Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

העבודה נתמכה על ידי מדינת קנזס למכון המערב התיכון לביולוגיה השוואתית של תאי גזע (MICSCB), המרכז לחקר הסרטן של ג'ונסון ל- MLW ו- NIH R21AG066488 ל- LKC. OLS קיבל תמיכה GRA מן MICSCB. המחברים מודים לד"ר סנטוש אראל על מתן הליפוזומים המשמשים בפרויקט זה ולחברי מעבדות וייס וכריסטנסון על שיחות ומשוב מועילים. ד"ר הונג הוא מודה על התמיכה הטכנית. MLW מודה לבטי גורן וייס על תמיכתה ויועצתה.

1. הנחיות כלליות לפרוטוקול
<ol><li>שמור על המיקרוסקופ על שולחן אוויר או לכל הפחות על שולחן ללא רטט. ודא כי תנודות חיצוניות (למשל, הקשה ברגל על הרצפה, נגיעה בשולחן, סגירת דלתות, תנועת מעבדה) נשמרות למינימום.</li>
	<li>הגדר ושמור על הטמפרטורה של מודול הלייזר בטמפרטורה קבועה עבור כל הקלטות הו?...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

ישנן מספר שיטות זמינות כדי להעריך את הגודל והריכוז של חלקיקים11. אלה כוללים שיטות אנסמבל המייצרות הערכת גודל מאוכלוסייה, כולל פיזור אור דינמי (DLS), משקעים צנטריפוגליים, ומיקרוסקופיה של רמת חלקיק יחיד-אלקטרון, NTA, מיקרוסקופיה של כוח אטומי וחישת דופק התנגדותית טונה. מתוכם, DLS ו- NTA נ...

