Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Het werk werd ondersteund door de staat Kansas aan het Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), het Johnson Cancer Research Center aan MLW en NIH R21AG066488 aan LKC. OLS kreeg GRA-ondersteuning van de MICSCB. De auteurs bedanken Dr. Santosh Aryal voor het verstrekken van de liposomen die in dit project worden gebruikt en de leden van de Weiss- en Christenson-laboratoria voor nuttige gesprekken en feedback. Dr. Hong Hij wordt bedankt voor de technische ondersteuning. MLW bedankt Betti Goren Weiss voor haar steun en raad.

1. Algemene protocolrichtlijnen
<ol><li>Houd de microscoop op een luchttafel of op zijn minst op een trillingsvrije tafel. Zorg ervoor dat externe trillingen (bijv. voettikken op de vloer, aanraken van de tafel, deursluitingen, laboratoriumverkeer) tot een minimum worden beperkt.</li>
	<li>Stel de temperatuur van de lasermodule in en houd deze op een constante temperatuur voor alle video-opnames. OPMERKING: De gekozen temperatuur was 25 °C omdat de nanodeeltjesgrootteanalysator bij die temperatuur ...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Er zijn verschillende methoden beschikbaar om de grootte en concentratie van nanodeeltjes te schatten11. Deze omvatten ensemblemethoden die een schatting van de grootte van een populatie genereren, waaronder dynamische lichtverstrooiing (DLS), centrifugale sedimentatie en analyse-elektronenmicroscopie op één deeltjesniveau, NTA, atoomkrachtmicroscopie en instelbare resistieve pulsdetectie. Hiervan zijn DLS en NTA veel gebruikte, niet-destructieve maat- en concentratiemeetmethoden, gebaseerd op B...

Nauwkeurige en herhaalbare analyse van EV's en andere deeltjes op nanometerschaal brengt tal van uitdagingen met zich mee in onderzoek en industrie. Replicatie van EV-onderzoek is moeilijk geweest, deels vanwege het gebrek aan uniformiteit in het rapporteren van noodzakelijke parameters in verband met gegevensverzameling. Om deze tekortkomingen aan te pakken, stelde de ISEV industrierichtlijnen voor als een minimale set biochemische, biofysische en functionele normen voor EV-onderzoekers en publiceerde deze als een positieverklaring, gewoonlijk MISEV20141 genoemd. Het versnellende tempo van EV-onderzoek vereiste een bijgewerkte richtlijn en de "MISEV2018: een positieverklaring van de ISEV" breidde de MISEV2014-richtlijnenuit 2. Het MISEV2018-document bevatte tabellen, schetsen van voorgestelde protocollen en stappen die moeten worden gevolgd om specifieke EV-geassocieerde karakterisering te documenteren. Als een verdere maatregel om de interpretatie en replicatie van experimenten te vergemakkelijken, werd EV-TRACK ontwikkeld als een crowd-sourcing kennisbank (http://evtrack.org) om transparantere rapportage van EV-biologie en de methodologie die wordt gebruikt voor gepubliceerde resultatenmogelijk te maken 3. Ondanks deze aanbevelingen voor gestandaardiseerde rapportage van methoden, blijft het veld lijden met betrekking tot het repliceren en bevestigen van gepubliceerde resultaten.
Passend bij de inspanningen van de National Institutes of Health en de National Science Foundation voor kwaliteitsbeoordelingsinstrumenten, suggereert dit artikel dat ISEV gestandaardiseerde rapportage van methoden en details vereist, zodat hulpmiddelen voor gegevensbeoordeling kunnen worden toegepast met als doel resultaten tussen laboratoria te repliceren. Het rapporteren van celbronnen, celkweekprocedures en EV-isolatiemethoden zijn belangrijke factoren om de kwaliteiten van de EV-populatie te definiëren. Onder NTA-instrumenten maken factoren zoals detectie-instellingen, de brekingsindex van dragervloeistof, heterogene deeltjespopulaties die bijdragen aan polydispersiteit, gebrek aan gestandaardiseerde rapportagevereisten en afwezige intra- en interwaarnemer meetresultaten NTA-vergelijking tussen laboratoria moeilijk of onmogelijk.
