Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Arbejdet blev støttet af staten Kansas til Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center til MLW og NIH R21AG066488 til LKC. OLS modtog GRA-support fra MICSCB. Forfatterne takker Dr. Santosh Aryal for at have leveret de liposomer, der blev brugt i dette projekt, og medlemmerne af Weiss og Christenson laboratorierne for nyttige samtaler og feedback. Dr. Hong He takkes for teknisk support. MLW takker Betti Goren Weiss for hendes støtte og råd.

1. Generelle retningslinjer for protokollen
<ol><li>Oprethold mikroskopet på et luftbord eller som minimum på et vibrationsfrit bord. Sørg for, at fremmede vibrationer (f.eks. Fodtapning på gulvet, berøring af bordet, dørlukninger, laboratorietrafik) holdes på et minimum.</li>
	<li>Indstil og oprethold lasermodulets temperatur ved en konstant temperatur for alle videooptagelser. BEMÆRK: Den valgte temperatur var 25 °C, fordi analysatoren af nanopartikelstørrelse blev kalibreret ved denne t...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Der findes flere metoder til at estimere størrelsen og koncentrationen af nanopartikler11. Disse omfatter ensemblemetoder, der genererer et størrelsesestimat fra en population, herunder dynamisk lysspredning (DLS), centrifugalsedimentering og enkeltpartikelniveauanalyse-elektronmikroskopi, NTA, atomkraftmikroskopi og justerbar resistiv pulssensor. Af disse anvendes DLS og NTA i vid udstrækning, ikke-destruktive størrelses- og koncentrationsmålemetoder baseret på brownsk bevægelse i et ideel...

