Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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Le travail a été soutenu par l’État du Kansas au Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), au Johnson Cancer Research Center à MLW et NIH R21AG066488 à LKC. OLS a reçu le soutien de la GRA du MICSCB. Les auteurs remercient le Dr Santosh Aryal d’avoir fourni les liposomes utilisés dans ce projet et les membres des laboratoires Weiss et Christenson pour des conversations et des commentaires utiles. Le Dr Hong He est remercié pour son soutien technique. MLW remercie Betti Goren Weiss pour son soutien et ses conseils.

1. Lignes directrices générales du protocole
<ol><li>Maintenez le microscope sur une table à air ou au minimum sur une table sans vibrations. Veiller à ce que les vibrations étrangères (p. ex., tapotement du pied sur le sol, toucher la table, fermeture des portes, circulation en laboratoire) soient réduites au minimum.</li>
	<li>Réglez et maintenez la température du module laser à une température constante pour tous les enregistrements vidéo. REMARQUE: La température choisie était de 2...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Il existe plusieurs méthodes pour estimer la taille et la concentration des nanoparticules11. Il s’agit notamment de méthodes d’ensemble qui génèrent une estimation de la taille à partir d’une population, y compris la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la sédimentation centrifuge et l’analyse au niveau d’une seule particule - microscopie électronique, NTA, microscopie à force atomique et détection d’impulsion résistive accordable. Parmi ceux-ci, DLS et NTA sont des mé...

