Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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Die Arbeit wurde vom Bundesstaat Kansas zum Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), vom Johnson Cancer Research Center zum MLW und vom NIH R21AG066488 zum LKC unterstützt. OLS erhielt GRA-Unterstützung vom MICSCB. Die Autoren danken Dr. Santosh Aryal für die Bereitstellung der in diesem Projekt verwendeten Liposomen und den Mitgliedern der Weiss- und Christenson-Labors für hilfreiche Gespräche und Feedback. Dr. Hong He wird für die technische Unterstützung gedankt. MLW dankt Betti Goren Weiss für ihre Unterstützung und ihren Rat.

1. Allgemeine Protokollrichtlinien
<ol><li>Halten Sie das Mikroskop auf einem Lufttisch oder mindestens auf einem vibrationsfreien Tisch. Stellen Sie sicher, dass Fremdvibrationen (z. B. Fußklopfen auf den Boden, Berühren des Tisches, Türschließungen, Laborverkehr) auf ein Minimum reduziert werden.</li>
	<li>Stellen und halten Sie die Temperatur des Lasermoduls für alle Videoaufnahmen auf einer konstanten Temperatur. HINWEIS: Die gewählte Temperatur betrug 25 °C, da der Nanopartikelgrößenan...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Es gibt mehrere Methoden, um die Größe und Konzentration von Nanopartikelnabzuschätzen 11. Dazu gehören Ensemble-Methoden, die eine Größenschätzung aus einer Population generieren, einschließlich dynamischer Lichtstreuung (DLS), zentrifugaler Sedimentation und Einzelpartikel-Level-Analyse - Elektronenmikroskopie, NTA, Rasterkraftmikroskopie und abstimmbarer resistiver Pulsmessung. Von diesen sind DLS und NTA weit verbreitete, zerstörungsfreie Größen- und Konzentrationsmessmethoden, die ...