Nøjagtig og repeterbar analyse af elbiler og andre nanometerskalerede partikler giver mange udfordringer på tværs af forskning og industri. Det har været vanskeligt at kopiere forskning i elbiler, til dels på grund af den manglende ensartethed i rapporteringen af de nødvendige parametre i forbindelse med dataindsamling. For at afhjælpe disse mangler foreslog ISEV industriretningslinjer som et minimalt sæt biokemiske, biofysiske og funktionelle standarder for EV-forskere og offentliggjorde dem som en holdningserklæring, almindeligvis benævnt MISEV20141. Det accelererende tempo i EV-forskningen krævede en opdateret retningslinje, og "MISEV2018: a position statement of the ISEV" udvidede MISEV2014-retningslinjerne2. MISEV2018-papiret indeholdt tabeller, konturer af foreslåede protokoller og trin, der skulle følges for at dokumentere specifik EV-associeret karakterisering. Som en yderligere foranstaltning for at lette fortolkningen og replikeringen af eksperimenter blev EV-TRACK udviklet som en crowd-sourcing vidensbase (http://evtrack.org) for at muliggøre en mere gennemsigtig rapportering af EV-biologi og den metode, der anvendes til offentliggjorte resultater3. På trods af disse anbefalinger til standardiseret rapportering af metoder lider feltet fortsat med hensyn til replikering og bekræftelse af offentliggjorte resultater.
I tilpasning til National Institutes of Health's og National Science Foundations indsats for kvalitetsvurderingsværktøjer antyder dette papir, at ISEV kræver standardiseret rapportering af metoder og detaljer, så datavurderingsværktøjer kan anvendes med det formål at replikere resultater mellem laboratorier. Rapportering af cellekilder, cellekulturprocedurer og EV-isolationsmetoder er vigtige faktorer for at definere EV-populationens kvaliteter. Blandt NTA-instrumenter gør faktorer som detektionsindstillinger, brydningsindekset for bærervæske, heterogene partikelpopulationer, der bidrager til polydispersitet, mangel på standardiserede rapporteringskrav og fraværende intra- og interobservatørmåleresultater NTA-sammenligning mellem laboratorier vanskelig eller umulig.
NTA har i brug siden 2006 og er en populær metode til bestemmelse af nanopartikelstørrelse og koncentration, der i øjeblikket anvendes af ca. 80% af EV-forskerne4. MISEV2018-retningslinjerne kræver to former for enkelt-vesicle-analyse, hvoraf NTA er en af de populære muligheder. NTA fortsætter med at være i almindelig brug til EV-karakterisering på grund af dens brede tilgængelighed, lave omkostninger pr. Prøve og dens ligefremme grundlæggende teori (Stokes-Einstein-ligningen). EV-vurdering fra NTA genererer en partikelstørrelsesfordeling og koncentrationsestimat ved hjælp af laserlysspredning og brownsk bevægelsesanalyse, med den nedre detektionsgrænse bestemt af EV'ens brydningsindeks. Ved anvendelse af en væskeprøve med kendt viskositet og temperatur spores elbilernes baner for at bestemme deres gennemsnitlige kvadratiske forskydning i to dimensioner. Dette gør det muligt at beregne partikeldiffusionskoefficienten og konvertere til en kugleækvivalent hydrodynamisk diameter ved en modificeret Stokes-Einstein-ligning 5,6,7. NTA's partikel-til-partikel-analyse har mindre interferens fra agglomerater eller større partikler i en heterogen population af elbiler end andre metoder til karakterisering7. Mens nogle få større partikler har minimal indflydelse på størrelsesnøjagtigheden, resulterer tilstedeværelsen af lige små mængder store, høje lysspredningspartikler i en bemærkelsesværdig reduktion i detektionen af mindre partikler på grund af reduceret software EV-detektion og sporing8. Som måleteknik anses NTA generelt for ikke at være forudindtaget mod større partikler eller aggregater af partikler, men kan løse populationer af flere størrelser gennem individuel partikelanalyse9. På grund af brugen af lysspredning af partikler er en af begrænsningerne ved NTA-analyse, at partikler som støv, plast eller pulver med lignende brydnings- og størrelsesattributter sammenlignet med elbiler ikke kan differentieres fra faktiske elbiler ved denne karakteriseringsmetode.
NanoSight LM10 (nanopartikelstørrelsesanalysator) og LM14 (lasermodul) er blevet solgt siden 2006, og selvom nyere modeller af dette instrument er blevet udviklet, findes denne særlige model i mange kernefaciliteter og betragtes som en pålidelig arbejdshest. Træning er nødvendig for korrekt optimering af NTA-indstillingerne til målinger af størrelse og koncentration i høj opløsning. De to vigtige indstillinger, der er nødvendige for optimale videooptagelser, er (1) kameraniveauet og (2) detektionstærsklen. Disse skal fastsættes af driftslederen på grundlag af prøvens egenskaber. En af de største begrænsninger ved NTA-analyse er anbefalingen af prøvekoncentrationer mellem 107 og 109 partikler/ml, for at opnå denne prøvefortynding kan det være nødvendigt10. Opløsninger, der anvendes til fortynding, såsom fosfatbufret saltvand, 0,15 M saltvand eller ultrarent vand, er sjældent fri for partikler under 220 μm i størrelse, hvilket kan påvirke NTA-målingerne. NTA-karakterisering af de opløsninger, der anvendes til fortynding, skal udføres på samme kameraniveau og detektionstærskel som de nanopartikelprøver, der analyseres. Størrelsen og koncentrationen af nanopartikler, der er til stede i fortyndingsmidler, der anvendes til fortyndinger af EV-prøver, indgår sjældent i publikationer, der involverer NTA-analyse af EV'er.
