Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

تم دعم العمل من قبل ولاية كانساس إلى معهد الغرب الأوسط لبيولوجيا الخلايا الجذعية المقارنة (MICSCB) ، ومركز جونسون لأبحاث السرطان إلى MLW و NIH R21AG066488 إلى LKC. تلقى مكتب خدمات الرقابة الداخلية دعما من GRA من MICSCB. يشكر المؤلفون الدكتور سانتوش أريال على توفير الجسيمات الشحمية المستخدمة في هذا المشروع وأعضاء مختبرات فايس وكريستنسون لإجراء محادثات وتعليقات مفيدة. الدكتور هونغ هو ممتن للدعم الفني. تشكر MLW بيتي غورين فايس على دعمها ومشورتها.

1. المبادئ التوجيهية العامة للبروتوكول
<ol><li>حافظ على المجهر على طاولة هوائية أو على الأقل على طاولة خالية من الاهتزاز. تأكد من الحفاظ على الاهتزازات الدخيلة (على سبيل المثال ، النقر على القدم على الأرض ، ولمس الطاولة ، وإغلاق الأبواب ، وحركة المرور في المختبر) إلى الحد الأدنى.</li>
	<...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

هناك عدة طرق متاحة لتقدير حجم وتركيز الجسيمات النانوية11. وتشمل هذه الطرق الجماعية التي تولد تقديرا للحجم من السكان ، بما في ذلك تشتت الضوء الديناميكي (DLS) ، والترسيب بالطرد المركزي ، وتحليل مستوى الجسيمات الواحدة - المجهر الإلكتروني ، NTA ، مجهر القوة الذرية ، واستشعار النبض الم...