Die genaue und wiederholbare Analyse von Elektrofahrzeugen und anderen nanometerskaligen Partikeln stellt Forschung und Industrie vor zahlreiche Herausforderungen. Die Replikation der EV-Forschung war schwierig, zum Teil aufgrund der mangelnden Einheitlichkeit bei der Berichterstattung über die notwendigen Parameter im Zusammenhang mit der Datenerhebung. Um diese Mängel zu beheben, schlug das ISEV Industrierichtlinien als minimale Reihe von biochemischen, biophysikalischen und funktionellen Standards für EV-Forscher vor und veröffentlichte sie als Positionspapier, das allgemein als MISEV20141 bezeichnet wird. Das beschleunigte Tempo der EV-Forschung erforderte eine aktualisierte Richtlinie, und die "MISEV2018: eine Stellungnahme des ISEV" erweiterte die MISEV2014-Richtlinien2. Das MISEV2018-Papier enthielt Tabellen, Umrisse der vorgeschlagenen Protokolle und Schritte, die zu befolgen sind, um die spezifische EV-assoziierte Charakterisierung zu dokumentieren. Als weitere Maßnahme zur Erleichterung der Interpretation und Replikation von Experimenten wurde EV-TRACK als Crowdsourcing-Wissensdatenbank (http://evtrack.org) entwickelt, um eine transparentere Berichterstattung über die EV-Biologie und die für die veröffentlichten Ergebnisse verwendete Methodikzu ermöglichen 3. Trotz dieser Empfehlungen für eine standardisierte Berichterstattung über Methoden leidet das Feld weiterhin unter der Replikation und Bestätigung der veröffentlichten Ergebnisse.
Passend zu den Bemühungen der National Institutes of Health und der National Science Foundation um Qualitätsbewertungsinstrumente schlägt dieses Papier vor, dass ISEV eine standardisierte Berichterstattung über Methoden und Details erfordert, damit Datenbewertungsinstrumente mit dem Ziel angewendet werden können, Ergebnisse zwischen Labors zu replizieren. Die Meldung von Zellquellen, Zellkulturverfahren und EV-Isolationsmethoden sind wichtige Faktoren, um die Qualitäten der EV-Population zu definieren. Unter den NTA-Instrumenten erschweren Faktoren wie Detektionseinstellungen, der Brechungsindex von Trägerflüssigkeit, heterogene Partikelpopulationen, die zur Polydispersität beitragen, das Fehlen standardisierter Berichtspflichten und fehlende Intra- und Inter-Beobachter-Messergebnisse den NTA-Vergleich zwischen Labors.
NTA wird seit 2006 verwendet und ist eine beliebte Methode zur Bestimmung der Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die derzeit von etwa 80% der EV-Forscherverwendet wird 4. Die MISEV2018-Richtlinien erfordern zwei Formen der Einzelvesikelanalyse, von denen NTA eine der beliebtesten Optionen ist. NTA wird aufgrund seiner breiten Zugänglichkeit, der niedrigen Kosten pro Probe und seiner einfachen Gründungstheorie (der Stokes-Einstein-Gleichung) weiterhin häufig für die EV-Charakterisierung verwendet. Die EV-Bewertung durch NTA generiert eine Partikelgrößenverteilung und -konzentrationsschätzung unter Verwendung von Laserlichtstreuung und Brownscher Bewegungsanalyse, wobei die untere Nachweisgrenze durch den Brechungsindex des EV bestimmt wird. Bei Verwendung einer Flüssigkeitsprobe mit bekannter Viskosität und Temperatur werden die Flugbahnen der EVs verfolgt, um ihre mittlere quadratische Verschiebung in zwei Dimensionen zu bestimmen. Dadurch kann der Partikeldiffusionskoeffizient berechnet und durch eine modifizierte Stokes-Einstein-Gleichung 5,6,7 in einen kugeläquivalenten hydrodynamischen Durchmesser umgewandelt werden. Die Partikel-zu-Partikel-Analyse von NTA hat weniger Interferenzen durch Agglomerate oder größere Partikel in einer heterogenen Population von EVs als andere Charakterisierungsmethoden7. Während einige größere Partikel nur minimale Auswirkungen auf die Größengenauigkeit haben, führt das Vorhandensein selbst winziger Mengen großer, lichtstreuender Partikel zu einer deutlichen Verringerung der Erkennung kleinerer Partikel aufgrund der reduzierten Software-EV-Erkennung und -Verfolgung8. Als Messtechnik wird allgemein angenommen, dass NTA nicht auf größere Partikel oder Aggregate von Partikeln ausgerichtet ist, sondern mehrere Populationen durch individuelle Partikelanalyse auflösenkann 9. Aufgrund der Verwendung der Lichtstreuung durch Partikel besteht eine der Einschränkungen der NTA-Analyse darin, dass Partikel wie Staub, Kunststoff oder Pulver mit ähnlichen Brechungs- und Größeneigenschaften im Vergleich zu Elektrofahrzeugen durch diese Charakterisierungsmethode nicht von tatsächlichen Elektrofahrzeugen unterschieden werden können.
Der NanoSight LM10 (Nanopartikelgrößenanalysator) und der LM14 (Lasermodul) werden seit 2006 verkauft, und obwohl neuere Modelle dieses Instruments entwickelt wurden, ist dieses spezielle Modell in vielen Kerneinrichtungen zu finden und gilt als zuverlässiges Arbeitstier. Es ist eine Schulung erforderlich, um die NTA-Einstellungen für hochauflösende Größen- und Konzentrationsmessungen richtig zu optimieren. Die beiden wichtigsten Einstellungen, die für optimale Videoaufnahmen benötigt werden, sind (1) die Kameraebene und (2) die Erkennungsschwelle. Diese müssen vom Bediener auf der Grundlage der Eigenschaften der Probe eingestellt werden. Eine der Haupteinschränkungen der NTA-Analyse ist die Empfehlung von Probenkonzentrationen zwischen 10 7 und 109 Partikeln / ml, um diese Probenverdünnung zu erreichen,kann eine 10 erforderlich sein. Lösungen, die zur Verdünnung verwendet werden, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 0,15 M Kochsalzlösung oder Reinstwasser, sind selten frei von Partikeln mit einer Größe von weniger als 220 μm, was die NTA-Messungen beeinflussen kann. Die NTA-Charakterisierung der für die Verdünnung verwendeten Lösungen sollte auf derselben Kameraebene und Nachweisschwelle wie die analysierten Nanopartikelproben durchgeführt werden. Die Größe und Konzentration von Nanopartikeln, die in Verdünnungsmitteln enthalten sind, die für EV-Probenverdünnungen verwendet werden, werden selten in Publikationen zur NTA-Analyse von EVs erwähnt.