Denne protokol bruger NTA-analyse af syntetiske EV-lignende liposomer evalueret ved hjælp af udvalgte kameraniveauer, detektionstærskler og mekanisk filtrering af prøverne til at analysere de systematiske virkninger af kameraniveau, detektionstærskel eller prøvefiltrering på NTA-datasættet. Liposomer blev syntetiseret som beskrevet i Supplerende fil S1. Syntetiske liposomer blev anvendt i dette eksperiment på grund af deres størrelse ensartethed, fysiske egenskaber og stabilitet i opbevaring ved 4 ° C. Selv om der kunne have været anvendt faktiske prøver af elbiler, kan heterogeniciteten og stabiliteten af elbiler under opbevaring have kompliceret denne undersøgelse og dens fortolkning. Ligheder i NTA-rapporterne fra (A) liposomer og (B) EV'er indikerer, at de systematiske virkninger, der afsløres for liposomer i dette papir, sandsynligvis også vil gælde for EV-karakterisering (figur 1). Tilsammen understøtter disse resultater forestillingen om, at fuldstændig rapportering af kritiske softwareindstillinger og beskrivelsen af prøvebehandling, såsom fortyndingsvæske, fortynding og filtrering, påvirker reproducerbarheden af NTA-data.
Formålet med dette papir er at demonstrere, at variation af NTA-indstillingerne (temperatur, kameraniveau og detektionstærskel) og prøveforberedelse ændrer de indsamlede resultater: systematiske, signifikante forskelle i størrelse og koncentration blev opnået. Da NTA er en af de populære muligheder for at opfylde MISEV2018-karakteriseringsspecifikationen, viser disse resultater vigtigheden af at rapportere prøveforberedelse og NTA-indstillinger for at sikre reproducerbarhed.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figur 1: Repræsentative NTA-rapporter for at sammenligne liposomer med elbiler. (A) Liposomer: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 12. marts 2020. (B) Elbiler: ufiltreret prøve karakteriseret på NTA den 26. august 2021. Forkortelser: NTA = Nanopartikelsporingsanalyse; ELBILER = ekstracellulære vesikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) har været en af flere karakteriseringsmetoder, der anvendes til ekstracellulær vesikelforskning (EV) siden 2006. Mange mener, at NTA-instrumenter og deres softwarepakker let kan bruges efter minimal træning, og at størrelseskalibrering er mulig internt. Da både NTA-erhvervelse og softwareanalyse udgør EV-karakterisering, behandles de i Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Derudover er de blevet overvåget af Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) for at forbedre robustheden af EV-eksperimenter (f.eks. minimere eksperimentel variation på grund af ukontrollerede faktorer).
På trods af bestræbelser på at tilskynde til rapportering af metoder og kontroller undlader mange offentliggjorte forskningsartikler at rapportere kritiske indstillinger, der er nødvendige for at gengive de originale NTA-observationer. Få papirer rapporterer NTA-karakteriseringen af negative kontroller eller fortyndingsmidler, åbenbart forudsat at kommercielt tilgængelige produkter, såsom fosfatbufret saltvand eller ultrarent destilleret vand, er partikelfrie. Tilsvarende rapporteres positive kontroller eller størrelsesstandarder sjældent af forskere for at verificere partikelstørrelse. Stokes-Einstein-ligningen indeholder prøveviskositet og temperaturvariabler for at bestemme partikelforskydning. Rapportering af den stabile laserkammertemperatur under hele prøvevideosamlingen er derfor en vigtig kontrolforanstaltning for nøjagtig replikering. Filtrering af prøver eller fortyndingsmidler rapporteres heller ikke rutinemæssigt, og i så fald er filterets specifikationer (producent, membranmateriale, porestørrelse) og opbevaringsbetingelser sjældent inkluderet. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)'s minimumsstandarder for acceptable eksperimentelle detaljer bør omfatte en veldokumenteret NTA-protokol til karakterisering af elbiler. Følgende eksperiment giver bevis for, at en NTA-analyseprotokol skal etableres af den enkelte forsker og indgå i metoderne til publikationer, der bruger NTA-karakterisering som en af mulighederne for at opfylde MISEV2018-kravene til enkelt vesikelkarakterisering.