يمثل التحليل الدقيق والقابل للتكرار للمركبات الكهربائية وغيرها من الجسيمات ذات مقياس النانومتر العديد من التحديات عبر البحث والصناعة. كان تكرار أبحاث EV صعبا ، جزئيا ، بسبب عدم وجود توحيد في الإبلاغ عن المعلمات الضرورية المرتبطة بجمع البيانات. لمعالجة أوجه القصور هذه ، اقترحت ISEV إرشادات الصناعة كمجموعة دنيا من المعايير الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والوظيفية للباحثين في مجال EV ونشرتها كبيان موقف ، يشار إليه عادة باسم MISEV20141. تطلبت الوتيرة المتسارعة لأبحاث السيارات الكهربائية مبدأ توجيهيا محدثا ، ووسع "MISEV2018: بيان موقف ISEV" إرشادات MISEV20142. تضمنت ورقة MISEV2018 جداول وخطوطا عريضة للبروتوكولات المقترحة وخطوات يجب اتباعها لتوثيق توصيف محدد مرتبط بالمركبات الكهربائية. وكتدبير إضافي لتسهيل تفسير التجارب وتكرارها، تم تطوير EV-TRACK كقاعدة معارف للتعهيد الجماعي (http://evtrack.org) لتمكين الإبلاغ بشكل أكثر شفافية عن بيولوجيا المركبات الكهربائية والمنهجية المستخدمة في النتائج المنشورة3. وعلى الرغم من هذه التوصيات المتعلقة بتوحيد أساليب الإبلاغ عن الأساليب، لا يزال الميدان يعاني فيما يتعلق بتكرار النتائج المنشورة وتأكيدها.
بما يتناسب مع جهود المعاهد الوطنية للصحة والمؤسسة الوطنية للعلوم لأدوات تقييم الجودة ، تشير هذه الورقة إلى أن ISEV يتطلب تقارير موحدة عن الأساليب والتفاصيل بحيث يمكن تطبيق أدوات تقييم البيانات بهدف تكرار النتائج بين المختبرات. يعد الإبلاغ عن مصادر الخلايا وإجراءات زراعة الخلايا وطرق عزل المركبات الكهربائية عوامل مهمة لتحديد صفات سكان المركبات الكهربائية. ومن بين أدوات NTA، فإن عوامل مثل إعدادات الكشف، ومعامل الانكسار للسائل الناقل، ومجموعات الجسيمات غير المتجانسة التي تسهم في تعدد التشتت، وعدم وجود متطلبات إبلاغ موحدة، وغياب نتائج القياس داخل المراقبين وفيما بينهم، تجعل مقارنة NTA بين المختبرات صعبة أو مستحيلة.
يستخدم NTA منذ عام 2006 ، وهو طريقة شائعة لتحديد حجم الجسيمات النانوية وتحديد تركيزها والتي يستخدمها حاليا حوالي 80٪ من الباحثين في EV4. تتطلب إرشادات MISEV2018 شكلين من أشكال تحليل الحويصلة الواحدة ، والتي تعد NTA أحد الخيارات الشائعة. لا يزال NTA شائع الاستخدام لتوصيف EV بسبب إمكانية الوصول إليه على نطاق واسع ، والتكلفة المنخفضة لكل عينة ، ونظريته التأسيسية المباشرة (معادلة ستوكس - أينشتاين). يولد تقييم EV بواسطة NTA توزيعا لحجم الجسيمات وتقديرا للتركيز باستخدام تشتت ضوء الليزر وتحليل الحركة البراونية ، مع تحديد الحد الأدنى للكشف بواسطة معامل الانكسار لل EV. عند استخدام عينة سائلة من اللزوجة ودرجة الحرارة المعروفتين ، يتم تتبع مسارات المركبات الكهربائية لتحديد متوسط إزاحتها المربعة في بعدين. وهذا يسمح بحساب معامل انتشار الجسيمات وتحويله إلى قطر هيدروديناميكي مكافئ للكرة بواسطة معادلة ستوكس-أينشتاين المعدلة 5,6,7. تحليل NTA للجسيمات إلى الجسيمات له تداخل أقل من قبل التكتلات أو الجسيمات الأكبر في مجموعة غير متجانسة من المركبات الكهربائية مقارنة بطرق التوصيف الأخرى7. في حين أن عددا قليلا من الجسيمات الكبيرة لها تأثير ضئيل على دقة التحجيم ، فإن وجود كميات دقيقة من الجسيمات الكبيرة عالية تشتت الضوء يؤدي إلى انخفاض ملحوظ في اكتشاف الجسيمات الأصغر بسبب انخفاض برنامج اكتشاف EV وتتبع8. كتقنية قياس ، يعتبر NTA عموما غير منحاز للجسيمات الأكبر أو مجاميع الجسيمات ولكن يمكنه حل المجموعات السكانية متعددة الأحجام من خلال تحليل الجسيمات الفردية9. بسبب استخدام تشتت الضوء بواسطة الجسيمات ، فإن أحد قيود تحليل NTA هو أن أي جسيمات مثل الغبار أو البلاستيك أو المسحوق ذات سمات انكسار وحجم مماثلة مقارنة بالمركبات الكهربائية لا يمكن تمييزها عن المركبات الكهربائية الفعلية من خلال طريقة التوصيف هذه.