Dieses Protokoll verwendet die NTA-Analyse synthetischer EV-ähnlicher Liposomen, die unter Verwendung ausgewählter Kamerapegel, Erkennungsschwellen und mechanischer Filterung der Proben ausgewertet werden, um die systematischen Auswirkungen von Kamerapegel, Erkennungsschwelle oder Probenfiltration auf den NTA-Datensatz zu analysieren. Liposomen wurden wie in Supplemental File S1 beschrieben synthetisiert. Synthetische Liposomen wurden in diesem Experiment aufgrund ihrer Größengleichmäßigkeit, physikalischen Eigenschaften und Stabilität bei der Lagerung bei 4 ° C verwendet. Obwohl tatsächliche Stichproben von Elektrofahrzeugen hätten verwendet werden können, könnte die Heterogenität und Stabilität von Elektrofahrzeugen während der Speicherung diese Studie und ihre Interpretation erschwert haben. Ähnlichkeiten in den NTA-Berichten von (A) Liposomen und (B) EVs deuten darauf hin, dass die systematischen Effekte, die in diesem Artikel für Liposomen aufgedeckt wurden, wahrscheinlich auch für die EV-Charakterisierung gelten werden (Abbildung 1). Zusammengenommen unterstützen diese Ergebnisse die Vorstellung, dass die vollständige Berichterstattung über kritische Softwareeinstellungen und die Beschreibung der Probenverarbeitung wie Verdünnungsmittel, Verdünnung und Filtration die Reproduzierbarkeit von NTA-Daten beeinflussen.
Der Zweck dieses Papiers ist es, zu zeigen, dass die Variation der NTA-Einstellungen (Temperatur, Kameraniveau und Erkennungsschwelle) und der Probenvorbereitung die gesammelten Ergebnisse verändert: Es wurden systematische, signifikante Unterschiede in Größe und Konzentration erzielt. Da NTA eine der beliebtesten Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Charakterisierungsspezifikation ist, zeigen diese Ergebnisse, wie wichtig es ist, die Probenvorbereitung und die NTA-Einstellungen zu melden, um die Reproduzierbarkeit sicherzustellen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative NTA-Berichte zum Vergleich von Liposomen mit EVs. (A) Liposomen: ungefilterte Probe, die am 12. März 2020 auf NTA charakterisiert wurde. (B) EVs: ungefilterte Probe, die am 26. August 2021 auf NTA charakterisiert wurde. Abkürzungen: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EVs = extrazelluläre Vesikel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist seit 2006 eine von mehreren Charakterisierungsmethoden, die für die extrazelluläre Vesikelforschung (EV) eingesetzt werden. Viele sind der Meinung, dass NTA-Instrumente und ihre Softwarepakete nach minimaler Schulung leicht verwendet werden können und dass die Größenkalibrierung intern möglich ist. Da sowohl die NTA-Akquisition als auch die Softwareanalyse eine EV-Charakterisierung darstellen, werden sie in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018) behandelt. Darüber hinaus wurden sie durch Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) überwacht, um die Robustheit von EV-Experimenten zu verbessern (z. B. Minimierung der experimentellen Variation aufgrund unkontrollierter Faktoren).
Trotz der Bemühungen, die Berichterstattung über Methoden und Kontrollen zu fördern, berichten viele veröffentlichte Forschungsarbeiten nicht über kritische Einstellungen, die zur Reproduktion der ursprünglichen NTA-Beobachtungen erforderlich sind. Nur wenige Artikel berichten über die NTA-Charakterisierung von Negativkontrollen oder Verdünnungsmitteln, wobei offensichtlich davon ausgegangen wird, dass kommerziell erhältliche Produkte, wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder ultrareines destilliertes Wasser, frei von Partikeln sind. In ähnlicher Weise werden Positivkontrollen oder Größenstandards selten von Forschern berichtet, um die Partikelgröße zu überprüfen. Die Stokes-Einstein-Gleichung enthält Probenviskositäts- und Temperaturvariablen, um die Partikelverschiebung zu bestimmen. Die Meldung der stabilen Laserkammertemperatur während der gesamten Probenvideoentnahme ist daher eine wesentliche Kontrollmaßnahme für eine genaue Replikation. Die Filtration von Proben oder Verdünnungsmitteln wird ebenfalls nicht routinemäßig gemeldet, und wenn ja, werden die Besonderheiten des Filters (Hersteller, Membranmaterial, Porengröße) und Lagerbedingungen selten berücksichtigt. Die Mindeststandards der International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) für akzeptable experimentelle Details sollten ein gut dokumentiertes NTA-Protokoll für die Charakterisierung von EVs enthalten. Das folgende Experiment liefert den Nachweis, dass ein NTA-Analyseprotokoll vom einzelnen Forscher erstellt und in die Methoden von Publikationen einbezogen werden muss, die die NTA-Charakterisierung als eine der Optionen zur Erfüllung der MISEV2018-Anforderungen für die Charakterisierung einzelner Vesikel verwenden.

