Name: area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal National Institutes of Health (R01 AR067247) e in parte dal programma Delaware INBRE, supportato da una sovvenzione del National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) del National Institutes of Health e dello Stato del Delaware. Il contenuto del manoscritto non riflette necessariamente le opinioni delle agenzie di finanziamento.

1. Coltura cellulare e acquisizione di immagini
<ol><li>Coltura di macrofagi RAW264.7 a 37 °C e 5% CO2 nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina, 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 5 μM di β-mercaptoetanolo.<ol>
<li>Per l'imaging in monocoltura, coltivare cellule RAW264.7 ad una densità di 25.000 cellule/cm2 in un pallone di coltura cellulare da 5 ml con 1 mL di terreno.</li>
	</ol>
</li>
	<...

<ol>
	<li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection.">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li><li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN.">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li><li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection.">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).</li><li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+edge+detection.">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li><li>Fuller, M. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index.">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li></ol>

Abbiamo progettato una procedura generale basata sull'area che contava in modo accurato ed efficiente le cellule sulla base dell'altezza delle cellule, consentendo una quantificazione senza macchie delle cellule anche nei sistemi di cocoltura. I passaggi critici per questa procedura includevano l'implementazione di un sistema di intensità relativa mediante il quale le cellule potevano essere differenziate. L'uso di un'analisi dell'altezza relativa serviva a due scopi: la necessità di parametri esterni era resa superflu...