تم بيع NanoSight LM10 (محلل حجم الجسيمات النانوية) و LM14 (وحدة الليزر) منذ عام 2006 ، وعلى الرغم من تطوير نماذج أحدث من هذا الجهاز ، إلا أن هذا النموذج الخاص موجود في العديد من المرافق الأساسية ويعتبر بمثابة العمود الفقري الموثوق. هناك حاجة إلى التدريب لتحسين إعدادات NTA بشكل صحيح للحصول على قياسات عالية الدقة للحجم والتركيز. الإعدادان المهمان اللازمان لتسجيل الفيديو الأمثل هما (1) مستوى الكاميرا و (2) عتبة الكشف. يجب أن يتم تعيينها من قبل المشغل بناء على خصائص العينة. أحد القيود الرئيسية لتحليل NTA هو التوصية بتركيزات العينة بين 107 و 109 جسيمات / مل ، لتحقيق هذا التخفيف من العينة قد يكون مطلوبا10. نادرا ما تكون المحاليل المستخدمة للتخفيف ، مثل المياه المالحة العازلة بالفوسفات ، أو محلول ملحي 0.15 متر ، أو المياه فائقة النقاء ، خالية من الجسيمات التي يقل حجمها عن 220 ميكرومتر ، مما قد يؤثر على قياسات NTA. يجب إجراء توصيف NTA للحلول المستخدمة للتخفيف على نفس مستوى الكاميرا وعتبة الكشف مثل عينات الجسيمات النانوية التي يتم تحليلها. نادرا ما يتم تضمين حجم وتركيز الجسيمات النانوية الموجودة في المخففات المستخدمة في تخفيفات عينات EV في المنشورات التي تنطوي على تحليل NTA للمركبات الكهربائية.
يستخدم هذا البروتوكول تحليل NTA للجسيمات الشحمية الاصطناعية الشبيهة ب EV التي تم تقييمها باستخدام مستويات الكاميرا المحددة وعتبات الكشف والتصفية الميكانيكية للعينات لتحليل التأثيرات المنهجية لمستوى الكاميرا أو عتبة الكشف أو ترشيح العينة على مجموعة بيانات NTA. تم تصنيع الجسيمات الشحمية كما هو موضح في الملف التكميلي S1. تم استخدام الجسيمات الشحمية الاصطناعية في هذه التجربة بسبب توحيد حجمها وخصائصها الفيزيائية واستقرارها في التخزين عند 4 درجات مئوية. على الرغم من أنه كان من الممكن استخدام عينات فعلية من المركبات الكهربائية ، إلا أن تباين واستقرار المركبات الكهربائية أثناء التخزين قد يكون قد عقد هذه الدراسة وتفسيرها. تشير أوجه التشابه في تقارير NTA من (A) الجسيمات الشحمية و (B) EVs إلى أن التأثيرات المنهجية التي تم الكشف عنها للجسيمات الشحمية في هذه الورقة من المرجح أن تنطبق أيضا على توصيف EV (الشكل 1). تدعم هذه النتائج مجتمعة فكرة أن الإبلاغ الكامل عن إعدادات البرامج الحرجة ووصف معالجة العينات ، مثل التخفيف والتخفيف والترشيح ، يؤثر على قابلية تكرار بيانات NTA.
الغرض من هذه الورقة هو إثبات أن تغيير إعدادات NTA (درجة الحرارة ومستوى الكاميرا وعتبة الكشف) وإعداد العينات يغير النتائج التي تم جمعها: تم الحصول على اختلافات منهجية وكبيرة في الحجم والتركيز. نظرا لأن NTA هو أحد الخيارات الشائعة للوفاء بمواصفات توصيف MISEV2018 ، فإن هذه النتائج توضح أهمية إعداد إعداد العينات وإعدادات NTA لضمان قابلية التكرار.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> الشكل 1: تقارير NTA التمثيلية لمقارنة الجسيمات الشحمية بالمركبات الكهربائية. (أ) الجسيمات الشحمية: عينة غير مفلترة مميزة على NTA في 12 مارس 2020. (ب) المركبات الكهربائية: عينة غير مفلترة مميزة على NTA في 26 أغسطس 2021. الاختصارات: NTA = تحليل تتبع الجسيمات النانوية; EVs = الحويصلات خارج الخلية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

