenbasiertes Verfahren entwickelt, das Zellen auf der Grundlage der Zellgröße genau und effizient zählt und so eine fleckenfreie Quantifizierung von Zellen auch in Kokultursystemen ermöglicht. Kritische Schritte für dieses Verfahren waren die Implementierung eines relativen Intensitätssystems, mit dem Zellen differenziert werden konnten. Die Verwendung einer relativen Höhenanalyse diente zwei Zwecken: Die Notwendigkeit externer Parameter wurde überflüssig, da die relativen Paramete...

Software wird routinemäßig während der Bildanalysetechniken implementiert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse genau, effizient und unvoreingenommen sind. Bei zellbasierten Assays ist ein häufiges Problem die Fehlidentifizierung von Zellen. Bilder mit falschen Fokus- und Kontrasteinstellungen können zu Zellunschärfe führen, bei der die Grenze einzelner Zellen schwer zu identifizieren ist1. Das Vorhandensein von Fremdbildmerkmalen wie Poren, Blasen oder anderen unerwünschten Objekten kann die Zählvorgänge behindern, indem es den Zählvorgang verlangsamt und zu einer falschen Identifizierung führt. Darüber hinaus kann das Zählen von Zellen mühsam sein, und das Zählen von Hunderten von Replikaten kann äußerst zeitaufwendig sein. Darüber hinaus besteht während der manuellen Zählung eine inhärente subjektive Verzerrung, und daher ist die Entscheidungsfindung in Bezug auf die Zellidentifizierung oft ungenau2. Automatisierte Software bietet ein aufregendes Potenzial, all diese Probleme zu umgehen, indem Zellen schnell und präzise von Fremdobjekten unterschieden werden, einschließlich Objekten, die weit über die menschlichen Fähigkeiten zur präzisen Erkennung hinausgehen, basierend auf klar definierten Identifikationskriterien, die den Einfluss von Investigator Bias reduzieren. Gängige Techniken zur Identifizierung von Zellen mit automatisierter Software umfassen zwei Hauptmethoden: Segmentierung und Schwellenwert3. Hierin demonstrieren wir ein generalisierbares flächenbasiertes Protokoll, das eine schnelle, genaue und kostengünstige Zellzählung innerhalb eines allgemein zugänglichen Software-Frameworks ermöglicht.
Segmentierungstechniken, wie die Kantenerkennung, versuchen, einzelne Zellen zu isolieren, indem Intensitätsunterschiede innerhalb eines Bildes genutzt werden. Intensitätsänderungen, die eine Zelle vom Rest des Bildes unterscheiden, bestehen meistens aus scharfen Helligkeitsänderungen4. Die Kantenerkennung umfasst einen Regularisierungsfilterschritt, gefolgt von einem Differenzierungsschritt, in dem Intensitätsänderungen erkannt werden. Der Differenzierungsprozess identifiziert Kanten und Konturen innerhalb des Bildes von hochintensiven Veränderungen, und diese Kanten und Konturen korrelieren mit der Zellpräsenz. Obwohl Bilder mit Rauschen durch Rauschalgorithmen4 ausgeführt werden können, werden Kantenerkennungstechniken idealerweise für die Analyse von Bildern mit geringem Hintergrundrauschen verwendet. Der Prozess funktioniert optimal, wenn Zellgrenzen klar und leicht unterscheidbar sind und nicht durch Helligkeitskonturen behindert werden, die nichts mit Zellpräsenz, Zellunschärfe, Fremdobjekten oder definierten internen Zellstrukturen zu tunhaben 1,2. Wenn ein Bild besonders verrauscht ist, können Zellen durch fluoreszierende Färbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen weiter unterschiedenwerden 2,5. Obwohl dies die Genauigkeit der Segmentierungstechniken erheblich verbessert, erfordert dies zusätzliche Kosten und zusätzliche Zeitinvestitionen, um Zellkulturen für die Bildgebung vorzubereiten.
