Name: area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

עבודה זו מומנה בחלקה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R01 AR067247) ובחלקה על ידי תוכנית INBRE של דלאוור, הנתמכת על ידי מענק מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים - NIGMS (P20 GM103446) מהמכונים הלאומיים לבריאות ומדינת דלאוור. תוכן כתב היד אינו משקף בהכרח את דעותיהם של הגורמים המממנים.

1. תרבית תאים ורכישת תמונות
<ol><li>תרבית RAW264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 במדיום הנשר המהונדס (DMEM) של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין, 1.5 גרם/ל ליטר נתרן ביקרבונט ו-5 מיקרומטר β-מרקפטואתנול.<ol>
<li>להדמיית מונוקולטורה, תרבית תאי RAW264.7 בצפיפות של 25,000 תא...

<ol>
	<li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection.">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li><li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN.">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li><li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection.">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).</li><li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+edge+detection.">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li><li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments.">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022)</li><li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB.">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li><li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation,+tissue+damage+and+organ+injury.">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li><li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis.">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).</li><li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides.">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022)</li><li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+invariant+circle+detection.">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li><li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Do&#287;an, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-analysis+based+readout+method+for+biochip:+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads,+micropads+and+patient+leukemia+cell.">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863 (2020).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images.">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li><li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity.">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).</li><li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts.">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li><li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing:+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes.">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li><li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalizing+cell+segmentation+and+quantification.">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).</li><li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index.">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li></ol>

תכננו הליך כללי מבוסס שטח שספר תאים באופן מדויק ויעיל על בסיס גובה התא, ומאפשר כמות ללא כתמים של תאים אפילו במערכות קוקולטורה. שלבים קריטיים להליך זה כללו יישום של מערכת עוצמה יחסית שבאמצעותה ניתן היה להתמיין בין תאים. השימוש בניתוח גובה יחסי שירת שתי מטרות: הצורך בפרמטרים חיצוניים הפך למי...