كان تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) أحد طرق التوصيف العديدة المستخدمة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV) منذ عام 2006. يعتبر الكثيرون أن أدوات NTA وحزم برامجها يمكن استخدامها بسهولة بعد الحد الأدنى من التدريب وأن معايرة الحجم ممكنة داخليا. نظرا لأن كل من اقتناء NTA وتحليل البرامج يشكلان توصيفا للمركبات الكهربائية ، فقد تم تناولهما في الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية 2018 (MISEV2018). بالإضافة إلى ذلك ، تم رصدها من خلال الإبلاغ الشفاف ومركزية المعرفة في أبحاث الحويصلة خارج الخلية (EV-TRACK) لتحسين متانة تجارب EV (على سبيل المثال ، تقليل التباين التجريبي بسبب العوامل غير المنضبطة).
على الرغم من الجهود المبذولة لتشجيع الإبلاغ عن الأساليب والضوابط ، فإن العديد من الأوراق البحثية المنشورة تفشل في الإبلاغ عن الإعدادات الحرجة اللازمة لإعادة إنتاج ملاحظات NTA الأصلية. ويشير عدد قليل من الأوراق البحثية إلى توصيف NTA للضوابط أو المخففات السلبية، على افتراض واضح أن المنتجات المتاحة تجاريا، مثل المياه المالحة العازلة بالفوسفات أو المياه المقطرة فائقة النقاء، خالية من الجسيمات. وبالمثل ، نادرا ما يتم الإبلاغ عن الضوابط الإيجابية أو معايير الحجم من قبل الباحثين للتحقق من حجم الجسيمات. تتضمن معادلة ستوكس-أينشتاين متغيرات لزوجة العينة ودرجة الحرارة لتحديد إزاحة الجسيمات. وبالتالي ، فإن الإبلاغ عن درجة حرارة غرفة الليزر المستقرة أثناء جمع عينة الفيديو بالكامل هو إجراء تحكم أساسي للتكرار الدقيق. كما لا يتم الإبلاغ عن ترشيح العينات أو المخففات بشكل روتيني ، وإذا كان الأمر كذلك ، فنادرا ما يتم تضمين تفاصيل المرشح (الشركة المصنعة ، ومواد الغشاء ، وحجم المسام) وظروف التخزين. يجب أن تتضمن معايير الحد الأدنى من المعايير التي وضعتها الجمعية الدولية للحويصلة خارج الخلية (ISEV) للتفاصيل التجريبية المقبولة بروتوكول NTA موثق جيدا لتوصيف المركبات الكهربائية. توفر التجربة التالية دليلا على أن بروتوكول تحليل NTA يحتاج إلى إنشاء بروتوكول تحليل من قبل الباحث الفردي وتضمينه في طرق المنشورات التي تستخدم توصيف NTA كأحد الخيارات لتلبية متطلبات MISEV2018 لتوصيف الحويصلة الواحدة.