Schwellenwerttechniken beinhalten die Unterteilung eines Bildes in zwei Kategorien: den Vordergrund und den Hintergrund, wobei Zellen dem Vordergrundzugewiesen sind 3. Diese Techniken verwenden Farb- / Kontraständerungen, um die scheinbare Höhe eines Objekts zu definieren. Objekte, die routinemäßig "höher" sind als der Hintergrund, können leicht als Zellen identifiziert werden. Die Wasserscheiden-Transformation funktioniert auf diese Weise, indem sie Oberflächen mit hellen Pixeln als Vordergrund und solchen mit dunklen Pixelnals Hintergrund 6,7 assoziiert. Durch höhenbasierte Identifizierung können Schwellentechniken routinemäßig Geräusche von gewünschten Objekten unterscheiden, vorausgesetzt, sie befinden sich innerhalb derselben Brennebene. In Kombination mit einer flächenbasierten Quantifizierung kann eine Wassereinzugsgebietstransformation Gruppen von Objekten in Umgebungen genau identifizieren, in denen typische Segmentierungstechniken wie die Kantenerkennung ungenau wären.
Wasserscheiden-Transformationen werden üblicherweise mit Segmentierungstechniken gekoppelt, um Bilder für eine sauberere Analyse vorzubereiten, was zu einer höheren Genauigkeit der Zellzählung führt. Für diesen Prozess wird die Wassereinzugsgebietstransformation verwendet, um potenzielle Regionen von Interesse vor der Segmentierung hervorzuheben. Eine Wasserscheidentransformation bietet einzigartige Vorteile, indem sie Zellen im Vordergrund von Bildern identifiziert, was die Genauigkeit der Segmentierungsanalyse verbessern kann, indem potenzielle Fehlalarme für Zellen entfernt werden, z. B. ungleichmäßige Hintergrundflecken. Schwierigkeiten können jedoch auftreten, wenn versucht wird, zellbasierte Bilder an eine Wasserscheide-Transformation anzupassen. Bilder mit hoher Zelldichte können mit Untersegmentierung geplagt werden, bei der Aggregate von Zellen als singuläre Gruppe und nicht als einzelne Komponenten identifiziert werden. Das Vorhandensein von Rauschen oder starken Intensitätsänderungen kann auch zu einer Übersegmentierung führen, bei der der Algorithmus die Zellen überisoliert, was zu übermäßigen und ungenauen Zellzahlenführt 8.
Hierin beschreiben wir eine Methode zur Minimierung der primären Nachteile der Wassereinzugsgebietstransformation, indem Komponenten einer Schwellenwertanalyse in einen flächenbasierten Quantifizierungsalgorithmus integriert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Insbesondere wurde dieser Algorithmus mit Open-Source- und / oder weit verbreiteter Software implementiert, und die Anwendung dieses Zellzähl-Frameworks war ohne teure Reagenzien oder komplexe Zellpräparationstechniken möglich. RAW264.7-Makrophagen wurden verwendet, um die Methode aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Regulierung der Bindegewebserhaltung und der Wundheilungsprozessezu demonstrieren 9. Darüber hinaus wurden NIH/3T3-Fibroblasten aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Erhaltung und Reparatur von Gewebe analysiert. Fibroblastenzellen koexistieren oft mit Makrophagen und unterstützen sie, was die Notwendigkeit erzeugt, diese phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen in Kokulturstudien zu unterscheiden.
Zellzahlen aus Bildern mit hoher lebensfähiger Zelldichte (VCD) konnten zuverlässig und effizient quantifiziert werden, indem die von den Zellen abgedeckte Fläche und die durchschnittliche Fläche einer einzelnen Zelle berechnet wurden. Die Verwendung von Schwellenwerten im Gegensatz zur Segmentierung für die Zellidentifikation ermöglichte auch komplexere Analysen, wie z.B. Experimente, in denen verschiedene Zelltypen in Kokulturen gleichzeitig analysiert wurden. Es wurde festgestellt, dass NIH / 3T3-Fibroblasten, die häufig mit RAW264.7-Makrophagen innerhalb einer Wundheilungsstelle kolokalisieren, auf einer fokalen Ebene wachsen, die sich von der fokalen Ebene von Makrophagen10 unterscheidet. Dementsprechend wurden mehrere Schwellenwertalgorithmen ausgeführt, um den Hintergrund und den Vordergrund in Abhängigkeit vom analysierten Zelltyp zu definieren, was eine genaue Zählung von zwei verschiedenen Zelltypen innerhalb desselben Bildes ermöglicht.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer 7 Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>1028290770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12430047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL - 1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB - 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3814-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures

Die Quantifizierung von Zellen ist für eine Vielzahl von biologischen und biochemischen Studien notwendig. Die konventionelle Bildanalyse von Zellen verwendet typischerweise entweder Fluoreszenzdetektionsansätze wie Immunfluoreszenzfärbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen oder Kantendetektionstechniken, die aufgrund von Rauschen und anderen Nicht-Idealitäten im Bildhintergrund oft fehleranfällig sind. 
Wir haben einen neuen Algorithmus entwickelt, der Makrophagen und Fibroblasten, Zellen verschiedener Phänotypen, die oft während der Geweberegeneration kolokalisieren, genau zählen und unterscheiden kann. MATLAB wurde verwendet, um den Algorithmus zu implementieren, der verschiedene Zelltypen basierend auf Höhenunterschieden vom Hintergrund unterscheidet. Ein primärer Algorithmus wurde unter Verwendung einer flächenbasierten Methode entwickelt, um Variationen in der Zellgröße / -struktur und die Bedingungen für die Aussaat mit hoher Dichte zu berücksichtigen. 
Nicht-Idealitäten in Zellstrukturen wurden mit einem sekundären, iterativen Algorithmus berücksichtigt, der interne Parameter wie die Zellbedeckung verwendet, die unter Verwendung experimenteller Daten für einen bestimmten Zelltyp berechnet wurde. Schließlich wurde eine Analyse der Kokulturumgebungen mit einem Isolationsalgorithmus durchgeführt, bei dem verschiedene Zelltypen selektiv ausgeschlossen wurden, basierend auf der Bewertung der relativen Höhenunterschiede innerhalb des Bildes. Es wurde festgestellt, dass dieser Ansatz Zellen innerhalb einer Fehlerspanne von 5% für monokultivierte Zellen und innerhalb einer Fehlerspanne von 10% für kokultivierte Zellen genau zählt.