L’analyse précise et reproductible des véhicules électriques et d’autres particules à l’échelle nanométrique présente de nombreux défis dans la recherche et l’industrie. La réplication de la recherche sur les véhicules électriques a été difficile, en partie, en raison du manque d’uniformité dans la déclaration des paramètres nécessaires associés à la collecte de données. Pour remédier à ces lacunes, l’ISEV a proposé des lignes directrices de l’industrie en tant qu’ensemble minimal de normes biochimiques, biophysiques et fonctionnelles pour les chercheurs en VE et les a publiées sous forme d’énoncé de position, communément appelé MISEV20141. L’accélération du rythme de la recherche sur les véhicules électriques nécessitait une mise à jour des lignes directrices, et le « MISEV2018 : un énoncé de position de l’ISEV » a élargi les lignes directrices MISEV20142. Le document MISEV2018 comprenait des tableaux, des aperçus de protocoles suggérés et des étapes à suivre pour documenter la caractérisation spécifique associée aux VE. En tant que mesure supplémentaire pour faciliter l’interprétation et la réplication des expériences, EV-TRACK a été développé en tant que base de connaissances sur le crowdsourcing (http://evtrack.org) pour permettre des rapports plus transparents sur la biologie des VE et la méthodologie utilisée pour les résultatspubliés 3. Malgré ces recommandations pour la déclaration normalisée des méthodes, le domaine continue de souffrir de la réplication et de la confirmation des résultats publiés.
S’inscrivant dans les efforts des National Institutes of Health et de la National Science Foundation pour les outils d’évaluation de la qualité, cet article suggère que l’ISEV exige des rapports normalisés sur les méthodes et les détails afin que les outils d’évaluation des données puissent être appliqués dans le but de reproduire les résultats entre les laboratoires. La déclaration des sources cellulaires, les procédures de culture cellulaire et les méthodes d’isolement des VE sont des facteurs importants pour définir les qualités de la population de VE. Parmi les instruments de la NTA, des facteurs tels que les paramètres de détection, l’indice de réfraction du fluide porteur, les populations de particules hétérogènes contribuant à la polydispersité, l’absence d’exigences de déclaration normalisées et l’absence de résultats de mesure intra- et inter-observateurs rendent la comparaison de la NTA entre les laboratoires difficile, voire impossible.
Utilisée depuis 2006, la NTA est une méthode populaire pour la détermination de la taille et de la concentration des nanoparticules qui est actuellement utilisée par environ 80 % des chercheurs sur les VE4. Les lignes directrices MISEV2018 exigent deux formes d’analyse d’une seule vésicule, dont la NTA est l’une des options populaires. La NTA continue d’être couramment utilisée pour la caractérisation des véhicules électriques en raison de sa grande accessibilité, de son faible coût par échantillon et de sa théorie fondatrice simple (l’équation de Stokes-Einstein). L’évaluation ev par NTA génère une estimation de la distribution granulométrique et de la concentration à l’aide de la diffusion de la lumière laser et de l’analyse du mouvement brownien, la limite inférieure de détection étant déterminée par l’indice de réfraction de l’EV. Lors de l’utilisation d’un échantillon de fluide de viscosité et de température connues, les trajectoires des VE sont suivies pour déterminer leur déplacement moyen-carré en deux dimensions. Cela permet de calculer le coefficient de diffusion des particules et de le convertir en un diamètre hydrodynamique équivalent à une sphère par une équation de Stokes-Einstein modifiée 5,6,7. L’analyse particule à particule de NTA a moins d’interférences par des agglomérats ou des particules plus grosses dans une population hétérogène de VE que d’autres méthodes de caractérisation7. Alors que quelques particules plus grosses ont un impact minimal sur la précision du dimensionnement, la présence de quantités même infimes de grosses particules à diffusion de lumière élevée entraîne une réduction notable de la détection de particules plus petites en raison de la réduction de la détection et du suivi des VÉHICULES électriques par logiciel8. En tant que technique de mesure, la NTA est généralement considérée comme n’étant pas biaisée en faveur de particules plus grosses ou d’agrégats de particules, mais peut résoudre des populations de plusieurs tailles grâce à une analyse individuelle des particules9. En raison de l’utilisation de la diffusion de la lumière par les particules, l’une des limites de l’analyse NTA est que toute particule telle que la poussière, le plastique ou la poudre ayant des attributs de réfraction et de taille similaires à ceux des véhicules électriques ne peut pas être différenciée des véhicules électriques réels par cette méthode de caractérisation.