NTA is sinds 2006 in gebruik en is een populaire methode voor het bepalen van de grootte en concentratie van nanodeeltjes die momenteel door ongeveer 80% van de EV-onderzoekers wordt gebruikt4. De MISEV2018-richtlijnen vereisen twee vormen van analyse van één blaasje, waarvan NTA een van de populaire opties is. NTA wordt nog steeds algemeen gebruikt voor EV-karakterisering vanwege de brede toegankelijkheid, lage kosten per monster en de eenvoudige basistheorie (de Stokes-Einstein-vergelijking). EV-beoordeling door NTA genereert een deeltjesgrootteverdeling en concentratieschatting met behulp van laserlichtverstrooiing en Brownse bewegingsanalyse, waarbij de ondergrens van detectie wordt bepaald door de brekingsindex van de EV. Bij gebruik van een vloeistofmonster met bekende viscositeit en temperatuur worden de trajecten van de EV's gevolgd om hun gemiddelde vierkante verplaatsing in twee dimensies te bepalen. Hierdoor kan de deeltjesdiffusiecoëfficiënt worden berekend en omgezet in een bolequivalente hydrodynamische diameter door een gemodificeerde Stokes-Einsteinvergelijking 5,6,7. NTA's deeltjes-naar-deeltjesanalyse heeft minder interferentie door agglomeraten of grotere deeltjes in een heterogene populatie van EV's dan andere methoden van karakterisering7. Hoewel een paar grotere deeltjes een minimale impact hebben op de nauwkeurigheid van de maatvoering, resulteert de aanwezigheid van zelfs minieme hoeveelheden grote, hoge lichtverstrooiende deeltjes in een opmerkelijke vermindering van de detectie van kleinere deeltjes als gevolg van verminderde software EV-detectie en tracking8. Als meettechniek wordt NTA over het algemeen beschouwd als niet bevooroordeeld naar grotere deeltjes of aggregaten van deeltjes, maar kan het populaties van meerdere grootte oplossen door middel van individuele deeltjesanalyse9. Vanwege het gebruik van lichtverstrooiing door deeltjes, is een van de beperkingen van NTA-analyse dat deeltjes zoals stof, plastic of poeder met vergelijkbare brekings- en groottekenmerken in vergelijking met EV's niet kunnen worden onderscheiden van werkelijke EV's door deze methode van karakterisering.
De NanoSight LM10 (nanoparticle size analyzer) en LM14 (lasermodule) worden sinds 2006 verkocht, en hoewel er nieuwere modellen van dit instrument zijn ontwikkeld, is dit specifieke model te vinden in veel kernfaciliteiten en wordt het beschouwd als een betrouwbaar werkpaard. Training is nodig om de NTA-instellingen goed te optimaliseren voor metingen van grootte en concentratie met hoge resolutie. De twee belangrijke instellingen die nodig zijn voor optimale video-opnames zijn (1) het cameraniveau en (2) de detectiedrempel. Deze moeten door de exploitant worden ingesteld op basis van de kenmerken van het monster. Een van de belangrijkste beperkingen van de NTA-analyse is de aanbeveling van monsterconcentraties tussen 107 en 109 deeltjes / ml, om deze monsterverdunning te bereiken, kan10 nodig zijn. Oplossingen die worden gebruikt voor verdunning, zoals fosfaatbufferde zoutoplossing, zoutoplossing van 0,15 M of ultrapuur water, zijn zelden vrij van deeltjes kleiner dan 220 μm, wat van invloed kan zijn op de NTA-metingen. NTA-karakterisering van de oplossingen die worden gebruikt voor verdunning moet worden uitgevoerd op hetzelfde cameraniveau en dezelfde detectiedrempel als de nanodeeltjesmonsters die worden geanalyseerd. De grootte en concentratie van nanodeeltjes die aanwezig zijn in verdunningsmiddelen die worden gebruikt voor ev-monsterverdunningen worden zelden opgenomen in publicaties met betrekking tot NTA-analyse van EV's.
