Name: area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures
Uploaded: 2022-02-15T13:00:00
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Este trabalho foi financiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde (R01 AR067247) e em parte pelo programa Delaware INBRE, apoiado por uma bolsa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais-NIGMS (P20 GM103446) dos Institutos Nacionais de Saúde e do Estado de Delaware. As opiniões dos usuários não refletem necessariamente a opinião da iCarros.

1. Cultura celular e aquisição de imagens
<ol><li>Cultura RAW264.7 macrófagos a 37 °C e 5% DE CO2 no Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) complementado com 10% de soro bovino fetal (FBS), 1% penicilina-estreptomicina, 1,5 g/L de sódio biato e 5 μM β-mercaptoethanol.<ol>
<li>Para imagens de monocultura, cultura RAW264.7 células a uma densidade de 25.000 células/cm2 em um frasco de cultura celular de 5 mL com 1 mL de médio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultura NIH/3T3 célula...

<ol>
	<li>Young, D., Glasbey, C., Gray, A., Martin, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+sizing+of+cells+in+microscope+images+by+template+matching+and+edge+detection.">Identification and sizing of cells in microscope images by template matching and edge detection.</a> Fifth International Conference on Image Processing and its Applications, 1995. , 266-270 (1995).</li><li>Zhu, R., Sui, D., Qin, H., Hao, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+extended+type+cell+detection+and+counting+method+based+on+FCN.">An extended type cell detection and counting method based on FCN.</a> Proc. - 2017 IEEE 17th International Conference on Bioinformatics and Bioengineering (BIBE). , 51-56 (2018).</li><li>Choudhry, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+method+for+automated+colony+and+cell+counting+by+digital+image+analysis+based+on+edge+detection.">High-throughput method for automated colony and cell counting by digital image analysis based on edge detection.</a> PLoS One. 11 (2), 0148469 (2016).</li><li>Torre, V., Poggio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+edge+detection.">On edge detection.</a> MIT Artificial Intelligence Lab Memo 768. , 1-9 (1984).</li><li>Fuller, M. 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MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html">https://www.mathworks.com/help/images/marker-controlled-watershed-segmentation.html</a> (2022)</li><li>Bala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+watershed+image+segmentation+technique+using+MATLAB.">An improved watershed image segmentation technique using MATLAB.</a> International Journal of Scientific and Engineering Research. 3 (6), 1206-1209 (2012).</li><li>Glaros, T., Larsen, M., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+and+fibroblasts+during+inflammation,+tissue+damage+and+organ+injury.">Macrophages and fibroblasts during inflammation, tissue damage and organ injury.</a> Frontiers in Bioscience (Landmark Edition). 14, 3988-3993 (2009).</li><li>Witherel, C., Abebayehu, D., Barker, T., Spiller, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+and+fibroblast+interactions+in+biomaterial-mediated+fibrosis.">Macrophage and fibroblast interactions in biomaterial-mediated fibrosis.</a> Advanced Healthcare Materials. 8 (4), 1801451 (2019).</li><li>Urello, M., Kiick, K., Sullivan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+growth+factor+gene+delivery+with+collagen-triggered+wound+repair+cascades+using+collagen-mimetic+peptides.">Integration of growth factor gene delivery with collagen-triggered wound repair cascades using collagen-mimetic peptides.</a> Bioengineering &amp; Translational Medicine. 1 (2), 207-219 (2016).</li><li>Image Processing Toolbox Documentation. MATLAB_Detect and measure circular objects in an image. MathWorks Available from: <a target="_blank" href="https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html">https://www.mathworks.com/help/images/detect-and-measure-circular-objects-in-an-image.html</a> (2022)</li><li>Atherton, T., Kerbyson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size+invariant+circle+detection.">Size invariant circle detection.</a> Image and Vision Computing. 17, 795-803 (1999).</li><li>Maitra, M., Kumar Gupta, R., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+Hough+transform.">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using Hough transform.</a> International Journal of Computer Applications. 53 (16), 18-22 (2012).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Do&#287;an, R. S., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-analysis+based+readout+method+for+biochip:+Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads,+micropads+and+patient+leukemia+cell.">Image-analysis based readout method for biochip: Automated quantification of immunomagnetic beads, micropads and patient leukemia cell.</a> Micron. 133, 102863 (2020).</li><li>Uslu, F., Icoz, K., Tasdemir, K., Yilmaz, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+quantification+of+immunomagnetic+beads+and+leukemia+cells+from+optical+microscope+images.">Automated quantification of immunomagnetic beads and leukemia cells from optical microscope images.</a> Biomedical Signal Processing and Control. 49, 473-482 (2019).</li><li>Anderl, J., Redpath, S., Ball, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neuronal+and+astrocyte+co-culture+assay+for+high+content+analysis+of+neurotoxicity.">A neuronal and astrocyte co-culture assay for high content analysis of neurotoxicity.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1173 (2009).</li><li>Holt, D., Chamberlain, L., Grainger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cell+signaling+in+co-cultures+of+macrophages+and+fibroblasts.">Cell-cell signaling in co-cultures of macrophages and fibroblasts.</a> Biomaterials. 31 (36), 9382-9394 (2010).</li><li>Boddupalli, A., Zhu, L., Bratlie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+implant+acceptance+and+wound+healing:+material+selection+and+implant+location+modulate+macrophage+and+fibroblast+phenotypes.">Methods for implant acceptance and wound healing: material selection and implant location modulate macrophage and fibroblast phenotypes.</a> Advanced Healthcare Materials. 5 (20), 2575-2594 (2016).</li><li>Wang, Z., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generalizing+cell+segmentation+and+quantification.">Generalizing cell segmentation and quantification.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 189 (2017).</li><li>Zou, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+validation+of+image+segmentation+quality+based+on+a+spatial+overlap+index.">Statistical validation of image segmentation quality based on a spatial overlap index.</a> Academic Radiology. 11 (2), 178-189 (2004).</li></ol>