ניתוח מדויק וחוזר על עצמו של רכבים חשמליים וחלקיקים אחרים בקנה מידה של ננומטר מציב אתגרים רבים במחקר ובתעשייה. שכפול של מחקר EV היה קשה, בין היתר, בשל חוסר אחידות בדיווח על הפרמטרים הדרושים הקשורים לאיסוף נתונים. כדי לטפל בליקויים אלה, ISEV הציע הנחיות תעשייה כמערכת מינימלית של סטנדרטים ביוכימיים, ביופיזיים ותפקודיים לחוקרי EV ופרסם אותם כהצהרת עמדה, המכונה בדרך כלל MISEV20141. הקצב המואץ של מחקר EV דרש הנחיה מעודכנת, ואת "MISEV2018: הצהרת עמדה של ISEV" הרחיב את הנחיות MISEV20142. נייר MISEV2018 כלל טבלאות, קווי מתאר של פרוטוקולים מוצעים וצעדים שיש לבצע כדי לתעד אפיון ספציפי הקשור לרכב חשמלי. כאמצעי נוסף להקלה על פרשנות ושכפול של ניסויים, EV-TRACK פותחה כבסיס ידע מיקור המונים (http://evtrack.org) כדי לאפשר דיווח שקוף יותר של ביולוגיה של EV והמתודולוגיה המשמשת לתוצאותשפורסמו 3. למרות המלצות אלה לדיווח סטנדרטי של שיטות, התחום ממשיך לסבול משכפול ואישור תוצאות שפורסמו.
בהתאם למאמץ של המכונים הלאומיים לבריאות והקרן הלאומית למדע עבור כלי הערכת איכות, מאמר זה מציע כי ISEV דורש דיווח סטנדרטי של שיטות ופרטים, כך שכלי הערכת נתונים עשויים להיות מיושמים במטרה לשכפל תוצאות בין מעבדות. דיווח על מקורות תאים, נהלי תרבית תאים ושיטות בידוד EV הם גורמים חשובים להגדרת התכונות של אוכלוסיית הרכב החשמלי. בין מכשירי NTA, גורמים כגון הגדרות זיהוי, מדד השבירה של נוזל נשא, אוכלוסיות חלקיקים הטרוגניות התורמות לפולידיספרסיביות, היעדר דרישות דיווח סטנדרטיות ותוצאות מדידה פנים-צופיות נעדרות הופכות את השוואת NTA בין מעבדות לקשה או בלתי אפשרית.
בשימוש מאז 2006, NTA היא שיטה פופולרית עבור גודל חלקיקים וקביעת ריכוז המשמש כיום על ידי כ 80% של חוקרי EV4. הנחיות MISEV2018 דורשות שתי צורות של ניתוח שלפוחית אחת, אשר NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות. נת"ע ממשיכה להיות בשימוש נפוץ לאפיון EV בשל הנגישות הרחבה שלה, עלות נמוכה לדגימה, ותורת המייסדים הפשוטה שלה (משוואת סטוקס-איינשטיין). הערכת EV על ידי NTA מייצרת התפלגות גודל חלקיקים והערכת ריכוז באמצעות פיזור אור לייזר וניתוח תנועה בראונית, כאשר הגבול התחתון של הזיהוי נקבע על ידי מדד השבירה של הרכב החשמלי. בעת שימוש בדגימת נוזלים של צמיגות וטמפרטורה ידועות, המסלולים של הרכבים החשמליים נמצאים במעקב כדי לקבוע את תזוזתם הממוצעת בריבוע בשני ממדים. זה מאפשר את מקדם פיזור החלקיקים להיות מחושב ומומר לקוטר הידרודינמי שווה ערך לכדור על ידי משוואת סטוקס-איינשטיין שונה 5,6,7. ניתוח חלקיקים לחלקיקים של NTA יש פחות הפרעות על ידי agglomerates או חלקיקים גדולים יותר באוכלוסייה הטרוגנית של רכבים חשמליים מאשר שיטות אחרות של אפיון7. בעוד כמה חלקיקים גדולים יותר יש השפעה מינימלית על דיוק גודל, נוכחות של כמויות דקות אפילו של חלקיקים גדולים, פיזור אור גבוה גורם לירידה ניכרת בזיהוי של חלקיקים קטנים יותר עקב זיהוי EV תוכנה מופחתת ומעקב8. כטכניקת מדידה, NTA נחשב בדרך כלל לא מוטה כלפי חלקיקים גדולים יותר או אגרגטים של חלקיקים, אבל יכול לפתור אוכלוסיות מרובות גודל באמצעות ניתוח חלקיקים בודדים9. בגלל השימוש בפיזור אור על ידי חלקיקים, אחת המגבלות של ניתוח NTA היא שכל חלקיק כגון אבק, פלסטיק, או אבקה עם תכונות שבירה וגודל דומות בהשוואה לרכבים חשמליים לא ניתן להבדיל מרכבים חשמליים בפועל בשיטה זו של אפיון.
NanoSight LM10 (מנתח גודל ננו-חלקיקים) ו- LM14 (מודול לייזר) נמכרו מאז 2006, ולמרות שדגמים חדשים יותר של מכשיר זה פותחו, דגם מסוים זה נמצא במתקני ליבה רבים ונחשב לסוס עבודה אמין. יש צורך בהכשרה כדי לייעל כראוי את הגדרות ה- NTA למדידות ברזולוציה גבוהה של גודל וריכוז. שתי ההגדרות החשובות הדרושות להקלטות וידאו אופטימליות הן (1) רמת המצלמה ו- (2) סף האיתור. אלה חייבים להיות מוגדרים על ידי האופרטור בהתבסס על מאפייני המדגם. אחד האילוצים העיקריים של ניתוח NTA הוא ההמלצה של ריכוזי מדגם בין 107 ו 109 חלקיקים / מ"ל, כדי להשיג דילול מדגם זה עשוי להידרש10. פתרונות המשמשים לדילול, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט, תמיסת מלח 0.15 M, או מים אולטרה-פור, הם לעתים רחוקות ללא חלקיקים פחות מ 220 מיקרומטר בגודל, אשר עשוי להשפיע על מדידות NTA. אפיון נת"ע של הפתרונות המשמשים לדילול צריך להתבצע באותה רמת מצלמה וסף זיהוי כמו דגימות ננו-חלקיקים המנותחות. הגודל והריכוז של חלקיקים הנמצאים בדילולים המשמשים לדילול מדגם EV נכללים לעתים רחוקות בפרסומים הכוללים ניתוח NTA של רכבים חשמליים.