Dit protocol maakt gebruik van NTA-analyse van synthetische EV-achtige liposomen geëvalueerd met behulp van geselecteerde cameraniveaus, detectiedrempels en mechanische filtering van de monsters om de systematische effecten van cameraniveau, detectiedrempel of monsterfiltratie op de NTA-dataset te analyseren. Liposomen werden gesynthetiseerd zoals beschreven in Supplemental File S1. Synthetische liposomen werden in dit experiment gebruikt vanwege hun grootte-uniformiteit, fysieke kenmerken en stabiliteit bij opslag bij 4 °C. Hoewel er gebruik had kunnen worden gemaakt van daadwerkelijke monsters van EV's, kan de heterogeniciteit en stabiliteit van EV's tijdens opslag deze studie en de interpretatie ervan hebben bemoeilijkt. Overeenkomsten in de NTA-rapporten van (A) liposomen en (B) EV's geven aan dat de systematische effecten die in dit artikel voor liposomen worden onthuld, waarschijnlijk ook van toepassing zullen zijn op EV-karakterisering (figuur 1). Samen ondersteunen deze bevindingen het idee dat volledige rapportage van kritieke software-instellingen en de beschrijving van monsterverwerking, zoals verdunningsmiddel, verdunning en filtratie, van invloed zijn op de reproduceerbaarheid van NTA-gegevens.
Het doel van dit artikel is om aan te tonen dat het variëren van de NTA-instellingen (temperatuur, cameraniveau en detectiedrempel) en monstervoorbereiding de verzamelde resultaten verandert: systematische, significante verschillen in grootte en concentratie werden verkregen. Aangezien NTA een van de populaire opties is om te voldoen aan de MISEV2018-karakteriseringsspecificatie, tonen deze resultaten het belang aan van het rapporteren van monstervoorbereiding en NTA-instellingen om reproduceerbaarheid te garanderen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figuur 1: Representatieve NTA-rapporten om liposomen te vergelijken met EV's. (A) Liposomen: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 12 maart 2020. (B) EV's: ongefilterd monster gekarakteriseerd op NTA op 26 augustus 2021. Afkortingen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV's = extracellulaire blaasjes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanoparticle tracking analysis (NTA) is sinds 2006 een van de vele karakteriseringsmethoden die worden gebruikt voor onderzoek naar extracellulaire blaasjes (EV). Velen zijn van mening dat NTA-instrumenten en hun softwarepakketten gemakkelijk kunnen worden gebruikt na minimale training en dat kalibratie van de grootte intern haalbaar is. Aangezien zowel NTA-acquisitie als software-analyse EV-karakterisering vormen, worden ze behandeld in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Bovendien zijn ze gemonitord door Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) om de robuustheid van EV-experimenten te verbeteren (bijvoorbeeld experimentele variatie als gevolg van ongecontroleerde factoren minimaliseren).