Projetamos um procedimento geral baseado em área que contava com precisão e eficiência as células com base na altura celular, permitindo a quantitação livre de manchas de células mesmo em sistemas de cocultura. As etapas críticas para este procedimento incluíram a implementação de um sistema de intensidade relativa pelo qual as células poderiam ser diferenciadas. O uso de uma análise relativa da altura serviu a dois propósitos: a necessidade de parâmetros externos tornou-se desnecessária, uma vez que par?...

O software é implementado rotineiramente durante técnicas de análise de imagens para garantir que os resultados sejam precisos, eficientes e imparcial. Para ensaios baseados em células, um problema comum é a identificação errada das células. Imagens com configurações focais e de contraste inadequadas podem levar à desfoque celular, no qual o limite de células individuais torna-se difícil de identificar1. A presença de características de imagem ímpares, como poros, bolhas ou outros objetos indesejados, pode dificultar a contagem de procedimentos, retardando o processo de contagem e levando à identificação errada. Além disso, a contagem de células pode ser onerosa, e contar centenas de réplicas pode ser extremamente demorado. Além disso, existe um viés subjetivo inerente durante a contagem manual e, portanto, a tomada de decisão sobre a identificação celular é muitas vezes imprecisa2. O software automatizado oferece um potencial empolgante para contornar todos esses problemas, diferenciando rapidamente e precisamente as células de objetos estranhos, incluindo objetos muito além da capacidade humana para detecção precisa, com base em critérios de identificação bem definidos que reduzem a influência do viés do investigador. Técnicas comuns para identificar células usando software automatizado envolvem dois métodos principais: segmentação e limiar3. Aqui, demonstramos um protocolo generalizado baseado em área que permite a contagem rápida, precisa e barata de células dentro de uma estrutura de software amplamente acessível.
Técnicas de segmentação, como a detecção de bordas, buscam isolar células individuais utilizando diferenças de intensidade dentro de uma imagem. As mudanças de intensidade que distinguem uma célula do resto da imagem mais frequentemente consistem em mudanças acentuadas no brilho4. A detecção de bordas envolve uma etapa de filtragem regularizadora, seguida de uma etapa de diferenciação na qual são detectadas alterações de intensidade. O processo de diferenciação identifica bordas e contornos dentro da imagem de mudanças de alta intensidade, e essas bordas e contornos estão correlacionados com a presença celular. Embora imagens com ruído possam ser executadas através de algoritmos de denoizantes4, técnicas de detecção de bordas são idealmente usadas para analisar imagens com baixo ruído de fundo. O processo funciona de forma ideal quando os limites celulares são claramente e facilmente distinguíveis e não são impedidos por contornos de brilho não relacionados à presença celular, desfoque celular, objetos estranhos ou estruturas celulares internas definidas 1,2. Se uma imagem é particularmente ruidosa, as células podem ser ainda mais distinguidas através de coloração fluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes 2,5. Embora isso melhore significativamente a precisão das técnicas de segmentação, requer custos adicionais e investimentos adicionais para preparar culturas celulares para imagens.
As técnicas de limiar envolvem a divisão de uma imagem em duas categorias: o primeiro plano e o fundo, com células atribuídas ao primeiro plano3. Essas técnicas utilizam alterações de cor/contraste para definir a altura aparente de um objeto; objetos que são rotineiramente 'mais altos' do que o fundo podem ser facilmente identificados como células. A transformação da bacia hidrográfica funciona desta forma associando superfícies com pixels de luz como o primeiro plano e aqueles com pixels escuros como o fundo 6,7. Através da identificação baseada em altura, as técnicas de limiar podem distinguir rotineiramente o ruído dos objetos desejados, desde que existam dentro do mesmo plano focal. Quando emparelhado com uma quantificação baseada em área, uma transformação de bacia hidrográfica pode identificar com precisão grupos de objetos em ambientes onde técnicas típicas de segmentação, como detecção de bordas, seriam imprecisas.