Tabelle 1 enthält die Ergebnisse der NTA-Videos für die Liposomenproben (18 gefiltert und 18 ungefiltert) und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel. Vergleiche zwischen den beiden Gruppen wurden unabhängig von der Kamerastufe oder dem Erkennungsschwellenwert in diesem Dokument durchgeführt. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108,5 nm, einen Partikelmodus von 86,2 nm und eine Konzentration von 7,4 × 108 Partikeln /ml. Im Gegensatz dazu hatten ungefilter...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Die Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) ist eine weit verbreitete Methode zur Charakterisierung extrazellulärer Vesikel. Dieses Papier hebt NTA-experimentelle Parameter und Kontrollen sowie eine einheitliche Methode zur Analyse und Charakterisierung von Proben und Verdünnungsmitteln hervor, die notwendig ist, um die von MISEV2018 und EV-TRACK vorgeschlagenen Richtlinien für die Reproduzierbarkeit zwischen Laboratorien zu ergänzen.

Verbesserung der Reproduzierbarkeit, um minimale Informationen für Studien zu extrazellulären Vesikeln zu erfüllen Richtlinien 2018 in der Nanopartikel-Tracking-Analyse

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Dieses Protokoll wurde für Anfänger des NanoSight LM10 entwickelt. Durch das Befolgen der Schritt-für-Schritt-Anweisungen können genaue und reproduzierbare Ergebnisse erzielt werden. Diese Technik trägt dazu bei, konsistente Ergebnisse über mehrere Testläufe hinweg sicherzustellen, unabhängig von den Fähigkeiten des Benutzers.Die Charakterisierung von Nanopartikeln, insbesondere die Quantifizierung, ist nach wie vor eine Herausforderung im Bereich der extrazellulären Vesikelforschung. Dieses Protokoll ermöglicht eine konsistente Größen- und Konzentrationsanalyse von Nanopartikeln in Suspension. Beginnen Sie mit der Reinigung der Glasoberflächen des Lasermoduls mit einem hochwertigen Linsenreiniger und Linsenpapier.Stellen Sie vor der Montage des Moduls sicher, dass die O-Ring-Dichtung ordnungsgemäß in der Nut der Durchflusszellenabdeckung sitzt. Platzieren Sie dann die Durchflusszellenabdeckung auf dem Lasermodul und stellen Sie sicher, dass sich die elektrischen Kontakte in der richtigen Ausrichtung befinden. Als nächstes platzieren Sie die vier federbelasteten Rändelschrauben durch die Durchflusszellenplatte und greifen die Gewinde des Lasermoduls ein, ohne sie einzeln festzuziehen.Während Sie den gleichmäßigen Druck auf die Durchflusszellenabdeckung ausüben, ziehen Sie die Rändelschrauben abwechselnd diagonal gleichmäßig an, bis sie fest sitzen. Spülen Sie zwei Ein-Milliliter-Tuberkulinspritzen mit Slip-Lock-Adaptern dreimal mit einem Milliliter DPBS. Entfernen und entsorgen Sie den Kolben aus der ersten Tuberkulinspritze, bevor Sie die Spritze in den verbleibenden Anschluss einführen, um als leeres Verdünnungsmittel oder Probenreservoir zu dienen.Füllen Sie dann die zweite Spritze mit einem Milliliter DPBS und befestigen Sie sie am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung. Halten Sie das Lasermodul geneigt, wobei der Auslassspritzenanschluss erhöht ist, damit Luft aus der Kammer gespült werden kann, während das DPBS langsam in das Lasermodul injiziert wird. Spülen Sie die verbleibenden DPBS aus dem Lasermodul, indem Sie einen Milliliter Luft in den Einlassanschluss injizieren.Wiederholen Sie das Spülen zweimal. Entleeren Sie nach dem letzten Spülen das Lasermodul so vollständig wie möglich und laden Sie das Modul zum Fokussieren und Positionieren. Öffnen Sie die Software.Klicken Sie auf der Registerkarte