התוכנה מיושמת באופן שגרתי במהלך טכניקות ניתוח תמונה כדי להבטיח שהתוצאות מדויקות, יעילות ובלתי משוחדות. עבור מבחנים מבוססי תאים, בעיה נפוצה היא זיהוי שגוי של תאים. תמונות עם הגדרות מוקד וניגודיות לא נכונות עלולות להוביל לטשטוש תאים, שבו קשה לזהות את הגבול של תאים בודדים1. נוכחות של תכונות תמונה חיצוניות כגון נקבוביות, בועות או עצמים לא רצויים אחרים עלולה לעכב הליכי ספירה על ידי האטת תהליך הספירה ולהוביל לזיהוי שגוי. יתר על כן, ספירת תאים יכולה להיות מכבידה, וספירת מאות שכפולים יכולה לגזול זמן רב. יתר על כן, הטיה סובייקטיבית מובנית קיימת במהלך הספירה הידנית, ולכן קבלת ההחלטות לגבי זיהוי תאים היא לעתים קרובות לא מדויקת2. תוכנה אוטומטית מציעה פוטנציאל מרגש לעקוף את כל הבעיות הללו על ידי הבחנה מהירה ומדויקת של תאים מאובייקטים חיצוניים, כולל עצמים הרבה מעבר ליכולת האנושית לזיהוי מדויק, בהתבסס על קריטריוני זיהוי מוגדרים היטב המפחיתים את ההשפעה של הטיית החוקרים. טכניקות נפוצות לזיהוי תאים באמצעות תוכנה אוטומטית כוללות שתי שיטות עיקריות: פילוח וסף3. בהמשך אנו מדגימים פרוטוקול מבוסס-שטח הניתן להכללה, המאפשר ספירת תאים מהירה, מדויקת וזולה במסגרת תוכנה נגישה באופן נרחב.
טכניקות סגמנטציה, כגון זיהוי קצה, מבקשות לבודד תאים בודדים על ידי שימוש בהבדלי עוצמה בתוך התמונה. שינויי עוצמה המבדילים תא משאר התמונה מורכבים לרוב משינויים חדים בבהירות4. זיהוי קצה כולל שלב סינון רגולרי, ואחריו שלב הבחנה שבו מתגלים שינויי עוצמה. תהליך ההתמיינות מזהה קצוות וקווי מתאר בתוך התמונה של שינויים בעוצמה גבוהה, וקצוות וקווי מתאר אלה מתואמים עם נוכחות התא. למרות שניתן להריץ תמונות עם רעש באמצעות אלגוריתמים המציינים4, טכניקות זיהוי קצה משמשות באופן אידיאלי לניתוח תמונות עם רעשי רקע נמוכים. התהליך מתפקד בצורה אופטימלית כאשר גבולות התא ניתנים להבחנה ברורה וקלה ואינם מונעים על ידי קווי מתאר של בהירות שאינם קשורים לנוכחות תאים, טשטוש תאים, עצמים חיצוניים או מבני תאים פנימיים מוגדרים 1,2. אם תמונה רועשת במיוחד, ניתן להבחין עוד יותר בתאים באמצעות צביעה פלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים 2,5. למרות שזה משפר באופן משמעותי את הדיוק של טכניקות סגמנטציה, זה דורש עלויות נוספות והשקעות זמן נוספות כדי להכין תרביות תאים להדמיה.
טכניקות סף כוללות חלוקה של תמונה לשתי קטגוריות: החזית והרקע, כאשר התאים מוקצים לחזית3. טכניקות אלה משתמשות בשינויי צבע/ניגודיות כדי להגדיר את הגובה הנראה לעין של אובייקט; אובייקטים שהם באופן שגרתי 'גבוהים' יותר מהרקע ניתנים לזיהוי בקלות כתאים. שינוי קו פרשת המים פועל בדרך זו על ידי שיוך משטחים עם פיקסלים בהירים כחזית ואלה עם פיקסלים כהים כרקע 6,7. באמצעות זיהוי מבוסס גובה, טכניקות סף יכולות להבחין באופן שגרתי בין רעש לאובייקטים רצויים, בתנאי שהם קיימים באותו מישור מוקד. בשילוב עם כימות מבוסס שטח, שינוי קו פרשת מים יכול לזהות במדויק קבוצות של עצמים בסביבות שבהן טכניקות סגמנטציה טיפוסיות כגון זיהוי קצה יהיו לא מדויקות.
טרנספורמציות של קו פרשת המים משולבות בדרך כלל עם טכניקות סגמנטציה כדי להכין תמונות לניתוח נקי יותר, והתוצאה היא דיוק גבוה יותר של ספירת תאים. עבור תהליך זה, שינוי קו פרשת המים משמש להדגשת אזורי עניין פוטנציאליים לפני הפילוח. התמרת קו פרשת המים מספקת יתרונות ייחודיים על-ידי זיהוי תאים בחזית התמונות, מה שיכול לשפר את הדיוק של ניתוח סגמנטציה על-ידי הסרת תוצאות חיוביות שגויות פוטנציאליות עבור תאים, כגון כתמי רקע לא אחידים. עם זאת, קשיים יכולים להתעורר כאשר מנסים להתאים תמונות מבוססות תאים לשינוי קו פרשת המים. תמונות עם צפיפות תאים גבוהה עלולות להיות נגועות בתת-סגידה, שבה אגרגטים של תאים מזוהים כקבוצה סינגולרית ולא כמרכיבים בודדים. נוכחות של רעש או שינויי עוצמה חדים יכולה גם לגרום לטענת יתר, שבה האלגוריתם מרחיב את התאים יתר על המידה, וכתוצאה מכך ספירת תאים מוגזמת ולא מדויקת8.
בהמשך, אנו מפרטים שיטה למזער את החסרונות העיקריים של התמרת קו פרשת המים על ידי שילוב רכיבים של ניתוח סף בתוך אלגוריתם כימות מבוסס שטח, כפי שמתואר באיור 1. יש לציין כי אלגוריתם זה יושם עם תוכנות קוד פתוח ו/או זמינות באופן נרחב, ויישום של מסגרת ספירת תאים זו התאפשר ללא ריאגנטים יקרים או טכניקות מורכבות להכנת תאים. מקרופאגים RAW264.7 שימשו להדגמת השיטה בשל תפקידם הקריטי בוויסות תחזוקת רקמות חיבור ותהליכי ריפוי פצעים9. בנוסף, פיברובלסטים NIH/3T3 נותחו בשל תפקידם המרכזי בתחזוקה ותיקון של רקמות. תאים פיברובלסטים מתקיימים לעתים קרובות יחד עם מקרופאגים ותומכים בהם, מה שיוצר את הצורך להבחין בין סוגי תאים מובחנים פנוטיפיים אלה במחקרי קוקולטורה.
ניתן לכמת את ספירת התאים מתמונות בעלות צפיפות תאים בת קיימא גבוהה (VCD) באופן אמין ויעיל על-ידי חישוב השטח המכוסה על-ידי התאים, והאזור הממוצע שתופס תא יחיד. השימוש בסף לעומת סגמנטציה לזיהוי תאים איפשר גם ניתוחים מורכבים יותר, כגון ניסויים שבהם נותחו סוגי תאים שונים בקוקולטורות במקביל. פיברובלסטים NIH/3T3, שלעתים קרובות נמצא כי הם מתמזגים עם מקרופאגים RAW264.7 בתוך אתר ריפוי פצעים, נמצאו כמיגדלים במישור מוקד שהיה נבדל ממישור המוקד של המקרופאגים10. בהתאם לכך, הופעלו מספר אלגוריתמי סף כדי להגדיר את הרקע והחזית בהתאם לסוג התא המנותח, מה שמאפשר ספירה מדויקת של שני סוגי תאים שונים בתוך אותה תמונה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer 7 Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>1028290770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12430047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL - 1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB - 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3814-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures

כימות התאים נחוץ למגוון רחב של מחקרים ביולוגיים וביוכימיים. ניתוח תמונה קונבנציונלי של תאים משתמש בדרך כלל בגישות לזיהוי פלואורסצנטי, כגון צביעה אימונופלואורסצנטית או טרנספקציה עם חלבונים פלואורסצנטיים או טכניקות לזיהוי קצה, שלעתים קרובות מועדות לשגיאות עקב רעש ואי-אידיאליות אחרות ברקע התמונה. 
תכננו אלגוריתם חדש שיכול לספור ולהבחין במדויק מקרופאגים ופיברובלסטים, תאים בעלי פנוטיפים שונים שלעתים קרובות קולוקליים במהלך התחדשות רקמות. MATLAB שימש ליישום האלגוריתם, אשר הבדיל בין סוגי תאים נפרדים בהתבסס על הבדלי גובה מהרקע. אלגוריתם ראשוני פותח בשיטה מבוססת שטח כדי להסביר שינויים בגודל/מבנה התא ובתנאי זריעה בצפיפות גבוהה. 
אי-אידיאליות במבני תאים נלקחה בחשבון באמצעות אלגוריתם משני, איטרטיבי, המשתמש בפרמטרים פנימיים כגון כיסוי תאים המחושב באמצעות נתונים ניסיוניים עבור סוג תא נתון. לבסוף, ניתוח של סביבות קוקולטורה בוצע באמצעות אלגוריתם בידוד שבו סוגי תאים שונים לא נכללו באופן סלקטיבי על סמך הערכה של הבדלי גובה יחסיים בתוך התמונה. נמצא כי גישה זו סופרת במדויק תאים בתוך מרווח שגיאה של 5% עבור תאים חד-תרבותיים ובתוך מרווח שגיאה של 10% עבור תאים קוקולטורים.

ניתוח של מקרופאגים RAW264.7 שאינם בולבוסיים נערך במסגרת מונוקולטורה של 25,000 תאים/ס"מ2. תמונות מייצגות צולמו של תרבית התאים ועובדו ב- MATLAB לאחר המרה ל- tiff של 8 סיביות ב- ImageJ. פלטי האלגוריתם לאורך כל התהליך תועדו ותועדו באיור 2 עבור התמונה המייצגת. בתמונה זו, האלגוריתם ספר 226 תאי?...

Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

אנו מציגים שיטה, המשתמשת בגישת ניתוח תמונות מבוססת שטח הניתנת להכללה כדי לזהות את ספירת התאים. ניתוח של אוכלוסיות תאים שונות ניצל את ההבדלים המשמעותיים בגובה התא ובמבנה בין סוגי תאים שונים בתוך אלגוריתם אדפטיבי.