As transformações de bacias hidrográficas são comumente acoplada a técnicas de segmentação para preparar imagens para uma análise mais limpa, resultando em maior precisão da contagem celular. Para esse processo, a transformação de bacias hidrográficas é utilizada para destacar potenciais regiões de interesse antes da segmentação. Uma transformação de bacia hidrográfica proporciona benefícios únicos ao identificar células em primeiro plano de imagens, o que pode melhorar a precisão da análise de segmentação, removendo potenciais falsos positivos para células, como patches irregulares de fundo. No entanto, podem surgir dificuldades ao tentar adaptar imagens baseadas em células a uma transformação divisora de águas. Imagens com alta densidade celular podem ser atormentadas com subsegmentação, na qual agregados de células são identificados como um grupo singular e não como componentes individuais. A presença de ruídos ou alterações acentuadas de intensidade também pode resultar em superegmentação, na qual o algoritmo sobreisola as células, resultando em contagem de células excessivas e imprecisas8.
Aqui, detalhamos um método para minimizar as desvantagens primárias da transformação da bacia hidrográfica, incorporando componentes de uma análise de limiar dentro de um algoritmo de quantificação baseado em área, como retratado na Figura 1. Notavelmente, este algoritmo foi implementado com software de código aberto e/ou amplamente disponível, e a aplicação desta estrutura de contagem de células foi possível sem reagentes caros ou técnicas complexas de preparação celular. Os macrófagos RAW264.7 foram utilizados para demonstrar o método devido ao seu papel crítico na regulação dos processos de manutenção de tecidos conjuntivos e cicatrização de feridas9. Além disso, os fibroblastos NIH/3T3 foram analisados devido ao seu papel fundamental na manutenção e reparação de tecidos. As células fibroblastos frequentemente coexistem e apoiam macrófagos, gerando a necessidade de distinguir esses tipos de células fenotipicamente distintas em estudos de cocultura.
As contagens celulares a partir de imagens com alta densidade celular viável (VCD) poderiam ser quantificadas de forma confiável e eficiente calculando a área coberta pelas células, e a área média ocupada por uma célula singular. O uso de limiares em oposição à segmentação para identificação celular também possibilitou análises mais complexas, como experimentos em que diferentes tipos de células em coculturas foram analisados simultaneamente. Os fibroblastos NIH/3T3, que muitas vezes são encontrados para se colocar com macrófagos RAW264.7 dentro de um local de cicatrização de feridas, foram encontrados para crescer em um plano focal que era distinto do plano focal dos macrófagos10. Assim, vários algoritmos de limiar foram executados para definir o fundo e o primeiro plano, dependendo do tipo de célula que está sendo analisado, permitindo uma contagem precisa de dois tipos de células diferentes dentro da mesma imagem.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Axio Observer 7 Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>1028290770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Scrapers</td>
			<td>CellTreat</td>
			<td>229310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12430047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dublecco&#39;s PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB Software</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>2021A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NIH/3T3 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC CRL - 1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P4333-20ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RAW264.7 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC TIB - 71</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6014-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 Cell Culture Flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3814-24EA</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

area-based image analysis algorithm for quantification of macrophage-fibroblast cocultures