Tabel 1 indeholder resultaterne af NTA-videoerne for liposomprøverne (18 filtrerede og 18 ufiltrerede) og et repræsentativt DPBS-fortyndingsmiddel. Sammenligninger på tværs af de to grupper blev gennemført uanset kameraniveau eller detektionstærskel i dette papir. Filtrerede prøver havde en gennemsnitlig partikeldiameter på 108,5 nm, en partikelmodus på 86,2 nm og en koncentration på 7,4 × 108 partikler / ml. I modsætning hertil havde ufiltrerede prøver en gennemsnitlig partikeldi...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanopartikelsporingsanalyse (NTA) er en meget anvendt metode til at karakterisere ekstracellulære vesikler. Dette papir fremhæver NTA eksperimentelle parametre og kontroller plus en ensartet metode til analyse og karakterisering af prøver og fortyndingsmidler, der er nødvendige for at supplere de retningslinjer, der er foreslået af MISEV2018 og EV-TRACK for reproducerbarhed mellem laboratorier.

Forbedring af reproducerbarheden for at imødekomme minimal information til undersøgelser af ekstracellulære vesikler 2018-retningslinjer i nanopartikelsporingsanalyse

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Denne protokol blev udviklet til nybegyndere af NanoSight LM10. Ved at følge de trinvise instruktioner kan der opnås nøjagtige og reproducerbare resultater. Denne teknik hjælper med at sikre ensartede resultater på tværs af flere prøvekørsler uanset brugerens færdighedsniveau.Nanopartikelkarakterisering, især kvantificering, er fortsat en udfordring inden for det ekstracellulære vesikelforskningsområde. Denne protokol muliggør en ensartet størrelses- og koncentrationsanalyse af nanopartikler i suspension. Begynd med at rengøre lasermodulets glasoverflader med en linserenser og linsepapir af god kvalitet.Før montering af modulet skal du sørge for, at O-ringforseglingen sidder korrekt i rillen på flowcelledækslet. Anbring derefter flowcelledækslet på lasermodulet, og sikre, at elektriske kontakter er i den rigtige retning. Placer derefter de fire fjederbelastede tommelfingerskruer gennem flowcellepladen og aktiver lasermodulets gevind uden at stramme individuelt.Mens du lægger ensartet tryk ned på flowcelledækslet, skal du stramme tommelfingerskruerne ensartet på en skiftevis diagonal måde, indtil de sidder tæt. Skyl to tuberkulinsprøjter på en milliliter med slip lock-adaptere tre gange med en milliliter DPBS. Fjern og kassér stemplet fra den første tuberkulinsprøjte, inden sprøjten indsættes i den resterende port for at fungere som et ugyldigt fortyndings- eller prøvereservoir.Fyld derefter den anden sprøjte med en milliliter DPBS og fastgør den til indløbsporten på flowcelledækslet. Hold lasermodulet vippet med udløbssprøjteporten hævet for at gøre det muligt at rense luft fra kammeret, når DPBS injiceres langsomt i lasermodulet. Skyl de resterende DPBS fra lasermodulet ved at injicere en milliliter luft i indløbsporten.Gentag skylning to gange. Efter den sidste skylning skal du tømme lasermodulet så fuldstændigt som muligt og indlæse modulet til fokusering og positionering. Åbn softwaren.Klik på Start kamera under fanen Capture i boksen i øverste venstre hjørne. Hvis kameraet slukker automatisk efter fem minutter, skal du klikke på Start kamera for at genstarte det. På samme fane skal du justere kameraniveauet til 14 til 16 for at gøre laserlinjen lysere og forenkle partikelidentifikation og fokus.Ved at flytte den øverste skyder i venstre side af hovedstykket ind eller ud skal du omdirigere billedet fra kameraet til okularerne. I synsfeltet skal du finde området med øget tæthed, kaldet tommelfingeraftrykket og midten, og fokusere tommelfingeraftrykket lodret. Centrer laserlinjen i synsfeltet, og flyt derefter den øverste skyder for at aflede lyset til kameraet som observeret på computerskærmen.Billedet på computerskærmen er et spejlbillede fra visningen i mikroskopets okularer. Juster fokus for at skærpe billedet af individuelle partikler i bevægelse på skærmen med fokusknappen. For at lægge prøverne udtages en milliliter af prøven i en skyllet tuberkulinsprøjte på en milliliter og fastgøres sprøjten til indløbsporten på flowcelledækslet.Fortsæt med at fremme stemplet, indtil der er tydelig væske i den åbne sprøjte, der er fastgjort til udløbsporten. Modulet skal vippes, så luft kan renses fra lasermodulet. I kameravisningen skal du flytte fokus til højre for laserlinjen til et område med et ensartet antal partikler.Juster den lodrette retning for at centrere de vandrette lysbånd, og fokuser igen, indtil det højeste antal partikler er i syne. Sørg for at holde fokuspositionen konsistent for alle efterfølgende foranstaltninger. Juster kameraniveauet til det punkt, at symbolet for mørk information blinker med mellemrum til og fra øverst til højre i kameravisningen.For nanopartikelsporingsanalyse eller NTA skal du indstille varigheden til 30 eller 60 sekunder og