Il software viene regolarmente implementato durante le tecniche di analisi delle immagini per garantire che i risultati siano accurati, efficienti e imparziali. Per i saggi basati su cellule, un problema comune è l'errata identificazione delle cellule. Le immagini con impostazioni focali e di contrasto improprie possono portare alla sfocatura delle cellule, in cui il confine delle singole cellule diventa difficile da identificare1. La presenza di caratteristiche dell'immagine estranee come pori, bolle o altri oggetti indesiderati può ostacolare le procedure di conteggio rallentando il processo di conteggio e portando a un'errata identificazione. Inoltre, il conteggio delle cellule può essere oneroso e il conteggio di centinaia di repliche può richiedere molto tempo. Inoltre, esiste un pregiudizio soggettivo intrinseco durante il conteggio manuale, e quindi il processo decisionale relativo all'identificazione delle cellule è spesso impreciso2. Il software automatizzato offre un potenziale entusiasmante per aggirare tutti questi problemi differenziando rapidamente e con precisione le cellule da oggetti estranei, compresi gli oggetti ben oltre la capacità umana di rilevamento preciso, sulla base di criteri di identificazione ben definiti che riducono l'influenza del pregiudizio dello sperimentatore. Le tecniche comuni per identificare le cellule utilizzando software automatizzati coinvolgono due metodi principali: segmentazione e soglia3. Qui, dimostriamo un protocollo generalizzabile basato sull'area che consente un conteggio delle celle rapido, accurato ed economico all'interno di un framework software ampiamente accessibile.
Le tecniche di segmentazione, come il rilevamento dei bordi, cercano di isolare le singole cellule utilizzando le differenze di intensità all'interno di un'immagine. I cambiamenti di intensità che distinguono una cella dal resto dell'immagine consistono più spesso in cambiamenti nitidi nella luminosità4. Il rilevamento dei bordi comporta una fase di filtraggio regolarizzante, seguita da una fase di differenziazione in cui vengono rilevate variazioni di intensità. Il processo di differenziazione identifica bordi e contorni all'interno dell'immagine di cambiamenti ad alta intensità e questi bordi e contorni sono correlati alla presenza cellulare. Sebbene le immagini con rumore possano essere eseguite tramite algoritmi di denoising4, le tecniche di rilevamento dei bordi sono idealmente utilizzate per analizzare immagini con basso rumore di fondo. Il processo funziona in modo ottimale quando i confini delle cellule sono chiaramente e facilmente distinguibili e non sono ostacolati da contorni di luminosità non correlati alla presenza cellulare, alla sfocatura cellulare, agli oggetti estranei o alle strutture cellulari interne definite 1,2. Se un'immagine è particolarmente rumorosa, le cellule possono essere ulteriormente distinte attraverso la colorazione fluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti 2,5. Sebbene ciò migliori significativamente l'accuratezza delle tecniche di segmentazione, richiede costi aggiuntivi e ulteriori investimenti di tempo per preparare le colture cellulari per l'imaging.
Le tecniche di soglia prevedono la divisione di un'immagine in due categorie: il primo piano e lo sfondo, con celle assegnate al primo piano3. Queste tecniche utilizzano cambiamenti di colore / contrasto per definire l'altezza apparente di un oggetto; gli oggetti che sono abitualmente "più alti" dello sfondo possono essere facilmente identificati come celle. La trasformazione spartiacque funziona in questo modo associando superfici con pixel chiari come primo piano e quelle con pixel scuri come sfondo 6,7. Attraverso l'identificazione basata sull'altezza, le tecniche di soglia possono regolarmente distinguere il rumore dagli oggetti desiderati, a condizione che esistano all'interno dello stesso piano focale. Se abbinata a una quantificazione basata sull'area, una trasformazione spartiacque può identificare con precisione gruppi di oggetti in ambienti in cui le tecniche di segmentazione tipiche come il rilevamento dei bordi sarebbero imprecise.
Le trasformazioni spartiacque sono comunemente accoppiate con tecniche di segmentazione per preparare le immagini per un'analisi più pulita, con conseguente maggiore precisione del conteggio delle cellule. Per questo processo, la trasformazione spartiacque viene utilizzata per evidenziare potenziali regioni di interesse prima della segmentazione. Una trasformazione spartiacque offre vantaggi unici identificando le cellule in primo piano delle immagini, che possono migliorare l'accuratezza dell'analisi di segmentazione rimuovendo potenziali falsi positivi per le cellule, come macchie irregolari di sfondo. Tuttavia, possono sorgere difficoltà quando si tenta di adattare le immagini basate su cellule a una trasformazione spartiacque. Le immagini con alta densità cellulare possono essere afflitte da sottosegmentazione, in cui aggregati di cellule sono identificati come un gruppo singolare piuttosto che come singoli componenti. La presenza di rumore o bruschi cambiamenti di intensità può anche causare sovrasegmentazione, in cui l'algoritmo sovraisola le cellule, con conseguente conteggio eccessivo e impreciso delle cellule8.
Qui, descriviamo in dettaglio un metodo per ridurre al minimo gli svantaggi primari della trasformazione spartiacque incorporando componenti di un'analisi di soglia all'interno di un algoritmo di quantificazione basato sull'area, come illustrato nella Figura 1. In particolare, questo algoritmo è stato implementato con software open source e / o ampiamente disponibile e l'applicazione di questo framework di conteggio delle cellule è stata possibile senza costosi reagenti o complesse tecniche di preparazione cellulare. I macrofagi RAW264.7 sono stati utilizzati per dimostrare il metodo a causa del loro ruolo critico nella regolazione del mantenimento del tessuto connettivo e dei processi di guarigione delle ferite9. Inoltre, i fibroblasti NIH / 3T3 sono stati analizzati a causa del loro ruolo chiave nella manutenzione e riparazione dei tessuti. Le cellule dei fibroblasti spesso coesistono e supportano i macrofagi, generando la necessità di distinguere questi tipi di cellule fenotipicamente distinti negli studi di cocoltura.
I conteggi cellulari da immagini con alta densità cellulare vitale (VCD) potrebbero essere quantificati in modo affidabile ed efficiente calcolando l'area coperta dalle celle e l'area media occupata da una singola cella. L'uso della soglia rispetto alla segmentazione per l'identificazione cellulare ha anche permesso analisi più complesse, come esperimenti in cui sono stati analizzati contemporaneamente diversi tipi di cellule nelle cocolture. I fibroblasti NIH / 3T3, che spesso si trovano a colocalizzare con macrofagi RAW264.7 all'interno di un sito di guarigione delle ferite, sono stati trovati a crescere su un piano focale distinto dal piano focale dei macrofagi10. Di conseguenza, sono stati eseguiti più algoritmi di soglia per definire lo sfondo e il primo piano a seconda del tipo di cella analizzato, consentendo un conteggio accurato di due diversi tipi di celle all'interno della stessa immagine.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer 7 Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>1028290770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12430047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL - 1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB - 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3814-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures

La quantificazione delle cellule è necessaria per una vasta gamma di studi biologici e biochimici. L'analisi convenzionale delle immagini delle cellule impiega in genere approcci di rilevamento della fluorescenza, come la colorazione immunofluorescente o la trasfezione con proteine fluorescenti o tecniche di rilevamento dei bordi, che sono spesso soggette a errori a causa del rumore e di altre non idealità nello sfondo dell'immagine. 
Abbiamo progettato un nuovo algoritmo in grado di contare e distinguere con precisione macrofagi e fibroblasti, cellule di diversi fenotipi che spesso colocalizzano durante la rigenerazione dei tessuti. MATLAB è stato utilizzato per implementare l'algoritmo, che differenziava tipi di celle distinti in base alle differenze di altezza dallo sfondo. Un algoritmo primario è stato sviluppato utilizzando un metodo basato sull'area per tenere conto delle variazioni nelle dimensioni / struttura delle cellule e nelle condizioni di semina ad alta densità. 
Le non idealità nelle strutture cellulari sono state spiegate con un algoritmo secondario iterativo che utilizza parametri interni come la copertura cellulare calcolata utilizzando dati sperimentali per un determinato tipo di cellula. Infine, è stata effettuata un'analisi degli ambienti di cocoltura utilizzando un algoritmo di isolamento in cui sono stati esclusi selettivamente vari tipi di cellule in base alla valutazione delle differenze di altezza relative all'interno dell'immagine. Questo approccio è stato trovato per contare accuratamente le cellule entro un margine di errore del 5% per le cellule monocolturate e all'interno di un margine di errore del 10% per le cellule cocolturate.

L'analisi dei macrofagi RAW264.7 non bulbosi è stata condotta in un ambiente di monocoltura a 25.000 cellule / cm2. Sono state scattate immagini rappresentative della coltura cellulare ed elaborate in MATLAB dopo la conversione in tiff a 8 bit in ImageJ. Gli output dell'algoritmo durante tutto il processo sono stati registrati e documentati nella Figura 2 per l'immagine rappresentativa. In questa immagine, l'algoritmo ha contato 226 celle e questo conteggio delle immagini è stat...

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Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Presentiamo un metodo che utilizza un approccio di analisi delle immagini generalizzabile basato sull'area per identificare i conteggi delle cellule. L'analisi di diverse popolazioni cellulari ha sfruttato le significative differenze di altezza e struttura cellulare tra diversi tipi di cellule all'interno di un algoritmo adattivo.

Algoritmo di analisi delle immagini basato sull'area per la quantificazione delle cocolture di macrofagi-fibroblasti