A quantificação das células é necessária para uma ampla gama de estudos biológicos e bioquímicos. A análise convencional de imagens das células normalmente emprega abordagens de detecção de fluorescência, como coloração imunofluorescente ou transfecção com proteínas fluorescentes ou técnicas de detecção de borda, que muitas vezes são propensas a erros devido ao ruído e outras não-idealidades no fundo da imagem. 
Projetamos um novo algoritmo que poderia contar com precisão e distinguir macrófagos e fibroblastos, células de diferentes fenótipos que muitas vezes se colocam durante a regeneração tecidual. O MATLAB foi usado para implementar o algoritmo, que diferenciava tipos de células distintas com base em diferenças de altura a partir do fundo. Um algoritmo primário foi desenvolvido usando um método baseado em área para explicar as variações no tamanho/estrutura da célula e condições de semeadura de alta densidade. 
As não idealidades nas estruturas celulares foram contabilizadas com um algoritmo iterativo secundário utilizando parâmetros internos, como cobertura celular computada usando dados experimentais para um determinado tipo de célula. Finalmente, foi realizada uma análise dos ambientes de cocultura utilizando-se um algoritmo de isolamento no qual vários tipos de células foram seletivamente excluídos com base na avaliação de diferenças de altura relativas dentro da imagem. Essa abordagem foi encontrada para contar com precisão as células dentro de uma margem de erro de 5% para células monoculturadas e dentro de uma margem de erro de 10% para células coculturadas.

A análise dos macrófagos RAW264.7 não bulbosos foi realizada em um cenário de monocultura a 25.000 células/cm2. Imagens representativas foram tiradas da cultura celular e processadas no MATLAB após a conversão para uma tiff de 8 bits no ImageJ. As saídas de algoritmos ao longo do processo foram registradas e documentadas na Figura 2 para a imagem representativa. Nesta imagem, o algoritmo contava 226 células, e essa contagem de imagens foi verificada em comparação com um...

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Area-based Image Analysis Algorithm for Quantification of Macrophage-fibroblast Cocultures

Apresentamos um método, que utiliza uma abordagem de análise de imagem generalizada baseada em área para identificar a contagem de células. A análise de diferentes populações celulares explorou as diferenças significativas de altura celular e estrutura entre tipos de células distintas dentro de um algoritmo adaptativo.

Algoritmo de análise de imagem baseado em área para quantificação de coculturas de macênfago-fibroblasto

Quantification of cells is necessary for a wide range of biological and biochemical studies. Conventional image analysis of cells typically employs either ...

