Name: area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

Dette arbeidet ble delvis finansiert av National Institutes of Health (R01 AR067247) og delvis av Delaware INBRE-programmet, støttet av et stipend fra National Institute of General Medical Sciences-NIGMS (P20 GM103446) fra National Institutes of Health og State of Delaware. Innholdet i manuskriptet gjenspeiler ikke nødvendigvis finansieringsbyråenes synspunkter.

1. Cellekultur og bildeoppkjøp
<ol><li>Kultur RAW264.7 makrofager ved 37 °C og 5 % CO2 i Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) supplert med 10 % foster bovint serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin, 1,5 g/l natriumbikarbonat og 5 μM β-mercaptoetanol.<ol>
<li>For monokulturavbildning, kultur RAW264.7 celler med en tetthet på 25,000 celler /cm2 i en 5 ml cellekultur kolbe med 1 ml medium.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kultur NIH/3T3 celler ved 37 °C og 5 % CO2 i DMEM su...

<ol>
	<li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection.">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li><li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN.">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li><li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection.">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).</li><li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+edge+detection.">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li><li>Fuller, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+vital+fluorescent+staining+method+for+monitoring+bacterial+transport+in+subsurface+environments.">Development of a vital fluorescent staining method for monitoring bacterial transport in subsurface environments.</a> Applied and Environmental Microbiology. 66 (10), 4486-4496 (2000).</li><li>Meyer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topographic+distance+and+watershed+lines.">Topographic distance and watershed lines.</a> Signal Processing. 38 (1), 113-125 (1994).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Marker-controlled watershed segmentation. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022)</li><li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB.">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li><li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation,+tissue+damage+and+organ+injury.">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li><li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis.">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).</li><li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides.">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022)</li><li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+invariant+circle+detection.">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li><li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Do&#287;an, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-analysis+based+readout+method+for+biochip:+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads,+micropads+and+patient+leukemia+cell.">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863 (2020).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images.">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li><li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity.">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).</li><li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts.">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li><li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing:+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes.">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li><li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalizing+cell+segmentation+and+quantification.">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).</li><li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index.">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li></ol>

Vi designet en generell områdebasert prosedyre som nøyaktig og effektivt telte celler på grunnlag av cellehøyde, noe som muliggjør flekkfri mengde celler selv i kokultursystemer. Kritiske trinn for denne prosedyren inkluderte implementeringen av et relativ intensitetssystem der celler kunne differensieres. Bruken av en relativ høydeanalyse tjente to formål: Behovet for eksterne parametere ble gjort unødvendig, da relative parametere var konstante for den gitte celletypen og parameteren, og absolutt lysstyrke / ko...