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Questo metodo può essere utilizzato per aiutare i ricercatori ad analizzare e contare le co-colture di cellule utilizzando un'analisi semplice ed efficace basata sull'area. Questa tecnica è relativamente facile da implementare utilizzando software ampiamente disponibile e offre un mezzo affidabile e accurato per identificare vari tipi di cellule all'interno di un ambiente di co-coltura. Questo metodo può fornire informazioni su come specifiche co-colture di cellule sinergizzano per aiutare nella rigenerazione dei tessuti.Questo metodo può anche essere impiegato per convalidare gli studi sui biomarcatori di monocoltura. Per iniziare, coltiva 264,7 macrofagi grezzi a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per l'imaging in monocoltura in un millilitro di DMEM integrato con FBS, penicillina-streptomicina, bicarbonato di sodio e beta-mercaptoetanolo in un pallone di coltura cellulare da cinque millilitri ad una densità di 25.000 cellule per centimetro quadrato. Cellule NIH/3T3 di coltura in DMEM integrate con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina.Per l'imaging di co-colture, coltura grezza di 264,7 macrofagi e fibroblasti NIH / 3T3 utilizzando un mezzo di co-coltura contenente una parte di terreno grezzo 264,7 e una parte di mezzo NIH / 3T3 insieme a vari rapporti e densità totale di 25.000 cellule per centimetro quadrato. Dopo la semina, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per raggiungere una densità cellulare vitale dell'80% di confluenza cellulare. Per acquisire immagini cellulari utilizzando un microscopio invertito dotato dell'obiettivo 40X, determinare la capacità dell'algoritmo di valutare con precisione le immagini con una gamma di qualità dell'immagine.Acquisisci immagini in scala di grigi con fuochi variabili che producono immagini non bulbus e bulbus ed esportale nel file czi grezzo. Per ottenere immagini di celle utilizzando il metodo basato su area, copiare e incollare il file di immagine per l'analisi nel cestino e immettere il nome del file eseguendo il comando. Premere Esegui per avviare il programma.Analizza le immagini aprendo per ricostruzione, seguita dalla chiusura per ricostruzione utilizzando le funzioni sorgente per ingrandire il primo piano dallo sfondo eseguendo il rispettivo comando. Per binariizzare le immagini ricostruite utilizzando un sistema di identificazione basato su percentile, distinguere le celle dallo sfondo utilizzando una differenza percentile dal pixel massimo rilevante con il valore di pixel più grande che comprende almeno lo 0,5% di una determinata immagine. Analizza e valuta i valori dei pixel per i macrofagi 264.7 grezzi, assicurandoti che i valori siano entro il 4,5% del pixel massimo pertinente.Quindi contrassegna il pixel come cellulare. Per le immagini contenenti profili di cellule bulbus, implementare una procedura iterativa per correggere la binarizzazione errata al centro delle cellule. Determinare un'ipotesi iniziale per la copertura totale della cella.Esegui l'algoritmo e analizza le immagini utilizzando le stime iniziali di alfa e kappa per riempire una parte delle isole. Quindi utilizzare i conteggi e la copertura delle cellule post-analisi per ricalcolare kappa. Per determinare l'area media della cella dopo la binarizzazione dell'immagine, ottenere un vettore di tutte le posizioni centrali e dei raggi dei cerchi trovati all'interno dell'immagine eseguendo il comando.Utilizzare i raggi in uscita per calcolare l'area media delle celle facendo la media e analizzare almeno 10 celle per garantire un'identificazione accurata dell'area. Eseguire l'analisi dell'immagine utilizzando i comandi descritti in precedenza. Quindi condurre un'analisi di co-colture contenenti cellule grezze 264.7 e NIH / 3T3 determinando sperimentalmente un parametro phi utilizzando immagini di cellule grezze 264.7 e NIH / 3T3.Indovina un valore phi iniziale e itera fino a quando i conteggi delle cellule e la copertura non corrispondono strettamente ai conteggi manuali specifici per la co-coltura grezza 264.7 e NIH / 3T3. Determinare la conta delle cellule grezze di 264,7 nella copertura cellulare totale come descritto in precedenza per le immagini di monocoltura. Analizza nuovamente l'immagine trasformata dello spartiacque senza il parametro phi, rilevando sia i macrofagi che i fibroblasti.Acquisire i dati dei fibroblasti NIH/3T3 sottraendo selettivamente i pixel grezzi di 264,7 cellule ottenuti utilizzando i metodi standard di soglia e di quantificazione basati sull'area descritti in precedenza. È stata eseguita l'analisi di 264,7 macrofagi grezzi non bulbus e sono stati registrati gli output dell'algoritmo. I calcoli dell'area media dell'immagine utilizzando l'algoritmo hanno contato 226 celle, mentre un conteggio manuale ha identificato 241 cellule con un valore di errore approssimativo del 6% È stata effettuata anche l'analisi di bulbus raw 264,7 macrofagi.I calcoli dell'area media dell'immagine utilizzando l'algoritmo hanno contato 221 cellule, verificate da un conteggio manuale di 252 cellule con un valore di errore approssimativo del 12% È stata condotta un'analisi delle co-colture contenenti sia 264,7 macrofagi grezzi che fibroblasti NIH / 3T3. Gli output dell'algoritmo per il conteggio dei macrofagi grezzi 264,7 sono stati 137, mentre un conteggio manuale ha identificato 155 cellule con un valore di errore approssimativo dell'11% Per determinare la robustezza dell'algoritmo di conteggio delle cellule, cinque immagini grezze di macrofagi 264,7 sono state contate mediante identificazione automatica delle cellule e conteggi manuali degli utenti. Il coefficiente di Dadi è stato ottenuto con un parametro medio di 0,85 su cinque immagini.Il passaggio critico all'interno di questo protocollo è l'uso di parametri basati su percentili che consentono un robusto rilevamento cellulare sia in immagini di monocoltura che di co-coltura. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare le cellule di interesse per ulteriori analisi utilizzando tecniche di biologia molecolare per valutare i biomarcatori che definiscono specifiche popolazioni cellulari e lo sviluppo di biomarcatori nei sistemi di co-coltura.

Research

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Hybrid Imaging μCT-FMT e analisi delle immagini

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-scala Particle Image Velocimetry studi di Neurovascular scorre In Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Substructure Analyzer: un flusso di lavoro facile da usare per l'esplorazione rapida e l'analisi accurata dei corpi cellulari nelle immagini di microscopia a fluorescenza

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Imaging e quantificazione dell'area delle microbolle in rapido movimento utilizzando una fotocamera ad alta velocità e l'analisi delle immagini

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...