Ondanks inspanningen om de rapportage van methoden en controles aan te moedigen, rapporteren veel gepubliceerde onderzoeksdocumenten geen kritieke instellingen die nodig zijn om de oorspronkelijke NTA-waarnemingen te reproduceren. Weinig artikelen melden de NTA-karakterisering van negatieve controles of verdunningsmiddelen, kennelijk ervan uitgaande dat commercieel verkrijgbare producten, zoals fosfaat-gebufferde zoutoplossing of ultrapuur gedestilleerd water, deeltjesvrij zijn. Evenzo worden positieve controles of groottenormen zelden gerapporteerd door onderzoekers om de deeltjesgrootte te verifiëren. De Stokes-Einstein-vergelijking bevat monsterviscositeit en temperatuurvariabelen om deeltjesverplaatsing te bepalen. Het rapporteren van de stabiele temperatuur van de laserkamer tijdens de gehele monstervideoverzameling is daarom een essentiële controlemaatregel voor nauwkeurige replicatie. De filtratie van monsters of verdunningsmiddelen wordt ook niet routinematig gerapporteerd, en als dat zo is, worden de specifieke kenmerken van het filter (fabrikant, membraanmateriaal, poriegrootte) en opslagomstandigheden zelden opgenomen. De minimale normen van de International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) voor acceptabele experimentele details moeten een goed gedocumenteerd NTA-protocol bevatten voor de karakterisering van EV's. Het volgende experiment levert bewijs dat een NTA-analyseprotocol moet worden vastgesteld door de individuele onderzoeker en moet worden opgenomen in de methoden van publicaties die NTA-karakterisering gebruiken als een van de opties om te voldoen aan de MISEV2018-vereisten voor karakterisering van één blaasje.

Tabel 1 bevat de resultaten van de NTA-video's voor de liposoommonsters (18 gefilterd en 18 ongefilterd) en een representatief DPBS-verdunningsmiddel. Vergelijkingen tussen de twee groepen werden voltooid, ongeacht het cameraniveau of de detectiedrempel in dit artikel. Gefilterde monsters hadden een gemiddelde deeltjesdiameter van 108,5 nm, een deeltjesmodus van 86,2 nm en een concentratie van 7,4 × 108 deeltjes/ml. Ongefilterde monsters hadden daarentegen een gemiddelde deeltjesdiameter van ...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanoparticle tracking analysis (NTA) is een veelgebruikte methode om extracellulaire blaasjes te karakteriseren. Dit artikel belicht NTA experimentele parameters en controles plus een uniforme methode voor analyse en karakterisering van monsters en verdunningsmiddelen die nodig zijn om de richtlijnen van MISEV2018 en EV-TRACK voor reproduceerbaarheid tussen laboratoria aan te vullen.

Verbetering van de reproduceerbaarheid om te voldoen aan minimale informatie voor studies van extracellulaire blaasjes 2018 Richtlijnen voor het volgen van nanodeeltjes

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Dit protocol is ontwikkeld voor beginnende operators van de NanoSight LM10. Door de stapsgewijze instructies te volgen, kunnen nauwkeurige en reproduceerbare resultaten worden verkregen. Deze techniek zorgt voor consistente resultaten in meerdere proefversies, ongeacht het vaardigheidsniveau van de gebruiker.Nanodeeltjeskarakterisering, met name kwantificering, blijft een uitdaging in het onderzoeksveld van extracellulaire blaasjes. Dit protocol maakt een consistente grootte- en concentratieanalyse van nanodeeltjes in suspensie mogelijk. Begin met het reinigen van de glasoppervlakken van de lasermodule met een lensreiniger van goede kwaliteit en lenspapier.Voordat u de module monteert, moet u ervoor zorgen dat de O-ringafdichting goed in de groef van het deksel van de stroomcel zit. Plaats vervolgens het deksel van de stroomcel op de lasermodule en zorg ervoor dat de elektrische contacten in de juiste richting staan. Plaats vervolgens de vier veerbelaste duimschroeven door de stroomcelplaat en schakel de draden van de lasermodule in zonder afzonderlijk aan te spannen.Terwijl u een gelijkmatige druk uitoefent op het deksel van de stroomcel, draait u de duimschroeven gelijkmatig aan op een afwisselend diagonale manier