פרוטוקול זה משתמש בניתוח NTA של ליפוזומים סינתטיים דמויי EV המוערך באמצעות רמות מצלמה נבחרות, סף זיהוי וסינון מכני של הדגימות כדי לנתח את ההשפעות השיטתיות של רמת המצלמה, סף הזיהוי או סינון מדגם בערכת הנתונים של NTA. ליפוזומים היו מסונתזים כמתואר בקובץ משלים S1. ליפוזומים סינתטיים שימשו בניסוי זה בגלל אחידות הגודל שלהם, מאפיינים פיזיים, ויציבות באחסון ב 4 °C (60 °F). למרות שניתן היה להשתמש בדגימות בפועל של רכבים חשמליים, ההטרוגניות והיציבות של כלי רכב חשמליים במהלך האחסון עשויות לסבך את המחקר הזה ואת הפרשנות שלו. קווי דמיון בדו"חות נת"ע מ-(A) ליפוזומים ו-(B) רכבים חשמליים מצביעים על כך שההשפעות השיטתיות שיחשפו לליפוזומים במאמר זה יחולו ככל הנראה גם על אפיון רכב חשמלי (איור 1). יחד, ממצאים אלה תומכים ברעיון שדיווח מלא של הגדרות תוכנה קריטיות ותיאור עיבוד מדגמי, כגון דילול, דילול וסינון, משפיעים על יכולת השחזור של נתוני NTA.
מטרת מאמר זה היא להדגים כי הושגו שינויים בהגדרות נת"ע (טמפרטורה, רמת מצלמה וסף איתור) והכנת מדגם לשינויים בתוצאות שנאספו: התקבלו הבדלים שיטתיים ומשמעותיים בגודל ובריכוז. כמו NTA היא אחת האפשרויות הפופולריות כדי למלא את מפרט האפיון MISEV2018, תוצאות אלה ממחישות את החשיבות של דיווח הכנת מדגם והגדרות NTA כדי להבטיח רבייה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> איור 1: נציג NTA מדווח על השוואת ליפוזומים לרכבים חשמליים. (א) ליפוזומים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 12 במרץ 2020. (ב) רכבים חשמליים: מדגם לא מסונן המאופיין ב- NTA ב- 26 באוגוסט 2021. קיצורים: NTA = ניתוח מעקב אחר חלקיקים; רכבים חשמליים = שלפוחיות חוץ-תאיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) היה אחד מכמה שיטות אפיון המשמשות למחקר שלפוחית חוץ תאית (EV) מאז 2006. רבים סבורים כי מכשירי NTA וחבילות התוכנה שלהם יכולים להיות מנוצלים בקלות לאחר אימון מינימלי וכי כיול גודל הוא אפשרי בתוך הבית. כמו רכישת NTA וניתוח תוכנה מהווים אפיון EV, הם מטופלים במידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ תאיות 2018 (MISEV2018). בנוסף, הם כבר במעקב על ידי דיווח שקוף וריכוז ידע במחקר שלפוחית חוץ תאית (EV-TRACK) כדי לשפר את החוסן של ניסויי EV (למשל, למזער וריאציה ניסיונית עקב גורמים בלתי מבוקרים).
למרות המאמצים לעודד דיווח על שיטות ובקרות, מאמרי מחקר רבים שפורסמו אינם מדווחים על הגדרות קריטיות הדרושות לשחזור התצפיות המקוריות של נת"ע. מאמרים מעטים מדווחים על אפיון NTA של פקדים שליליים או דילול, ככל הנראה בהנחה כי מוצרים זמינים מסחרית, כגון תמיסת מלח חוצצת פוספט או מים מזוקקים אולטרה-פור, הם ללא חלקיקים. באופן דומה, פקדים חיוביים או תקני גודל מדווחים רק לעתים רחוקות על ידי חוקרים כדי לאמת את גודל החלקיקים. משוואת סטוקס-איינשטיין משלבת צמיגות מדגם ומשתני טמפרטורה כדי לקבוע תזוזת חלקיקים. דיווח על טמפרטורת תא הלייזר היציבה במהלך כל איסוף הווידאו לדוגמה הוא, אם כן, אמצעי בקרה חיוני לשכפול מדויק. הסינון של דגימות או דילולים גם אינו מדווח באופן שגרתי, ואם כן, הפרטים של המסנן (יצרן, חומר ממברנה, גודל נקבוביות) ותנאי אחסון כלולים לעתים רחוקות. הסטנדרטים המינימליים של האגודה הבינלאומית לשלפוחית חוץ-תאית (ISEV) של פירוט ניסיוני מקובל צריכים לכלול פרוטוקול NTA מתועד היטב לאפיון של רכבים חשמליים. הניסוי הבא מספק ראיות לכך שפרוטוקול ניתוח NTA צריך להיקבע על ידי החוקר הבודד ולהיכלל בשיטות הפרסומים המשתמשים באפיון נת"ע כאחת האפשרויות למילוי דרישות MISEV2018 לאפיון שלפוחית יחיד.