Die Analyse von nicht-bauchigen RAW264.7-Makrophagen wurde in einer Monokulturumgebung bei 25.000 Zellen/cm2 durchgeführt. Repräsentative Bilder der Zellkultur wurden aufgenommen und in MATLAB nach der Konvertierung in 8-Bit-Tiff in ImageJ verarbeitet. Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 2 für das repräsentative Bild dokumentiert. In diesem Bild zählte der Algorithmus 226 Zellen, und diese Bildanzahl wurde durch Vergleich ...

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Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Diese Methode kann verwendet werden, um Forschern zu helfen, Co-Kulturen von Zellen mit einer einfachen und effektiven flächenbasierten Analyse zu analysieren und zu zählen. Diese Technik ist mit weit verbreiteter Software relativ einfach zu implementieren und bietet ein zuverlässiges und genaues Mittel zur Identifizierung verschiedener Zelltypen innerhalb einer Kokulturumgebung. Diese Methode kann Aufschluss darüber geben, wie spezifische Co-Kulturen von Zellen synergisieren, um die Geweberegeneration zu unterstützen.Diese Methode kann auch zur Validierung von Monokultur-Biomarker-Studien eingesetzt werden. Zu Beginn kultivieren rohe 264,7 Makrophagen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für die Monokulturbildgebung in einem Milliliter DMEM, ergänzt mit FBS, Penicillin-Streptomycin, Natriumbicarbonat und Beta-Mercaptoethanol in einem Fünf-Milliliter-Zellkulturkolben bei einer Dichte von 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter. Kultur NIH / 3T3-Zellen in DMEM ergänzt mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin.Für die Kokulturbildgebung werden rohe 264,7-Makrophagen und NIH/3T3-Fibroblasten unter Verwendung von Kokulturmedium verwendet, das einen Teil rohes 264,7-Medium und einen Teil NIH/3T3-Medium zusammen bei unterschiedlichen Verhältnissen und einer Gesamtdichte von 25.000 Zellen pro Quadratzentimeter enthält. Nach der Aussaat inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, um eine lebensfähige Zelldichte von 80% Zellzusammenfluss zu erreichen. Um Zellbilder mit einem inversen Mikroskop zu erfassen, das mit dem 40X-Objektiv ausgestattet ist, bestimmen Sie die Fähigkeit des Algorithmus, Bilder mit einer Reihe von Bildqualitäten genau auszuwerten.Erfassen Sie Bilder in Graustufen mit unterschiedlichen Schwerpunkten, um sowohl Nicht-Bulbus- als auch Bulbus-Bilder zu erzeugen, und exportieren Sie sie in die Czi-Rohdatei. Um Bilder von Zellen mit der flächenbasierten Methode zu erhalten, kopieren Sie die Bilddatei zur Analyse, fügen Sie sie in den Papierkorb ein und geben Sie den Dateinamen ein, indem Sie den Befehl ausführen. Klicken Sie auf Ausführen, um das Programm zu starten.Analysieren Sie die Bilder durch Öffnen durch Rekonstruktion, gefolgt von Schließen durch Rekonstruktion mit Quellfunktionen, um den Vordergrund aus dem Hintergrund durch Ausführen des jeweiligen Befehls zu vergrößern. Um die rekonstruierten Bilder unter Verwendung eines perzentilbasierten Identifikationssystems zu binarisieren, unterscheiden Sie die Zellen vom Hintergrund, indem Sie eine Perzentildifferenz von dem maximal relevanten Pixel mit dem größten Pixelwert verwenden, der mindestens 0,5% eines bestimmten Bildes ausmacht. Analysieren und bewerten Sie die Pixelwerte für unformatierte 264.7-Makrophagen und stellen Sie sicher, dass die Werte innerhalb von 4,5% des maximal relevanten Pixels liegen.Markieren Sie dann das Pixel als zellulär. Implementieren Sie für Bilder, die Bulbus-Zellprofile enthalten, ein iteratives Verfahren, um eine fehlerhafte Binarisierung in den Zentren der Zellen zu korrigieren. Bestimmen Sie eine erste Schätzung für die gesamte Zellabdeckung.Führen Sie den Algorithmus aus und analysieren Sie Bilder mit ersten Schätzungen von Alpha und Kappa, um einen Teil der Inseln zu füllen. Verwenden Sie dann die Zellzahlen und die Abdeckung nach der Analyse, um kappa neu zu berechnen. Um die durchschnittliche Zellfläche nach der Binarisierung des Bildes zu bestimmen, erhalten Sie einen Vektor aller Mittelpositionen und Radien von Kreisen, die innerhalb des Bildes gefunden wurden, indem Sie den Befehl ausführen.Verwenden Sie die Radienausgänge, um die durchschnittliche Zellfläche durch Mittelung zu berechnen und mindestens 10 Zellen zu analysieren, um eine genaue Flächenbestimmung sicherzustellen. Führen Sie die Bildanalyse mit den zuvor beschriebenen Befehlen durch. Führen Sie dann eine Analyse von Co-Kulturen durch, die rohe 264.7- und NIH / 3T3-Zellen enthalten, indem Sie experimentell einen Parameter phi unter Verwendung von Bildern von rohen 264.7- und NIH / 3T3-Zellen bestimmen.Erraten Sie einen anfänglichen Phi-Wert und iterieren Sie, bis Zellzählung und Abdeckung eng mit den manuellen Zählungen übereinstimmen, die für die rohe 264,7- und NIH / 3T3-Kokultur spezifisch sind. Bestimmen Sie die rohen 264,7 Zellzahlen in der Gesamtzellabdeckung, wie zuvor für die Monokulturbilder beschrieben. Analysieren Sie das transformierte Bild der Wasserscheide erneut ohne den Phi-Parameter und erkennen Sie sowohl Makrophagen als auch Fibroblasten.Erfassen Sie NIH/3T3-Fibroblastendaten durch selektive Subtraktion von rohen 264,7 Zellpixeln, die mit den zuvor beschriebenen Standardschwellenwert- und flächenbasierten Quantifizierungsmethoden erhalten wurden. Es wurde eine Analyse von nicht-bulbus rohen 264,7-Makrophagen durchgeführt und Algorithmusausgaben aufgezeichnet. Durchschnittliche Flächenberechnungen des Bildes mit Algorithmus zählten 226 Zellen, während eine manuelle Zählung 241 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 6% identifizierte.Die durchschnittlichen Flächenberechnungen des Bildes unter Verwendung des Algorithmus zählten 221 Zellen, verifiziert durch eine manuelle Zählung von 252 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 12%Die Analyse von Kokulturen, die sowohl rohe 264,7-Makrophagen als auch NIH / 3T3-Fibroblasten enthielten, wurde durchgeführt. Die Algorithmusausgaben für die rohe Makrophagenzahl von 264,7 betrugen 137, während eine manuelle Zählung 155 Zellen mit einem ungefähren Fehlerwert von 11% identifizierte.Um die Robustheit des Zellzählalgorithmus zu bestimmen, wurden fünf rohe 264,7-Makrophagenbilder durch automatische Zellidentifikation und manuelle Benutzerzählungen gezählt. Der Würfelkoeffizient wurde mit einem durchschnittlichen Parameter von 0,85 über fünf Bilder erhalten.Der entscheidende Schritt innerhalb dieses Protokolls ist die Verwendung von Perzentil-basierten Parametern, die eine robuste Zelldetektion sowohl in Monokultur- als auch in Co-Kultur-Bildern ermöglichen. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Zellen von Interesse für die weitere Analyse unter Verwendung molekularbiologischer Techniken zu identifizieren, um Biomarker zu bewerten, die spezifische Zellpopulationen und die Entwicklung von Biomarkern in Kokultursystemen definieren.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Forschung

Biotechnik

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Mesoskaligen Partikel Image Velocimetry Studien des neurovaskulären fließt In-vitro-

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Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Unterstrukturanalysator: Ein benutzerfreundlicher Workflow für die schnelle Erforschung und genaue Analyse von Zellkörpern in Fluoreszenzmikroskopiebildern

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Bildgebung und Quantifizierung des Bereichs der schnelllebigen Mikroblasen mit einer Hochgeschwindigkeitskamera und Bildanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...