Esse método pode ser usado para ajudar os pesquisadores a analisar e contar co-culturas de células usando uma análise simples e eficaz baseada em área. Esta técnica é relativamente fácil de implementar usando software amplamente disponível e oferece um meio confiável e preciso de identificar vários tipos de células dentro de uma configuração de co-cultura. Este método pode fornecer uma visão de como co-culturas específicas das células sinergizam para ajudar na regeneração tecidual.Este método também pode ser empregado para validar estudos biomarcadores de monocultura. Para começar, a cultura bruta 264,7 macrófagos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para imagem monocultura em um mililitro de DMEM suplementado com FBS, penicilina-estreptomicina, bicarbonato de sódio e beta-mercaptoetanol em um frasco de cultura celular de cinco mililitros a uma densidade de 25.000 células por centímetros quadrados. Cultura CÉLULAS NIH/3T3 em DMEM suplementadas com 10% FBS e 1%penicilina-estreptomicina.Para a imagem de cocultura, a cultura bruta 264,7 macrófagos e fibroblastos NIH/3T3 utilizando meio de co-cultura contendo uma parte bruta 264,7 média e uma parte NIH/3T3 média juntos em proporções variadas e densidade total de 25.000 células por centímetro quadrado. Após a semeadura, incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono para atingir uma densidade celular viável de 80% de confluência celular. Para adquirir imagens celulares usando um microscópio invertido equipado com o objetivo 40X, determine a capacidade do algoritmo de avaliar com precisão imagens com uma gama de qualidades de imagem.Adquira imagens em escala cinza com diferentes focos produzindo imagens não bulbus e bulbus e exporte-as no arquivo czi bruto. Para obter imagens de células usando o método baseado em área, copie e cole o arquivo de imagem para análise na lixeira e digite o nome do arquivo executando o comando. Pressione a Corrida para iniciar o programa.Analise as imagens por abertura por reconstrução, seguido de fechamento por reconstrução usando funções de origem para ampliar o primeiro plano a partir do fundo, executando o respectivo comando. Para binarizar as imagens reconstruídas utilizando um sistema de identificação baseado em percentil, diferencie as células do fundo usando uma diferença percentil do pixel máximo relevante com o maior valor de pixel que compreende pelo menos 0,5% de uma determinada imagem. Analise e avalie os valores dos pixels para macrófagos brutos 264,7, garantindo que os valores estejam dentro de 4,5% do pixel máximo relevante.Em seguida, marque o pixel como celular. Para imagens contendo perfis de células bulbosas, implemente um procedimento iterativo para corrigir a binarização errônea nos centros das células. Determine um palpite inicial para a cobertura total da célula.Execute o algoritmo e analise imagens usando estimativas iniciais de alfa e kappa para preencher uma parte das ilhas. Em seguida, use as contagens de células pós-análise e a cobertura para recalcular kappa. Para determinar a área média da célula após a binarização da imagem, obtenha um vetor de todos os locais centrais e raios de círculos encontrados dentro da imagem executando o comando.Use as saídas de raios para calcular a área celular média, analisando pelo menos 10 células para garantir a identificação precisa da área. Realize a análise de imagem usando os comandos descritos anteriormente. Em seguida, realize uma análise de co-culturas contendo células 264.7 e NIH/3T3 cruas, determinando experimentalmente um parâmetro phi usando imagens de células 264.7 e NIH/3T3 brutas.Acho que um valor inicial de phi e iterado até que as contagens de células e a cobertura coincidam de perto com as contagens manuais específicas da co-cultura 264.7 e NIH/3T3. Determine a contagem bruta de células 264,7 na cobertura celular total, conforme descrito anteriormente para as imagens de monocultura. Analise a imagem transformada da bacia hidrográfica novamente sem o parâmetro phi, detectando macrófagos e fibroblastos.Adquira dados de fibroblasto NIH/3T3 subtraindo seletivamente pixels de células brutas de 264,7 obtidos usando os métodos padrão de limiarização e quantificação baseados em área descritos anteriormente. A análise de macrófagos crus não bulbos foram realizadas 264,7 macrófagos e as saídas de algoritmos foram registradas. Cálculos médios de área da imagem usando algoritmo contaram 226 células, enquanto uma contagem manual identificou 241 células com um valor de erro aproximado de 6%A análise de macrófagos 264,7 bulbosos também foi realizada.Os cálculos médios da área da imagem utilizando algoritmo contaram 221 células, verificadas por uma contagem manual de 252 células com um valor de erro aproximado de 12% A análise das coculturas contendo ambos os macrófagos crus 264,7 e fibroblastos NIH/3T3 foram realizados. As saídas de algoritmo para a contagem bruta de 264,7 macrófagos foram de 137, enquanto uma contagem manual identificou 155 células com um valor de erro aproximado de 11% Para determinar a robustez do algoritmo de contagem de células, cinco imagens brutas de 264,7 macrófagos foram contadas por identificação automática de células e contagem manual de usuários. O coeficiente de Dados foi obtido com um parâmetro médio de 0,85 em cinco imagens.O passo crítico dentro deste protocolo é o uso de parâmetros baseados em percentil que permitem a detecção robusta de células em imagens de monocultura e cocultura. Este protocolo pode ser usado para identificar células de interesse para análises mais aprofundadas usando técnicas de biologia molecular para avaliar biomarcadores que definem populações celulares específicas e desenvolvimento de biomarcadores em sistemas de cocultura.

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