يحتوي الجدول 1 على نتائج مقاطع فيديو NTA لعينات الجسيمات الشحمية (18 تمت تصفيتها و 18 غير مصفاة) ومخفف DPBS تمثيلي. تم الانتهاء من المقارنات عبر المجموعتين بغض النظر عن مستوى الكاميرا أو عتبة الكشف في هذه الورقة. وكان متوسط قطر الجسيمات في العينات المصفاة 108.5 نانومتر، ووضع الجسيمات 86.2 نا...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتوصيف الحويصلات خارج الخلية. تسلط هذه الورقة الضوء على المعلمات والضوابط التجريبية NTA بالإضافة إلى طريقة موحدة لتحليل وتوصيف العينات والمخففات اللازمة لاستكمال المبادئ التوجيهية المقترحة من قبل MISEV2018 و EV-TRACK للتكرار بين المختبرات.

تحسين قابلية التكرار لتلبية الحد الأدنى من المعلومات لدراسات الحويصلات خارج الخلية إرشادات 2018 في تحليل تتبع الجسيمات النانوية

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

تم تطوير هذا البروتوكول للمشغلين المبتدئين ل NanoSight LM10. باتباع التعليمات خطوة بخطوة ، يمكن الحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار. تساعد هذه التقنية على ضمان نتائج متسقة عبر عمليات تشغيل تجريبية متعددة بغض النظر عن مستوى مهارة المستخدم.لا يزال توصيف الجسيمات النانوية ، وخاصة القياس الكمي ، يمثل تحديا في مجال أبحاث الحويصلة خارج الخلية. يسمح هذا البروتوكول بإجراء تحليل ثابت لحجم وتركيز الجسيمات النانوية في التعليق. ابدأ بتنظيف الأسطح الزجاجية لوحدة الليزر باستخدام منظف عدسة عالي الجودة وورق عدسة.قبل تجميع الوحدة ، تأكد من أن ختم O-ring يجلس بشكل صحيح في أخدود غطاء خلية التدفق. ثم ضع غطاء خلية التدفق على وحدة الليزر ، مما يضمن أن الاتصالات الكهربائية في الاتجاه الصحيح. بعد ذلك ، ضع مسامير الإبهام الأربعة المحملة بنابض من خلال لوحة خلية التدفق وإشراك خيوط وحدة الليزر دون تشديد بشكل فردي.أثناء وضع ضغط موحد لأسفل على غطاء خلية التدفق ، قم بتشديد مسامير الإبهام بشكل موحد بطريقة قطرية متناوبة حتى تكون دافئة. اغسل اثنين من محاقن السل بملليلتر واحد مع محولات قفل الانزلاق ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من DPBS. قم بإزالة المكبس والتخلص منه من حقنة السل الأولى قبل إدخال المحقنة في المنفذ المتبقي لتكون بمثابة خزان مخفف أو عينة مفرغ.ثم املأ المحقنة الثانية بملليلتر واحد من DPBS وقم بإرفاقها بمنفذ مدخل غطاء خلية التدفق. أمسك وحدة الليزر مائلة مع رفع منفذ حقنة المخرج للسماح بتطهير الهواء من الغرفة أثناء حقن DPBS ببطء في وحدة الليزر. اطرد DPBS المتبقية من وحدة الليزر عن طريق حقن ملليلتر واحد من الهواء في منفذ المدخل.كرر التنظيف مرتين. بعد التدفق الأخير ، قم بإفراغ وحدة الليزر بالكامل قدر الإمكان وقم بتحميل الوحدة للتركيز وتحديد المواقع. افتح البرنامج.ضمن علامة التبويب التقاط في الزاوية العلوية اليمنى، انقر فوق بدء تشغيل الكاميرا. إذا تم إيقاف تشغيل الكاميرا تلقائيا بعد خمس دقائق، فانقر فوق بدء تشغيل الكاميرا لإعادة تشغيلها. في نفس علامة التبويب، اضبط مستوى الكاميرا على 14 إلى 16 لتفتيح خط الليزر وتبسيط تحديد الجسيمات والتركيز البؤري.من خلال تحريك شريط التمرير العلوي على الجانب الأيسر من قطعة الرأس للداخل أو للخارج، قم بتحويل الصورة من الكاميرا إلى العدسات. في مجال الرؤية، أوجد مساحة الكثافة المتزايدة، المشار إليها باسم بصمة الإبهام والوسط، وركز بصمة الإبهام عموديا. في مجال الرؤية، قم بتوسيط خط الليزر، ثم حرك شريط التمرير العلوي لتحويل الضوء إلى الكاميرا كما هو ملاحظ على شاشة الكمبيوتر.الصورة على شاشة الكمبيوتر هي صورة طبق الأصل من العرض في عيادات المجهر. اضبط التركيز البؤري لتوضيح صورة الجسيمات المتحركة الفردية على الشاشة باستخدام مقبض التركيز البؤري. لتحميل العينات، ارسم ملليلتر واحد من العينة في حقنة درنية بالملليلتر واحد وشطف وقم بتوصيل المحقنة بمنفذ مدخل غطاء خلية التدفق.استمر في تطوير المكبس حتى يتضح السائل في المحقنة المفتوحة المتصلة بمنفذ المخرج. يجب إمالة الوحدة للسماح بتطهير الهواء من وحدة الليزر. في طريقة عرض الكاميرا، انقل التركيز البؤري إلى يسار خط الليزر إلى منطقة بها عدد موحد من الجسيمات.اضبط الاتجاه الرأسي لتوسيط نطاقات الضوء الأفقية وأعد التركيز البؤري حتى يظهر أكبر عدد من الجسيمات. ضمان الحفاظ على وضع التركيز متسقا لجميع التدابير اللاحقة. اضبط مستوى الكاميرا بحيث يومض رمز المعلومات المظلمة بشكل متقطع في أعلى يسار عرض الكاميرا.لتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، أو NTA ، اضبط المدة على 30 أو 60 ثانية وعدد مقاطع الفيديو على خمسة. لتغيير اسم الملف الأساسي الموجود، انقر فوق علامة التبويب الخاصة بموقع تخزين جديد للبيانات التي تم إنشاؤها باسم ملف جديد. ثم حدد مربع درجة الحرارة المستهدفة لإدخال درجة الحرارة المطلوبة وانقر فوق إنشاء برنامج نصي لإعادة استخدام القياس القياسي.