Programvare implementeres rutinemessig under bildeanalyseteknikker for å sikre at resultatene er nøyaktige, effektive og objektive. For cellebaserte analyser er et vanlig problem misidentifisering av celler. Bilder med feil innstillinger for fokus og kontrast kan føre til uskarphet i cellen, der grensen til enkeltceller blir vanskelig å identifisere1. Tilstedeværelsen av fremmede bildefunksjoner som porer, bobler eller andre uønskede objekter kan hemme telleprosedyrer ved å bremse telleprosessen og føre til misidentifisering. Videre kan celletelling være onerous, og å telle hundrevis av replikeringer kan være ekstremt tidkrevende. Videre eksisterer en iboende subjektiv skjevhet under manuell telling, og derfor er beslutningstaking angående celleidentifikasjon ofte unøyaktig2. Automatisert programvare gir spennende potensial til å omgå alle disse problemene ved raskt og presist å differensiere celler fra fremmede objekter, inkludert objekter langt utover menneskelig kapasitet for presis deteksjon, basert på veldefinerte identifikasjonskriterier som reduserer påvirkningen av undersøkerbias. Vanlige teknikker for å identifisere celler ved hjelp av automatisert programvare involverer to hovedmetoder: segmentering og terskel3. Heri demonstrerer vi en generaliserbar områdebasert protokoll som muliggjør rask, nøyaktig og billig celletelling innenfor et allment tilgjengelig programvarerammeverk.
Segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, søker å isolere enkeltceller ved å bruke intensitetsforskjeller i et bilde. Intensitetsendringer som skiller en celle fra resten av bildet, består oftest av skarpe endringer i lysstyrke4. Kantdeteksjon innebærer et filtreringstrinn som skjer regelmessig, etterfulgt av et differensieringstrinn der intensitetsendringer oppdages. Differensieringsprosessen identifiserer kanter og konturer i bildet av endringer med høy intensitet, og disse kantene og konturene er korrelert med celletilstedeværelsen. Selv om bilder med støy kan kjøres gjennom denoising algoritmer4, er kantdeteksjonsteknikker ideelt brukt til å analysere bilder med lav bakgrunnsstøy. Prosessen fungerer optimalt når cellegrenser er klart og lett å skille mellom og ikke hindres av lysstyrkekonturer som ikke er relatert til celletilstedeværelse, celleuskarphet, fremmede objekter eller definerte interne cellestrukturer 1,2. Hvis et bilde er spesielt støyende, kan cellene ytterligere skille seg ut gjennom fluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner 2,5. Selv om dette forbedrer nøyaktigheten av segmenteringsteknikker betydelig, krever det ekstra kostnader og ekstra tidsinvesteringer for å forberede cellekulturer for avbildning.
Terskelverditeknikker omfatter oppdeling av et bilde i to kategorier: forgrunnen og bakgrunnen, med celler tilordnet forgrunnen3. Disse teknikkene bruker farge-/kontrastendringer for å definere den tilsynelatende høyden på et objekt. -objekter som rutinemessig er "høyere" enn bakgrunnen, kan enkelt identifiseres som celler. Vannskillet fungerer på denne måten ved å knytte overflater til lyse bildepunkter som forgrunnen og de med mørke bildepunkter som bakgrunn 6,7. Gjennom høydebasert identifikasjon kan terringsteknikker rutinemessig skille støy fra ønskede objekter, forutsatt at de eksisterer innenfor samme fokusplan. Når den er parkoblet med en områdebasert kvantifisering, kan en vannskilletransformasjon nøyaktig identifisere grupper av objekter i miljøer der typiske segmenteringsteknikker, for eksempel kantdeteksjon, vil være unøyaktige.
Vannskilletransformasjoner kombineres vanligvis med segmenteringsteknikker for å forberede bilder for en renere analyse, noe som resulterer i høyere nøyaktighet av celletelling. For denne prosessen brukes vannskilletransformasjonen til å fremheve potensielle interesseområder før segmentering. En vannskilletransformasjon gir unike fordeler ved å identifisere celler i forgrunnen av bilder, noe som kan forbedre nøyaktigheten av segmenteringsanalysen ved å fjerne potensielle falske positiver for celler, for eksempel ujevne bakgrunner. Det kan imidlertid oppstå vanskeligheter når du prøver å tilpasse cellebaserte bilder til en vannskilletransformasjon. Bilder med høy celletetthet kan plages med undersegmentering, der cellemengder identifiseres som en entallsgruppe i stedet for som individuelle komponenter. Tilstedeværelsen av støy eller skarpe intensitetsendringer kan også resultere i oversegmentering, der algoritmen overisolerer celler, noe som resulterer i overdreven og unøyaktig celle teller8.
Heri beskriver vi en metode for å minimere de primære ulempene ved vannskilletransformasjonen ved å inkorporere komponenter i en terskelanalyse i en områdebasert kvantifiseringsalgoritme, som vist i figur 1. Spesielt ble denne algoritmen implementert med åpen kildekode og / eller allment tilgjengelig programvare, og anvendelse av dette celletellingsrammeverket var mulig uten dyre reagenser eller komplekse celleforberedelsesteknikker. RAW264.7 makrofager ble brukt til å demonstrere metoden på grunn av deres kritiske rolle i regulering av vedlikehold av bindevev og sårhelingsprosesser9. I tillegg ble NIH/3T3 fibroblaster analysert på grunn av deres nøkkelrolle i vevsvedlikehold og reparasjon. Fibroblastceller sameksisterer ofte med og støtter makrofager, og genererer behovet for å skille disse fenotypisk distinkte celletypene i kokulturstudier.
Celleantall fra bilder med høy levedyktig celletetthet (VCD) kan kvantifiseres pålitelig og effektivt ved å beregne området som dekkes av cellene, og gjennomsnittsområdet okkupert av en entall celle. Bruk av terring i motsetning til segmentering for celleidentifikasjon gjorde det også mulig med mer komplekse analyser, for eksempel eksperimenter der ulike celletyper i kokulturer ble analysert samtidig. NIH/3T3 fibroblaster, som ofte er funnet å colokalisere med RAW264.7 makrofager i et sårhelingssted, ble funnet å vokse på et fokusplan som var forskjellig fra fokusplanet til makrofager10. Følgelig ble flere terningsalgoritmer kjørt for å definere bakgrunnen og forgrunnen avhengig av celletypen som analyseres, noe som muliggjør nøyaktig telling av to forskjellige celletyper i samme bilde.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer 7 Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>1028290770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12430047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL - 1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB - 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3814-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures

Kvantifisering av celler er nødvendig for et bredt spekter av biologiske og biokjemiske studier. Konvensjonell bildeanalyse av celler bruker vanligvis enten fluorescensdeteksjonsmetoder, for eksempel immunfluorescerende farging eller transfeksjon med fluorescerende proteiner eller kantdeteksjonsteknikker, som ofte er feilutsatte på grunn av støy og andre ikke-idealiteter i bildebakgrunnen. 
Vi designet en ny algoritme som nøyaktig kunne telle og skille makrofager og fibroblaster, celler av forskjellige fenotyper som ofte colokaliserer under vevregenerering. MATLAB ble brukt til å implementere algoritmen, som differensierte forskjellige celletyper basert på høydeforskjeller fra bakgrunnen. En primæralgoritme ble utviklet ved hjelp av en områdebasert metode for å gjøre rede for variasjoner i cellestørrelse/struktur og seedingforhold med høy tetthet. 
Ikke-idealiteter i cellestrukturer ble gjort rede for med en sekundær, iterativ algoritme ved hjelp av interne parametere som celledekning beregnet ved hjelp av eksperimentelle data for en gitt celletype. Til slutt ble det utført en analyse av kokulturmiljøer ved hjelp av en isolasjonsalgoritme der ulike celletyper ble selektivt utelukket basert på evaluering av relative høydeforskjeller i bildet. Denne tilnærmingen ble funnet å telle celler nøyaktig innenfor en 5% feilmargin for monokulturerte celler og innenfor en 10% feilmargin for kokulturerte celler.

Analyse av ikke-bulbous RAW264.7 makrofager ble utført i en monokulturinnstilling ved 25.000 celler / cm2. Representative bilder ble tatt av cellekulturen og behandlet i MATLAB etter konvertering til 8-biters tiff i ImageJ. Algoritmeutganger gjennom hele prosessen ble registrert og dokumentert i figur 2 for det representative bildet. I dette bildet telte algoritmen 226 celler, og dette bildeantallet ble bekreftet ved sammenligning med et manuelt antall som identifiserte 241 celle...

Watch this Scientific Journal Video about Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures at JoVE.com

Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Vi presenterer en metode, som benytter en generaliserbar områdebasert bildeanalysetilnærming for å identifisere celleantall. Analyse av ulike cellepopulasjoner utnyttet de signifikante cellehøyde- og strukturforskjellene mellom distinkte celletyper i en adaptiv algoritme.

Områdebasert bildeanalysealgoritme for kvantifisering av makrofag-fibroblastkokulturer