Aufnahme in der oberen linken Ecke auf Kamera starten. Wenn sich die Kamera nach fünf Minuten automatisch ausschaltet, klicken Sie auf Kamera starten, um sie neu zu starten. Stellen Sie auf derselben Registerkarte die Kameraebene auf 14 bis 16 ein, um die Laserlinie aufzuhellen und die Partikelidentifizierung und -fokussierung zu vereinfachen.Indem Sie den oberen Schieberegler auf der linken Seite des Kopfstücks nach innen oder außen bewegen, leiten Sie das Bild von der Kamera zu den Okularen um. Suchen Sie im Sichtfeld den Bereich mit erhöhter Dichte, der als Fingerabdruck und Mitte bezeichnet wird, und fokussieren Sie den Fingerabdruck vertikal. Zentrieren Sie im Sichtfeld die Laserlinie und bewegen Sie dann den oberen Schieberegler, um das Licht auf die Kamera umzuleiten, wie auf dem Computerbildschirm beobachtet.Das Bild auf dem Computerbildschirm ist ein Spiegelbild aus der Ansicht in den Mikroskopokularen. Passen Sie den Fokus an, um das Bild einzelner sich bewegender Partikel auf dem Bildschirm mit dem Fokusknopf zu schärfen. Um die Proben zu laden, ziehen Sie einen Milliliter der Probe in eine gespülte Ein-Milliliter-Tuberkulinspritze und befestigen Sie die Spritze am Einlassanschluss der Durchflusszellenabdeckung.Bewegen Sie den Kolben weiter, bis Flüssigkeit in der offenen Spritze sichtbar ist, die am Auslassanschluss befestigt ist. Das Modul sollte geneigt sein, damit Luft aus dem Lasermodul gespült werden kann. Verschieben Sie in der Kameraansicht den Fokus rechts von der Laserlinie auf einen Bereich mit einer gleichmäßigen Anzahl von Partikeln.Passen Sie die vertikale Ausrichtung an, um die horizontalen Lichtbänder zu zentrieren, und fokussieren Sie neu, bis die höchste Anzahl von Partikeln sichtbar ist. Stellen Sie sicher, dass die Position des Fokus für alle nachfolgenden Maßnahmen konsistent bleibt. Stellen Sie die Kameraebene so ein, dass das Symbol für dunkle Informationen in der oberen rechten Ecke der Kameraansicht zeitweise ein- und ausgeschaltet wird.Für die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) legen Sie die Dauer auf 30 oder 60 Sekunden und die Anzahl der Videos auf fünf fest. Um den vorhandenen Basisdateinamen zu ändern, klicken Sie auf die Registerkarte für einen neuen Speicherort für generierte Daten mit einem neuen Dateinamen. Aktivieren Sie dann das Kontrollkästchen für die Zieltemperatur, um die gewünschte Temperatur einzugeben, und klicken Sie auf Skript erstellen, um die Standardmessung wiederzuverwenden.Sobald das Beispiel geladen ist und das Experiment zum Ausführen bereit ist, klicken Sie auf Erstellen und Skript ausführen. Füllen Sie im Popup-Fenster "Berichtsdetails festlegen" die Felder mit den erforderlichen Informationen zum Bediener, zur Probe und zum Verdünnungsmittel aus. Wenn alle gewünschten Felder ausgefüllt wurden, klicken Sie auf Einstellungen OK, um das Skript zu starten.Suchen Sie vor jeder Videoaufnahme nach einer Eingabeaufforderung, um den Kolben manuell zu bewegen. Injizieren Sie etwa 0,05 Milliliter der Probe in die Laserkammer. Wenn die Partikel zur Ruhe kommen, klicken Sie auf OK. Nach Abschluss der fünften Videoaufnahme wird neben dem Prozessfeld ein Einstellungsbestätigungsfeld angezeigt.Wenn die Frames manuell vom unteren Rand des Videobildschirms aus verschoben werden, notieren Sie sich die Anzahl der blauen Kreuze, die Partikel auf dem Bildschirm bilden, und legen Sie den Erkennungsschwellenwert für die Verarbeitung der Probe fest. Warten Sie, bis die Videos automatisch in einem Histogramm der Ergebnisse verarbeitet werden, bevor eine