אלגוריתם ניתוח תמונה מבוסס אזור לכימות של קוקולטורות מקרופאגים-פיברובלסטים

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

שיטה זו יכולה לשמש כדי לסייע לחוקרים לנתח ולספור תרביות משותפות של תאים באמצעות ניתוח פשוט ויעיל המבוסס על שטח. טכניקה זו קלה יחסית ליישום באמצעות תוכנה זמינה באופן נרחב ומציעה אמצעי אמין ומדויק לזיהוי סוגי תאים שונים במסגרת תרבית משותפת. שיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי האופן שבו תרביות משותפות ספציפיות של תאים משתלבות כדי לסייע בהתחדשות רקמות.ניתן להשתמש בשיטה זו גם כדי לאמת מחקרי סמנים ביולוגיים של מונוקולטורה. בתור התחלה, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני להדמיית מונוקולטורה במיליליטר אחד של DMEM בתוספת FBS, פניצילין-סטרפטומיצין, נתרן ביקרבונט ובטא-מרקפטואתנול בבקבוקון תרבית תאים של חמישה מיליליטר בצפיפות של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. תאי NIH/3T3 תרבית ב-DMEM בתוספת 10% FBS ו-1%פניצילין-סטרפטומיצין.עבור הדמיה של תרבית משותפת, תרבית גולמית 264.7 מקרופאגים ופיברובלסטים NIH/3T3 באמצעות מדיום תרבית משותפת המכיל חלק אחד גולמי 264.7 בינוני וחלק אחד NIH/3T3 בינוני יחד ביחסים מגוונים וצפיפות כוללת של 25, 000 תאים לסנטימטר מרובע. לאחר הזריעה, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני כדי להגיע לצפיפות תאים בת קיימא של 80% מפגש תאים. כדי להשיג תמונות של תאים באמצעות מיקרוסקופ הפוך המצויד במטרה של 40X, קבע את יכולת האלגוריתם להעריך במדויק תמונות עם טווח של איכויות תמונה.רכשו תמונות בקנה מידה אפור עם מוקדים משתנים המייצרים תמונות שאינן בולבוס ובולבוס וייצאו אותן לקובץ czi הגולמי. כדי לקבל תמונות של תאים באמצעות השיטה מבוססת האזור, העתק והדבק את קובץ התמונה לניתוח לתוך הסל והזן את שם הקובץ על-ידי ביצוע הפקודה. לחץ על הפעל כדי להפעיל את התוכנית.נתח את התמונות על ידי פתיחה על ידי שחזור, ולאחר מכן סגירה על ידי שחזור באמצעות פונקציות מקור כדי להגדיל את החזית מהרקע על ידי ביצוע הפקודה המתאימה. כדי ליצור בינאריזציה של התמונות המשוחזרות באמצעות מערכת זיהוי מבוססת אחוזון, יש להבחין בין תאים לרקע על-ידי שימוש בהפרש אחוזונים מהפיקסל הרלוונטי המרבי, כאשר ערך הפיקסל הגדול ביותר מהווה לפחות 0.5% מתמונה נתונה. נתח והערך את ערכי הפיקסלים עבור מקרופאגים גולמיים של 264.7, כדי לוודא שהערכים נמצאים בטווח של 4.5% מהפיקסל הרלוונטי המרבי.לאחר מכן סמן את הפיקסל כסלולרי. עבור תמונות המכילות פרופילים של תאי בולבוס, יש ליישם הליך איטרטיבי לתיקון עבור בינאריזציה שגויה במרכזי התאים. קבע ניחוש ראשוני עבור כיסוי התא הכולל.הפעל את האלגוריתם ונתח תמונות באמצעות הערכות ראשוניות של אלפא וקפה כדי למלא חלק מהאיים. לאחר מכן השתמש בספירת התאים לאחר הניתוח ובכיסוי כדי לחשב מחדש את הקאפה. כדי לקבוע את שטח התא הממוצע לאחר בינאריזציה של התמונה, קבל וקטור של כל מיקומי המרכז ורדי של מעגלים שנמצאים בתוך התמונה על ידי ביצוע הפקודה.השתמש ביציאות הרדידי כדי לחשב את שטח התא הממוצע על ידי ממוצע ולנתח לפחות 10 תאים כדי להבטיח זיהוי מדויק של האזור. בצע את ניתוח התמונה באמצעות הפקודות כמתואר קודם לכן. לאחר מכן ערכו ניתוח של תרביות משותפות המכילות תאים גולמיים 264.7 ו-NIH/3T3 על ידי קביעה ניסיונית של פרמטר phi באמצעות תמונות של תאים גולמיים 264.7 ו-NIH/3T3.