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Denne metoden kan brukes til å hjelpe forskere med å analysere og telle samkulturer av celler ved hjelp av en enkel og effektiv områdebasert analyse. Denne teknikken er relativt enkel å implementere ved hjelp av allment tilgjengelig programvare og tilbyr en pålitelig og nøyaktig måte å identifisere ulike celletyper i en samkulturinnstilling. Denne metoden kan gi innsikt i hvordan spesifikke samkulturer av celler synergiserer for å hjelpe til med vevregenerering.Denne metoden kan også brukes til å validere monokultur biomarkørstudier. Til å begynne med, kultur rå 264,7 makrofager ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for monokulturavbildning i en milliliter DMEM supplert med FBS, penicillin-streptomycin, natriumbikarbonat og beta-mercaptoethanol i en fem milliliter cellekulturflaske med en tetthet på 25 000 celler per centimeter kvadrat. Kultur NIH/3T3 celler i DMEM supplert med 10% FBS og 1% penicillin-streptomycin.For samkulturell avbildning, kultur rå 264,7 makrofager og NIH/3T3 fibroblaster ved hjelp av samkulturmedium som inneholder en del rå 264,7 medium og en del NIH/3T3 medium sammen ved varierte forhold og total tetthet på 25 000 celler per centimeter kvadrat. Etter sådd inkuberer du cellene ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid for å nå en levedyktig celletetthet på 80% cellesamfluens. For å skaffe cellebilder ved hjelp av et invertert mikroskop utstyrt med 40X-målet, bestem kapasiteten til algoritmen for å nøyaktig evaluere bilder med en rekke bildekvaliteter.Skaff bilder i gråtoner med varierende fokus som produserer både ikke-bulbus- og bulbus-bilder og eksporter dem i raw czi-filen. Hvis du vil hente bilder av celler ved hjelp av den områdebaserte metoden, kopierer og limer du inn bildefilen for analyse i papirkurven og skriver inn filnavnet ved å utføre kommandoen. Trykk Kjør for å starte programmet.Analyser bildene ved å åpne ved rekonstruksjon, etterfulgt av lukking ved hjelp av rekonstruksjon ved hjelp av kildefunksjoner for å forstørre forgrunnen fra bakgrunnen ved å utføre den respektive kommandoen. Hvis du vil binarisere de rekonstruerte bildene ved hjelp av et persentilbasert identifikasjonssystem, skiller du celler fra bakgrunnen ved å bruke en persentilforskjell fra det maksimale relevante bildepunktet med den største pikselverdien som utgjør minst 0,5 % av et gitt bilde. Analyser og evaluer bildepunktverdiene for rå 264,7 makrofaser, og sørg for at verdiene er innenfor 4,5 % av det maksimalt relevante bildepunktet.Merk deretter pikselen som mobil. For bilder som inneholder bulbus-celleprofiler, implementerer du en iterativ prosedyre for å korrigere for feilaktig binarisering i midten av cellene. Bestem en innledende gjetning for den totale celledekningen.Kjør algoritmen og analyser bilder ved hjelp av innledende estimater av alfa og kappa for å fylle en del av øyene. Bruk deretter celleantall og dekning etter analyse til å beregne kappa på nytt. Hvis du vil finne det gjennomsnittlige celleområdet etter binariseringen av bildet, får du en vektor av alle midtplasseringer og radier av sirkler som finnes i bildet, ved å utføre kommandoen.Bruk radii-utgangene til å beregne det gjennomsnittlige celleområdet ved å beregne gjennomsnittet og analysere minst 10 celler for å sikre nøyaktig områdeidentifikasjon. Utfør bildeanalysen ved hjelp av kommandoene som beskrevet tidligere. Utfør deretter en analyse av samkulturer som inneholder rå 264,7- og NIH/3T3-celler ved å eksperimentelt bestemme en parameterfir ved hjelp av bilder av rå 264,7 og NIH/3T3 celler.Gjett en innledende phi-verdi og gjenta til celleantall og dekning samsvarer tett med de manuelle tellingene som er spesifikke for den rå 264,7 og NIH/3T3-samkulturen. Bestem rå 264,7 celleantall i total celledekning som beskrevet tidligere for monokulturbildene. Analyser det transformerte bildet i vannskillet igjen uten phi-parameteren, og oppdag både makrofager og fibroblaster.Hent NIH/3T3 fibroblastdata ved å selektivt trekke fra rå 264,7 cellepiksler oppnådd ved hjelp av standard ternings- og arealbaserte kvantifiseringsmetoder som er beskrevet tidligere. Analyse av ikke-bulbus rå 264,7 makrofager ble utført og algoritmeutganger ble registrert. Gjennomsnittlige områdeberegninger av bildet ved hjelp av algoritme telte 226 celler, mens et manuelt antall identifiserte 241 celler med en omtrentlig feilverdi på 6%Analyse av bulbus rå 264.7 makrofager ble også utført.Gjennomsnittlig arealberegning av bildet ved hjelp av algoritme telte 221 celler, verifisert av et manuelt antall på 252 celler med en omtrentlig feilverdi på 12%Analyse av samkulturer som inneholder både rå 264,7 makrofager og NIH / 3T3 fibroblaster ble utført. Algoritmeutdataene for det rå makroantallet på 264,7 var 137, mens et manuelt antall identifiserte 155 celler med en omtrentlig feilverdi på 11 %For å fastslå robustheten til celletellingsalgoritmen ble fem rå 264,7 makrofagbilder telt opp av automatisk celleidentifikasjon og manuelle brukerantall. Dice-koeffisienten ble oppnådd med en gjennomsnittlig parameter på 0,85 på fem bilder.Det kritiske trinnet i denne protokollen er bruken av persentilbaserte parametere som muliggjør robust celledeteksjon i både monokultur- og samkulturbilder. Denne protokollen kan brukes til å identifisere celler av interesse for videre analyse ved hjelp av molekylærbiologiske teknikker for å vurdere biomarkører som definerer spesifikke cellepopulasjoner og biomarkørutvikling i samkultursystemer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials

The discovery of novel biomaterials that are optimized for a specific biological application is readily achieved using polymer microarrays, which allows a ...

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optical Frequency Domain Imaging of Ex vivo Pulmonary Resection Specimens: Obtaining One to One Image to Histopathology Correlation

Optisk Frequency Domain Imaging av<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lunge Reseksjon prøver: Innhenting One to One bildet for å Histopatologi Korrelasjon

Lung cancer is the leading cause of cancer-related deaths1. Squamous cell and small cell cancers typically arise in association with the conducting ...

Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows

Micro-partikkel Bilde velocimetry for Velocity Profil Målinger av Micro blodet flyter

Micro-particle image velocimetry (&mu;PIV) is used to visualize paired images of micro particles seeded in blood flows. The images are cross-correlated to ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Egenrapportering Stillaser for 3-dimensjonal Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility

Elektrisk Cell-substrat Impedans Sensing for kvantifisering av endotel Proliferation, barrierefunksjon, og Motilitet

Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) is an in vitro impedance measuring system to quantify the behavior of cells within adherent cell layers. ...

Quantification of Global Diastolic Function by Kinematic Modeling-based Analysis of Transmitral Flow via the Parametrized Diastolic Filling Formalism

Kvantifisering av Global diastolisk funksjon av Kinetisk modellering basert analyse av transmitral Flow via Parametrized diastolisk Fylling formalisme

Quantitative cardiac function assessment remains a challenge for physiologists and clinicians.&#160;Although historically invasive methods have comprised ...

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Hybrid μCT-FMT bildebehandling og bildeanalyse

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-Scale Particle Image Velocimetry Studies of Neurovascular Flows In Vitro

Meso-skala partikkel bilde Velocimetry studier av nevrovaskulære flyter i Vitro

Particle image velocimetry (PIV) is used in a wide variety of fields, due to the opportunity it provides for precisely visualizing and quantifying flows ...

Substructure Analyzer: A User-Friendly Workflow for Rapid Exploration and Accurate Analysis of Cellular Bodies in Fluorescence Microscopy Images

Substructure Analyzer: En brukervennlig arbeidsflyt for rask utforskning og nøyaktig analyse av cellulære organer i fluorescensmikroskopibilder

The last decade has been characterized by breakthroughs in fluorescence microscopy techniques illustrated by spatial resolution improvement but also in ...

Imaging and Quantification of the Area of Fast-Moving Microbubbles Using a High-Speed Camera and Image Analysis

Bildebehandling og kvantifisering av området av hurtiggående mikrobobler ved hjelp av et høyhastighetskamera og bildeanalyse

An experimental and image analysis technique is presented for imaging cavitation bubbles and calculating their area. The high-speed imaging experimental ...