totdat ze goed zitten. Spoel twee tuberculinespuiten van één milliliter met sliplockadapters drie keer door met één milliliter DPBS. Verwijder de zuiger uit de eerste tuberculinespuit en gooi deze weg voordat u de spuit in de resterende poort steekt om als een leeggemaakt verdunningsmiddel of monsterreservoir te dienen.Vul vervolgens de tweede spuit met één milliliter DPBS en bevestig deze aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel. Houd de lasermodule gekanteld met de poort van de uitlaatspuit omhoog zodat lucht uit de kamer kan worden gespoeld terwijl de DPBS langzaam in de lasermodule wordt geïnjecteerd. Spoel de resterende DPBS uit de lasermodule door één milliliter lucht in de inlaatpoort te injecteren.Herhaal het spoelen twee keer. Leeg na de laatste spoeling de lasermodule zo volledig mogelijk en laad de module voor scherpstellen en positioneren. Open de software.Klik onder het tabblad Vastleggen in het vak in de linkerbovenhoek op Camera starten. Als de camera na vijf minuten automatisch wordt uitgeschakeld, klikt u op Camera starten om deze opnieuw op te starten. Pas op hetzelfde tabblad het cameraniveau aan op 14 tot 16 om de laserlijn helderder te maken en de identificatie en focus van deeltjes te vereenvoudigen.Door de bovenste schuifregelaar aan de linkerkant van het hoofdstuk naar binnen of naar buiten te bewegen, leidt u het beeld van de camera naar de oculairs. Zoek in het gezichtsveld het gebied met verhoogde dichtheid, aangeduid als de vingerafdruk en het midden, en focus de vingerafdruk verticaal. Centreer in het gezichtsveld de laserlijn en verplaats vervolgens de bovenste schuifregelaar om licht naar de camera te leiden zoals waargenomen op het computerscherm.Het beeld op het computerscherm is een spiegelbeeld van het zicht in de microscoop oculairs. Pas de scherpstelling aan om het beeld van individuele bewegende deeltjes op het scherm te verscherpen met de scherpstelknop. Om de monsters te laden, zuigt u één milliliter van het monster op in een gespoelde tuberculinespuit van één milliliter en bevestigt u de spuit aan de inlaatpoort van het deksel van de stroomcel.Blijf de zuiger naar voren schuiven totdat er vloeistof zichtbaar is in de open spuit die aan de uitlaatpoort is bevestigd. De module moet worden gekanteld zodat lucht uit de lasermodule kan worden gezuiverd. Verplaats in de cameraweergave de scherpstelling rechts van de laserlijn naar een gebied met een uniform aantal deeltjes.Pas de verticale oriëntatie aan om de horizontale lichtbanden te centreren en stel opnieuw scherp totdat het grootste aantal deeltjes in beeld is. Zorg ervoor dat de positie van de focus consistent blijft voor alle volgende maatregelen. Pas het cameraniveau aan op het punt dat het donkere informatiesymbool met tussenpozen in- en uitschakelt in de rechterbovenhoek van de cameraweergave.Voor nanodeeltjestrackinganalyse of NTA stelt u de duur in op 30 of 60 seconden en het aantal video's op vijf. Als u de bestaande basisbestandsnaam wilt wijzigen, klikt u op het tabblad voor een nieuwe opslagsite voor gegenereerde gegevens met een nieuwe bestandsnaam. Vink vervolgens het vakje doeltemperatuur aan om de gewenste temperatuur in te voeren en klik op script maken om de standaardmeting opnieuw te gebruiken.Zodra het voorbeeld is geladen en het experiment klaar is om te worden uitgevoerd, klikt u op Script maken en uitvoeren. Vul in het pop-upscherm met ingestelde rapportdetails de velden in met de benodigde informatie over de operator, het monster en het verdunningsmiddel. Wanneer alle gewenste velden zijn ingevuld, klikt u op instellingen OK om het script te starten.Zoek voorafgaand aan elke video-opname naar een prompt om de zuiger handmatig vooruit te helpen. Injecteer ongeveer 0,05 milliliter van het monster in de laserkamer. Als de deeltjes tot rust komen, klikt u op OK. Na het voltooien van de vijfde video-opname verschijnt er een bevestigingsvak voor instellingen samen met het procesvak.Aangezien de frames handmatig vanaf de onderkant van het videoscherm worden gevorderd, noteert u het