Dialogfeldbenachrichtigung über den Abschluss angezeigt wird, und klicken Sie dann auf OK. Nachdem das Feld Exporteinstellungen angezeigt wird, speichern Sie die Ergebnisse, indem Sie auf Exportieren klicken. Markieren Sie alle fünf Aufnahmevideos, die im aktuellen Experiment aufgeführt sind.Klicken Sie anschließend auf Ausgewählte Dateien verarbeiten und warten Sie, bis das Einstellungsbestätigungsfeld im Prozessfeld angezeigt wird, um den Erkennungsschwellenwert zu ändern, passen Sie dann den Erkennungsschwellenwert auf die gewünschte Stufe an, gehen Sie zur Einstellung und klicken Sie auf OK. Die Videos werden automatisch in einem Histogramm der Ergebnisse verarbeitet und eine Dialogfeldbenachrichtigung über die Fertigstellung wird angezeigt. Klicken Sie OK.In die repräsentative Analyse, die Ergebnisse der Nanotracking-Analyse, kurz NTA, für die Liposomenproben und ein repräsentatives DPBS-Verdünnungsmittel angezeigt werden. Gefilterte Proben hatten einen mittleren Partikeldurchmesser von 108 Nanometern und eine Konzentration von 7,4 mal 10 bis achte Partikel pro Milliliter.Im Gegensatz dazu hatten ungefilterte Proben einen mittleren Partikeldurchmesser von 159 Nanometern und eine Konzentration von 7,6 mal 10 bis zum achten Partikel pro Milliliter. Auf kombinierten Kameraebenen, als die Erkennungsschwelle von zwei auf fünf erhöht wurde, zeigte die mittlere und modische Partikelgröße eine signifikante Abnahme der Partikelgrößen der gefilterten Proben. Die Partikelkonzentrationen auf kombinierten Kameraebenen wurden verringert, da die Nachweisschwelle erhöht wurde.Es wurde kein signifikanter Unterschied in den Partikelkonzentrationen zwischen gefilterten und ungefilterten Proben festgestellt. Bei kombinierten Erkennungsschwellen, als der Kamerapegel von 12 auf 14 anstieg, wurde eine Abnahme der mittleren und modischen Partikelgröße der gefilterten Proben festgestellt. Die Partikelkonzentrationen bei kombinierten Detektionsschwellen stiegen an, als die Kamerawerte von 12 auf 14 stiegen.Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen gefilterten und ungefilterten Proben beobachtet. Die Schritte 4.1 bis 5.2 sind wichtig, um den richtigen Betrachtungsbereich zu finden. Das Erreichen konsistenter Ergebnisse über mehrere Testläufe hängt von dieser wiederholbaren Fähigkeit ab.Die dynamische Lichtstreuung wird oft als Begleiter der Nanopartikel-Tracking-Analyse verwendet, um in erster Linie das Zetapotential zu erhalten, das die Oberflächenladung der Partikel ist. Für die Nanopartikelanalyse ist NTA nach wie vor eine sehr wertvolle Methode zur Quantifizierung von Partikeln, die für die extrazelluläre Vesikelforschung nützlich sind.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Forschung

Biotechnik

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Dreidimensionale-Flow-Kammer-Geräte zu Chemokine gerichtet Extravasation von zirkulierenden Zellen unter physiologischen Bedingungen zu studieren Durchfluss

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Längs Messung der extrazellulären Matrix Steifigkeit in 3D Tumormodelle mit Particle-Tracking Mikrorheologie

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Quantifizierung und Größe-Profilierung der extrazellulären Vesikeln Mit Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Auf Papier basierende Vorrichtungen zur Isolierung und Charakterisierung von extrazellulärer Vesikel

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Bewertung der Speicherstabilität von extrakellulären Bläschen

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...