נחשו ערך phi ראשוני וחוזרים על עצמם עד שספירת התאים והכיסוי תואמים באופן הדוק את הספירות הידניות הספציפיות לתרבית המשותפת הגולמית 264.7 ו-NIH/3T3. קבע ספירת תאים גולמית של 264.7 בכיסוי התא הכולל כפי שתואר קודם לכן עבור תמונות המונוקולטורה. נתחו שוב את התמונה שעברה שינוי קו פרשת המים ללא הפרמטר phi, וזיהו גם מקרופאגים וגם פיברובלסטים.רכוש נתונים פיברובלסטים של NIH/3T3 על-ידי חיסור סלקטיבי של 264.7 פיקסלים גולמיים של תאים שהתקבלו באמצעות שיטות הסף והכימות מבוססות השטח הסטנדרטיות שתוארו קודם לכן. בוצע ניתוח של מקרופאגים גולמיים שאינם בולבוס 264.7 ותועדו פלטי אלגוריתמים. חישובי שטח ממוצעים של התמונה באמצעות אלגוריתם ספרו 226 תאים, בעוד שספירה ידנית זיהתה 241 תאים עם ערך שגיאה משוער של 6% ניתוח של בולבוס גולמי 264.7 מקרופאגים בוצע גם כן.חישובי השטח הממוצעים של התמונה באמצעות האלגוריתם ספרו 221 תאים, שאומתו על ידי ספירה ידנית של 252 תאים עם ערך שגיאה משוער של 12%ניתוח של תרביות משותפות המכילות הן מקרופאגים גולמיים של 264.7 והן פיברובלסטים של NIH/3T3 נערך. פלטי האלגוריתם עבור ספירת המקרופאגים הגולמית של 264.7 היו 137, בעוד שספירה ידנית זיהתה 155 תאים עם ערך שגיאה משוער של 11% כדי לקבוע את חוסנו של אלגוריתם ספירת התאים, חמש תמונות גולמיות של 264.7 מקרופאג'ים נספרו על ידי זיהוי תאים אוטומטי וספירת משתמשים ידנית. מקדם הקוביות התקבל בפרמטר ממוצע של 0.85 על פני חמש תמונות.השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא השימוש בפרמטרים מבוססי אחוזון המאפשרים זיהוי תאים חזק הן במונוקולטורה והן בתמונות של תרבית משותפת. פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי תאים בעלי עניין לניתוח נוסף באמצעות טכניקות ביולוגיה מולקולרית כדי להעריך סמנים ביולוגיים המגדירים אוכלוסיות תאים ספציפיות ופיתוח סמנים ביולוגיים במערכות של תרביות משותפות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

Microarrays פולימר לגילוי תפוקה גבוהה של Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

הדמיה אופטית של תחום תדר<em&gt; גופיים</em&gt; דוגמאות כריתת ריאה: קבלת תמונה אחד לאחד למתאם היסטופתולוגיה

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

כימות של פונקציה הגלובלית הדיאסטולי על ידי ניתוח המבוסס על דוגמנות Kinematic של Transmitral זרימה באמצעות הפורמליזם מילוי Parametrized הדיאסטולי

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

הדמיה μCT-FMT היברידי וניתוח תמונה

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-גודל החלקיקים תמונה Velocimetry מחקרים של נוירו-וסקולריים זורם במבחנה

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

מנתח מבנה משנה: זרימת עבודה ידידותית למשתמש לחקר מהיר וניתוח מדויק של גופים סלולריים בתמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטית

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

הדמיה וכמות של האזור של מיקרו-bubbles הנע במהירות באמצעות מצלמה במהירות גבוהה וניתוח תמונה

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...