aantal blauwe kruisen dat deeltjes op het scherm maakt en stelt u de detectiedrempel in voor de verwerking van het monster. Wacht tot de video's automatisch worden verwerkt in een histogram met resultaten voordat een dialoogvenstermelding van voltooiing wordt weergegeven en druk vervolgens op OK. Nadat het vak exportinstellingen is weergegeven, slaat u de resultaten op door op exporteren te klikken. Markeer alle vijf de opnamevideo's die in het huidige experiment worden vermeld.Klik vervolgens op geselecteerde bestanden verwerken en wacht tot het bevestigingsvak voor de instelling in het procesvak verschijnt om de detectiedrempel te wijzigen, pas vervolgens de detectiedrempel aan op het gewenste niveau en ga naar instelling en klik op OK. De video's worden automatisch verwerkt in een histogram van resultaten en er wordt een dialoogvenstermelding van voltooiing weergegeven. Klik OK.In de representatieve analyse, de resultaten van de nanotracking analyse, of NTA, voor de liposoommonsters en een representatief DPBS verdunningsmiddel worden getoond. Gefilterde monsters hadden een gemiddelde deeltjesdiameter van 108 nanometer en een concentratie van 7,4 keer 10 tot de achtste deeltjes per milliliter.Ongefilterde monsters hadden daarentegen een gemiddelde deeltjesdiameter van 159 nanometer en een concentratie van 7,6 keer 10 tot de achtste deeltjes per milliliter. Op gecombineerde cameraniveaus, toen de detectiedrempel werd verhoogd van twee naar vijf, vertoonden de gemiddelde en modusdeeltjesgrootte een significante afname van de deeltjesgrootte van de gefilterde monsters. Deeltjesconcentraties bij gecombineerde cameraniveaus daalden naarmate de detectiedrempel werd verhoogd.Er werd geen significant verschil in deeltjesconcentraties tussen gefilterde en ongefilterde monsters gedetecteerd. Bij gecombineerde detectiedrempels, toen het cameraniveau steeg van 12 naar 14, werd een afname van de gemiddelde en modusdeeltjesgrootte van de gefilterde monsters opgemerkt. Deeltjesconcentraties bij gecombineerde detectiedrempels namen toe naarmate de cameraniveaus toenamen van 12 naar 14.Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen gefilterde en ongefilterde monsters. Stap 4.1 tot en met 5.2 zijn belangrijk om het juiste weergavegebied te vinden. Het bereiken van consistente resultaten in meerdere proefruns hangt af van deze herhaalbare vaardigheid.Dynamische lichtverstrooiing wordt vaak gebruikt als een metgezel voor nanodeeltjesvolganalyse, voornamelijk om de zetapotentiaal te krijgen, wat de oppervlaktelading van de deeltjes is. Voor nanodeeltjesanalyse blijft NTA een zeer waardevolle methode voor kwantificering van deeltjes die nuttig zijn voor extracellulair blaasjesonderzoek.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluatie van polymere Gene Delivery Nanodeeltjes door Nanodeeltje Tracking Analyse en High-throughput Flow cytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Driedimensionale Flow Kamer Device aan chemokine-gerichte extravasatie van Cellen doorgeven Studie onder Fysiologische stroomtoestanden

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Longitudinale Meting van extracellulaire matrix stijfheid in 3D Tumor modellen met-Particle Tracking Microreologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kwantificering en Maat-profilering van extracellulaire blaasjes behulp Melodieuze Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking in een gemodificeerde twee-foton microscoop: een toepassing op het volgen van intracellulaire blaasjes

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papieren Inrichtingen voor isolatie en karakterisering van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal Nanoparticle injectie aan de lymfkliertest submandibulaire klier

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluatie van de opslag stabiliteit van extracellulaire blaasjes

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo tweekleurige 2-Fobe beeldvorming van genetisch gelabelde reporter cellen in de huid

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...