Le NanoSight LM10 (analyseur de taille de nanoparticules) et le LM14 (module laser) sont vendus depuis 2006, et bien que de nouveaux modèles de cet instrument aient été développés, ce modèle particulier se trouve dans de nombreuses installations de base et est considéré comme un cheval de bataille fiable. Une formation est nécessaire pour optimiser correctement les paramètres NTA pour les mesures à haute résolution de la taille et de la concentration. Les deux paramètres importants nécessaires pour des enregistrements vidéo optimaux sont (1) le niveau de la caméra et (2) le seuil de détection. Ceux-ci doivent être définis par l’opérateur en fonction des caractéristiques de l’échantillon. L’une des principales contraintes de l’analyse NTA est la recommandation de concentrations d’échantillon comprises entre 107 et 109 particules/mL, pour atteindre cette dilution d’échantillon peut être nécessaire10. Les solutions utilisées pour la dilution, telles que la solution saline tamponnée au phosphate, la solution saline 0,15 M ou l’eau ultrapure, sont rarement exemptes de particules de moins de 220 μm, ce qui peut affecter les mesures de la NTA. La caractérisation NTA des solutions utilisées pour la dilution doit être effectuée au même niveau de caméra et au même seuil de détection que les échantillons de nanoparticules analysés. La taille et la concentration des nanoparticules présentes dans les diluants utilisés pour les dilutions d’échantillons de VE sont rarement incluses dans les publications impliquant l’analyse NTA des VE.
Ce protocole utilise l’analyse NTA de liposomes synthétiques de type EV évalués à l’aide de niveaux de caméra sélectionnés, de seuils de détection et de filtrage mécanique des échantillons pour analyser les effets systématiques du niveau de la caméra, du seuil de détection ou de la filtration des échantillons sur l’ensemble de données NTA. Les liposomes ont été synthétisés comme décrit dans le fichier supplémentaire S1. Les liposomes synthétiques ont été utilisés dans cette expérience en raison de leur uniformité de taille, de leurs caractéristiques physiques et de leur stabilité dans le stockage à 4 ° C. Bien que des échantillons réels de ves aient pu être utilisés, l’hétérogénicité et la stabilité des VE pendant le stockage peuvent avoir compliqué cette étude et son interprétation. Les similitudes dans les rapports NTA des liposomes (A) et des VE (B) indiquent que les effets systématiques révélés pour les liposomes dans cet article s’appliqueront probablement aussi à la caractérisation des VE (Figure 1). Ensemble, ces résultats appuient l’idée que la déclaration complète des paramètres logiciels critiques et la description du traitement des échantillons, tels que le diluant, la dilution et la filtration, ont une incidence sur la reproductibilité des données NTA.
Le but de cet article est de démontrer que la variation des paramètres NTA (température, niveau de la caméra et seuil de détection) et de la préparation des échantillons modifie les résultats recueillis : des différences systématiques et significatives de taille et de concentration ont été obtenues. Comme le NTA est l’une des options populaires pour répondre à la spécification de caractérisation MISEV2018, ces résultats démontrent l’importance de déclarer la préparation des échantillons et les paramètres NTA pour assurer la reproductibilité.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figure 1 : Rapports représentatifs de la NTA pour comparer les liposomes aux ve. (A) Liposomes: échantillon non filtré caractérisé sur NTA le 12 mars 2020. B) VE: échantillon non filtré caractérisé sur NTA le 26 août 2021. Abréviations : NTA = Analyse de suivi des nanoparticules; VE = vésicules extracellulaires. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est l’une des nombreuses méthodes de caractérisation utilisées pour la recherche sur les vésicules extracellulaires (EV) depuis 2006. Beaucoup considèrent que les instruments NTA et leurs progiciels peuvent être facilement utilisés après une formation minimale et que l’étalonnage de la taille est réalisable en interne. Comme l’acquisition de NTA et l’analyse logicielle constituent toutes deux une caractérisation des VE, elles sont abordées dans Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). En outre, ils ont été surveillés par Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) afin d’améliorer la robustesse des expériences sur les VE (par exemple, minimiser les variations expérimentales dues à des facteurs incontrôlés).
Malgré les efforts déployés pour encourager la déclaration des méthodes et des contrôles, de nombreux documents de recherche publiés ne rendent pas compte des paramètres critiques nécessaires pour reproduire les observations originales de la NTA. Peu d’articles rapportent la caractérisation par la NTA de témoins négatifs ou de diluants, en supposant évidemment que les produits disponibles dans le commerce, tels que la solution saline tamponnée au phosphate ou l’eau distillée ultrapure, sont exempts de particules. De même, les témoins positifs ou les normes de taille sont rarement rapportés par les chercheurs pour vérifier le dimensionnement des particules. L’équation de Stokes-Einstein incorpore des variables de viscosité et de température de l’échantillon pour déterminer le déplacement des particules. Le signalement de la température stable de la chambre laser pendant toute la collecte vidéo de l’échantillon est donc une mesure de contrôle essentielle pour une réplication précise. La filtration des échantillons ou des diluants n’est pas non plus systématiquement rapportée et, dans l’affirmative, les spécificités du filtre (fabricant, matériau de la membrane, taille des pores) et les conditions de stockage sont rarement incluses. Les normes minimales de détails expérimentaux acceptables de l’International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) devraient inclure un protocole NTA bien documenté pour la caractérisation des VE. L’expérience suivante fournit des preuves qu’un protocole d’analyse NTA doit être établi par le chercheur individuel et inclus dans les méthodes de publications qui utilisent la caractérisation NTA comme l’une des options pour répondre aux exigences MISEV2018 pour la caractérisation de vésicules uniques.