بمجرد تحميل العينة وتصبح التجربة جاهزة للتشغيل، انقر فوق إنشاء برنامج نصي وتشغيله. في الشاشة المنبثقة "تفاصيل تقرير المجموعة"، املأ الحقول بالمعلومات الضرورية عن المشغل والعينة والمخفف. عند ملء كافة الحقول المطلوبة، انقر فوق الإعدادات موافق لبدء البرنامج النصي.قبل كل التقاط فيديو، ابحث عن مطالبة بالتقدم إلى المكبس يدويا. حقن ما يقرب من 0.05 ملليلتر من العينة في غرفة الليزر. عندما تستقر الجسيمات، انقر فوق موافق. عند الانتهاء من التقاط الفيديو الخامس ، سيظهر مربع تأكيد الإعدادات مع مربع العملية.نظرا لأن الإطارات يتم تطويرها يدويا من أسفل شاشة الفيديو ، لاحظ عدد الصلبان الزرقاء التي تصنع جزيئات على الشاشة وقم بتعيين عتبة الكشف لمعالجة العينة. انتظر حتى تتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا في رسم بياني للنتائج قبل عرض إشعار مربع حوار بالاكتمال، ثم اضغط على موافق. بعد ظهور مربع إعدادات التصدير، احفظ النتائج بالنقر فوق تصدير. قم بتمييز جميع مقاطع الفيديو الخمسة التي تم التقاطها المدرجة في التجربة الحالية.بعد ذلك ، انقر فوق معالجة الملفات المحددة وانتظر حتى يظهر مربع تأكيد الإعداد في مربع العملية للوميض لتغيير عتبة الكشف ، ثم اضبط عتبة الكشف إلى المستوى المطلوب وانتقل إلى الإعداد وانقر فوق موافق. ستتم معالجة مقاطع الفيديو تلقائيا في رسم بياني للنتائج وسيتم عرض إشعار مربع حوار بالاكتمال. انقر OK.In التحليل التمثيلي ، ونتائج تحليل التتبع النانوي ، أو NTA ، لعينات الجسيمات الشحمية ومخفف DPBS التمثيلي. كان متوسط قطر الجسيمات في العينات المصفاة 108 نانومتر وتركيز 7.4 في 10 إلى الجسيمات الثامنة لكل ملليلتر.وعلى النقيض من ذلك، كان متوسط قطر الجسيمات غير المصفاة 159 نانومتر وتركيز 7.6 في 10 إلى الجسيمات الثامنة لكل ملليلتر. وعلى مستويات الكاميرا مجتمعة، ومع زيادة عتبة الكشف من اثنين إلى خمسة، أظهر متوسط حجم الجسيمات وحجمها انخفاضا كبيرا في أحجام الجسيمات للعينات التي تمت تصفيتها. وانخفضت تركيزات الجسيمات عند مستويات الكاميرا مجتمعة مع زيادة عتبة الكشف.ولم يكتشف أي فرق كبير في تركيزات الجسيمات بين العينات المصفاة وغير المصفاة. وعند عتبات الكشف مجتمعة، ومع زيادة مستوى الكاميرا من 12 إلى 14، لوحظ انخفاض في متوسط حجم الجسيمات ووضعها في العينات التي تمت تصفيتها. زادت تركيزات الجسيمات عند عتبات الكشف مجتمعة مع زيادة مستويات الكاميرا من 12 إلى 14.ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية بين العينات المصفاة وغير المصفاة. الخطوات من 4.1 إلى 5.2 مهمة للعثور على منطقة العرض الصحيحة. يعتمد تحقيق نتائج متسقة عبر عمليات تجريبية متعددة على هذه المهارة القابلة للتكرار.غالبا ما يستخدم تشتت الضوء الديناميكي كمرافق لتحليل تتبع الجسيمات النانوية في المقام الأول للحصول على إمكانات زيتا ، وهي الشحنة السطحية للجسيمات. بالنسبة لتحليل الجسيمات النانوية ، لا يزال NTA طريقة قيمة للغاية لقياس كمية الجسيمات المفيدة لأبحاث الحويصلة خارج الخلية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

تصميم مفاعل حيوي لضغط الدوري السابقين فيفو دراسة صمامات القلب الأورطي

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

تقييم توصيل الجينات البوليمرية الجسيمات النانوية من تحليل تتبع جسيمات متناهية الصغر وعالية الإنتاجية قياس التدفق الخلوي

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

رواية ثلاثي الأبعاد التدفق جهاز الدائرة لدراسة Chemokine الموجه التسرب من خلايا اعارة تحت ظروف تدفق الفسيولوجي

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

قياس طولية من خارج الخلية مصفوفة جمود في 3D نماذج ورم عن طريق تتبع الجسيمات Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

الكمي والحجم التنميط من خارج الخلية عن طريق الحويصلات الانضباطي مقاوم نبض الاستشعار

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

أجهزة الورقية للعزل وتوصيف خارج الخلية الحويصلات

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

حقن نانوحبيبات ريترودوكتال للغدة اللهاة مورين

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

تقييم استقرار التخزين من الحويصلات خارج الخلية

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

في فيفو اثنين من اللون 2-الفوتون التصوير من الخلايا المراسل الموسومة وراثيا في الجلد

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...