antallet af videoer til fem. Hvis du vil ændre det eksisterende basisfilnavn, skal du klikke på fanen for et nyt lagerwebsted for genererede data med et nyt filnavn. Marker derefter afkrydsningsfeltet måltemperatur for at indtaste den ønskede temperatur, og klik på Opret script for at genbruge standardmålingen.Når eksemplet er indlæst, og eksperimentet er klar til at køre, skal du klikke på Opret og kør script. På pop op-skærmen med angivet rapportdetaljer skal du udfylde felterne med de nødvendige oplysninger om operatoren, prøven og fortyndingsproduktet. Når alle ønskede felter er udfyldt, skal du klikke på Indstillinger OK for at starte scriptet.Før hver videooptagelse skal du kigge efter en prompt for at fremme stemplet manuelt. Der injiceres ca. 0,05 ml af prøven i laserkammeret. Når partiklerne kommer til hvile, skal du klikke på OK. Når du har afsluttet den femte videooptagelse, vises et indstillingsbekræftelsesfelt sammen med procesfeltet.Da rammerne avanceres manuelt fra bunden af videoskærmen, skal du notere antallet af blå kryds, der fremstiller partikler på skærmen, og indstille detektionstærsklen for behandling af prøven. Vent på, at videoerne automatisk behandles i et histogram af resultater, før der vises en dialogboksmeddelelse om færdiggørelse, og tryk derefter på OK. Når feltet Eksportindstillinger vises, skal du gemme resultaterne ved at klikke på eksporter. Fremhæv alle fem af de optagelsesvideoer, der er anført i det aktuelle eksperiment.Klik derefter på Behandl valgte filer, og vent på, at indstillingsbekræftelsesfeltet vises i procesfeltet for at blinke for at ændre detektionstærsklen, juster derefter registreringstærsklen til det ønskede niveau, og gå til indstilling, og klik på OK. Videoerne behandles automatisk i et histogram af resultater, og der vises en dialogboksmeddelelse om færdiggørelse. Klik OK.In den repræsentative analyse vises resultaterne af nanotrackinganalysen eller NTA for liposomprøverne og et repræsentativt DPBS-fortyndingsmiddel. Filtrerede prøver havde en gennemsnitlig partikeldiameter på 108 nanometer og en koncentration på 7,4 gange 10 til de ottende partikler pr. Milliliter.I modsætning hertil havde ufiltrerede prøver en gennemsnitlig partikeldiameter på 159 nanometer og en koncentration på 7,6 gange 10 til de ottende partikler pr. Milliliter. På kombinerede kameraniveauer, da detektionstærsklen blev øget fra to til fem, viste gennemsnits- og tilstandspartikelstørrelsen et signifikant fald i partikelstørrelserne af de filtrerede prøver. Partikelkoncentrationerne ved kombinerede kameraniveauer blev reduceret, da detektionstærsklen blev øget.Der blev ikke påvist nogen signifikant forskel i partikelkoncentrationer mellem filtrerede og ufiltrerede prøver. Ved kombinerede detektionstærskler, da kameraniveauet steg fra 12 til 14, blev der konstateret et fald i gennemsnits- og tilstandspartikelstørrelsen for de filtrerede prøver. Partikelkoncentrationerne ved kombinerede detektionstærskler steg, efterhånden som kameraniveauerne steg fra 12 til 14.Der blev ikke observeret signifikante forskelle mellem filtrerede og ufiltrerede prøver. Trin 4.1 til 5.2 er vigtige for at finde det korrekte visningsområde. At opnå ensartede resultater på tværs af flere prøvekørsler afhænger af denne gentagelige færdighed.Dynamisk lysspredning bruges ofte som ledsager til nanopartikelsporingsanalyse primært for at få zeta-potentialet, som er partiklernes overfladeladning. Til nanopartikelanalyse er NTA fortsat en meget værdifuld metode til kvantificering af partikler, der er nyttige til ekstracellulær vesikelforskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering af Polymeric Gene Delivery nanopartikler ved Nanopartikel Tracking Analyse og Højkapacitetsforskning Flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tre-dimensionel Flow Chamber Device at studere Chemokin-rettet Ekstravasation Celler Cirkulerende under fysiologiske strømning

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Longitudinal Måling af ekstracellulær matrix Stivhed i 3D tumormodeller med Partikel-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantificering og Størrelse-profilering af ekstracellulær blærer Brug Tunable Resistiv Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modificeret to-foton mikroskop: en ansøgning til sporing af intracellulære vesikler

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papir-baserede enheder til isolering og karakterisering af ekstracellulær Vesikler

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal nanopartikel injektion til Murine submandibulære kirtel

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Vurdering af opbevarings stabiliteten af ekstracellulære vesikler

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo to-farvet 2-foton billeddannelse af genetisk mærkede reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...