Le tableau 1 contient les résultats des vidéos NTA pour les échantillons de liposomes (18 filtrés et 18 non filtrés) et un diluant DPBS représentatif. Des comparaisons entre les deux groupes ont été effectuées, quel que soit le niveau de la caméra ou le seuil de détection dans le présent document. Les échantillons filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 108,5 nm, un mode de particules de 86,2 nm et une concentration de 7,4 × 108 particules/mL. En revanche, les échan...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

L’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) est une méthode largement utilisée pour caractériser les vésicules extracellulaires. Cet article met en évidence les paramètres expérimentaux et les contrôles de la NTA ainsi qu’une méthode uniforme d’analyse et de caractérisation des échantillons et des diluants nécessaires pour compléter les lignes directrices proposées par MISEV2018 et EV-TRACK pour la reproductibilité entre les laboratoires.

Améliorer la reproductibilité pour répondre aux informations minimales pour les études sur les vésicules extracellulaires 2018 Lignes directrices dans l’analyse de suivi des nanoparticules

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Ce protocole a été développé pour les opérateurs novices du NanoSight LM10. En suivant les instructions étape par étape, des résultats précis et reproductibles peuvent être obtenus. Cette technique permet d’assurer des résultats cohérents sur plusieurs essais, quel que soit le niveau de compétence de l’utilisateur.La caractérisation des nanoparticules, en particulier la quantification, continue d’être un défi dans le domaine de la recherche sur les vésicules extracellulaires. Ce protocole permet une analyse cohérente de la taille et de la concentration des nanoparticules en suspension. Commencez par nettoyer les surfaces vitrées du module laser avec un nettoyant pour lentilles et du papier pour lentilles de bonne qualité.Avant l’assemblage du module, assurez-vous que le joint torique est correctement installé dans la rainure du couvercle de la cellule d’écoulement. Placez ensuite le couvercle de la cellule d’écoulement sur le module laser, en vous assurant que les contacts électriques sont dans la bonne orientation. Ensuite, placez les quatre vis à pouce à ressort à travers la plaque de cellule d’écoulement et engagez les filetages du module laser sans serrer individuellement.Tout en exerçant une pression uniforme sur le couvercle de la cellule d’écoulement, serrez uniformément les vis du pouce de manière diagonale alternée jusqu’à ce qu’elles soient bien ajustées. Rincez trois fois deux seringues à tuberculine d’un millilitre avec des adaptateurs à verrouillage glissant avec un millilitre de DPBS. Retirez et jetez le piston de la première seringue de tuberculine avant d’insérer la seringue dans l’orifice restant pour servir de diluant ou de réservoir d’échantillon vide.Remplissez ensuite la deuxième seringue avec un millilitre de DPBS et fixez-la à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement. Maintenez le module laser incliné avec l’orifice de la seringue de sortie surélevé pour permettre à l’air d’être purgé de la chambre pendant que le DPBS est injecté lentement dans le module laser. Rincez le DPBS restant du module laser en injectant un millilitre d’air dans l’orifice d’entrée.Répétez le rinçage deux fois. Après le dernier rinçage, videz le module laser aussi complètement que possible et chargez le module pour la mise au point et le positionnement. Ouvrez le logiciel.Sous l’onglet capture dans le coin supérieur gauche, cliquez sur Démarrer l’appareil photo. Si l’appareil photo s’éteint automatiquement après cinq minutes, cliquez sur Démarrer l’appareil photo pour le redémarrer. Dans le même onglet, ajustez le niveau de la caméra à 14 à 16 pour éclaircir la ligne laser et simplifier l’identification et la mise au point des particules.En déplaçant le curseur supérieur sur le côté gauche de la tête à l’intérieur ou à l’extérieur, détournez l’image de la caméra vers les oculaires. Dans le champ de vision, recherchez la zone de densité accrue, appelée empreinte du pouce et centre, et concentrez l’empreinte du pouce verticalement. Dans le champ de vision, centrez la ligne laser, puis déplacez le curseur supérieur pour détourner la lumière vers la caméra comme observé sur l’écran de l’ordinateur.L’image sur l’écran de l’ordinateur est une image miroir de la vue dans les oculaires du microscope. Ajustez la mise au point pour affiner l’image des particules en mouvement individuelles sur l’écran avec le bouton de mise au point. Pour charger les échantillons, prélever un millilitre de l’échantillon dans une seringue à tuberculine rincée d’un millilitre et fixer la seringue à l’orifice d’entrée du couvercle de la cellule d’écoulement.Continuez à avancer le piston jusqu’à ce que le liquide soit évident dans la seringue ouverte fixée à l’orifice de sortie. Le module doit être incliné pour permettre à l’air d’être purgé du module laser. Dans la vue de la caméra, déplacez la mise au point vers la droite de la ligne laser vers une zone d’un nombre uniforme de particules.Ajustez l’orientation verticale pour centrer les bandes horizontales de lumière et recentrez-vous jusqu’à ce que le plus grand nombre de particules soit visible. S’assurer que la position de l’objectif est cohérente pour toutes les mesures ultérieures. Ajustez le niveau de l’appareil photo au point où le symbole d’information sombre clignote par intermittence en haut à droite de la vue de l’appareil photo.Pour l’analyse de suivi des nanoparticules, ou NTA, réglez la durée sur 30 ou 60 secondes et le nombre de vidéos sur cinq. Pour modifier le nom de fichier de base existant, cliquez sur l’onglet d’un nouveau site de stockage pour les données générées avec un nouveau nom de fichier. Cochez ensuite la case température cible pour saisir la température souhaitée et cliquez sur créer un script pour réutiliser la mesure standard.Une fois l’exemple chargé et l’expérience prête à s’exécuter, cliquez sur Créer et exécuter un script. Dans l’écran contextuel Définir les détails du rapport, remplissez les champs avec les informations nécessaires sur l’opérateur, l’échantillon et le diluant. Lorsque tous les champs souhaités ont été remplis, cliquez sur Paramètres OK pour lancer le script.Avant chaque capture vidéo, recherchez une invite pour faire avancer le piston manuellement. Injecter environ 0,05 millilitre de l’échantillon dans la chambre laser. Lorsque les particules s’immobilisent, cliquez sur OK. Une fois la cinquième capture vidéo terminée, une boîte de confirmation des paramètres apparaîtra avec la boîte de processus.Comme les images sont avancées manuellement à partir du bas de l’écran vidéo, notez le nombre de croix bleues produisant des particules à l’écran et définissez le seuil de détection pour le traitement de l’échantillon. Attendez que les vidéos soient automatiquement traitées dans un histogramme de résultats avant qu’une notification d’achèvement de la boîte de dialogue ne s’affiche, puis appuyez sur OK. Une fois que la zone paramètres d’exportation s’affiche, enregistrez les résultats en cliquant sur Exporter. Mettez en surbrillance les cinq vidéos de capture répertoriées dans l’expérience en cours.Ensuite, cliquez sur traiter les fichiers sélectionnés et attendez que la zone de confirmation des paramètres apparaisse dans la zone de processus pour flasher pour modifier le seuil de détection, puis ajustez le seuil de détection au niveau souhaité et accédez au paramètre et cliquez sur OK. Les vidéos seront traitées automatiquement dans un histogramme des résultats et une boîte de dialogue de notification d’achèvement sera affichée. Cliquez OK.In l’analyse représentative, les résultats de l’analyse de nanotracking, ou NTA, pour les échantillons de liposomes et un diluant DPBS représentatif sont affichés. Les échantillons filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 108 nanomètres et une concentration de 7,4 fois 10 à la huitième particule par millilitre.En revanche, les échantillons non filtrés avaient un diamètre moyen de particules de 159 nanomètres et une concentration de 7,6 fois 10 à la huitième particule par millilitre. Au niveau combiné des caméras, lorsque le seuil de détection a été porté de deux à cinq, la taille moyenne et la taille des particules de mode ont montré une diminution significative de la taille des particules des échantillons filtrés. Les concentrations de particules aux niveaux combinés des caméras ont diminué à mesure que le seuil de détection était augmenté.Aucune différence significative dans les concentrations de particules entre les échantillons filtrés et non filtrés n’a été détectée. Aux seuils de détection combinés, à mesure que le niveau de la caméra passait de 12 à 14, une diminution de la taille moyenne et du mode des particules filtrées a été observée. Les concentrations de particules aux seuils de détection combinés ont augmenté à mesure que les niveaux de caméra passaient de 12 à 14.Aucune différence significative entre les échantillons filtrés et non filtrés n’a été observée. Les étapes 4.1 à 5.2 sont importantes pour trouver la bonne zone de visualisation. L’obtention de résultats cohérents sur plusieurs essais dépend de cette compétence reproductible.La diffusion dynamique de la lumière est souvent utilisée comme compagnon de l’analyse de suivi des nanoparticules principalement pour obtenir le potentiel zêta, qui est la charge de surface des particules. Pour l’analyse des nanoparticules, la NTA continue d’être une méthode très précieuse de quantification des particules utile pour la recherche sur les vésicules extracellulaires.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Conception d&#39;un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Recherche

Bio-ingénierie

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Évaluation de livraison Gene polymère nanoparticules d&#39;analyse de suivi par des nanoparticules et de cytométrie en flux à haut débit

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel tridimensionnelle chambre d&#39;écoulement périphérique pour étudier chimiokine dirigée extravasation des cellules circulantes des conditions d&#39;écoulement physiologiques

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Mesure longitudinale de la matrice extracellulaire rigidité de tumeur modèles 3D utilisant Microrhéologie de particules de suivi

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Quantification et Taille-profilage des vésicules extracellulaires Utilisation accordable résistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Dispositifs à base de papier pour l&#39;isolement et la caractérisation de vésicules extracellulaire

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Injection de nanoparticules de Retroductal à la glande submandibulaire Murine

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Évaluation de la stabilité du stockage des vésicules extracellulaires

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In Vivo Deux-Couleur 2-Photon Imagerie des cellules de reporter génétiquement marqués dans la peau

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...