טבלה 1 מכילה את התוצאות של סרטוני NTA עבור דגימות הליפוזום (18 מסוננות ו-18 לא מסוננות) ודילול DPBS מייצג. ההשוואות בין שתי הקבוצות הושלמו ללא קשר לרמת המצלמה או לסף הזיהוי במאמר זה. דגימות מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 108.5 ננומטר, מצב חלקיקים של 86.2 ננומטר, וריכוז של 7.4 × 108 חלקיקי...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) היא שיטה נפוצה לאפיון שלפוחיות חוץ-תאיות. מאמר זה מדגיש פרמטרים ובקרות ניסיוניים של NTA בתוספת שיטה אחידה של ניתוח ואפיון של דגימות ודילולים הדרושים כדי להשלים את ההנחיות המוצעות על ידי MISEV2018 ו- EV-TRACK לשחזור בין מעבדות.

שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

פרוטוקול זה פותח עבור מפעילי טירון של NanoSight LM10. על ידי ביצוע ההוראות שלב אחר שלב, ניתן להשיג תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור. טכניקה זו מסייעת להבטיח תוצאות עקביות במהלך ריצות ניסיון מרובות ללא קשר לרמת המיומנות של המשתמש.אפיון ננו-חלקיקים, במיוחד כימות, ממשיך להיות אתגר בתחום המחקר השלפוחית החוץ-תאית. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח עקבי של גודל וריכוז של חלקיקים בהשעיה. התחל על ידי ניקוי משטחי הזכוכית של מודול הלייזר עם מנקה עדשות באיכות טובה ונייר עדשה.לפני הרכבת המודול, ודא כי חותם O-טבעת יושב כראוי בחריץ של כיסוי תא הזרימה. לאחר מכן מניחים את כיסוי תא הזרימה על מודול הלייזר, ומבטיחים כי מגעים חשמליים נמצאים בכיוון הנכון. לאחר מכן, מניחים את ארבעת ברגי האגודל הטעונים בקפיץ דרך לוחית תא הזרימה ומפעילים את החוטים של מודול הלייזר מבלי להידוק בנפרד.תוך כדי הפעלת לחץ אחיד על כיסוי תא הזרימה, הדקו באופן אחיד את ברגי האגודל בצורה אלכסונית לסירוגין עד לקירור. לשטוף שני מזרקי שחפת מיליליטר עם מתאמי מנעול להחליק שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS. הסר והשלך את הבוכנה ממזרק השחפת הראשון לפני החדרת המזרק ליציאה הנותרת כדי לשמש כמאגר דילול או מדגם.לאחר מכן מלא את המזרק השני במיליליטר אחד של DPBS וצרף אותו ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה. החזק את מודול הלייזר מוטה עם יציאת מזרק השקע מורמת כדי לאפשר לאוויר להיות מטוהר מהתא כמו DPBS מוזרק לאט לתוך מודול הלייזר. לשטוף את DPBS הנותרים ממודול הלייזר על ידי הזרקת מיליליטר אחד של אוויר לתוך היציאה הנכנסת.חזור על השטיפה פעמיים. לאחר הסומק האחרון, רוקנו את מודול הלייזר לחלוטין ככל האפשר וטענו את המודול למיקוד ולמיקום. פתח את התוכנה.תחת כרטיסיית הלכידה בתיבה הימנית העליונה, לחץ על התחל מצלמה. אם המצלמה נכבית באופן אוטומטי לאחר חמש דקות, לחץ על הפעל את המצלמה כדי להפעיל אותה מחדש. באותה כרטיסיה, התאם את רמת המצלמה ל- 14 עד 16 כדי להבהיר את קו הלייזר ולפשט את זיהוי החלקיקים ואת המיקוד.על-ידי הזזת המחוון העליון בצד שמאל של החלק השמאלי של הראש פנימה או החוצה, הסט את התמונה מהמצלמה אל העפעפיים. בשדה הראייה, מצא את האזור של צפיפות מוגברת, המכונה טביעת האצבע והמרכז, ולמקד את טביעת האצבע אנכית. בשדה הראייה, מרכז את קו הלייזר ולאחר מכן הזז את המחוון העליון כדי להסיט את האור למצלמה כפי שנצפה על מסך המחשב.התמונה על מסך המחשב היא תמונת מראה מהתצוגה בעפעפי המיקרוסקופ. התאם את המוקד כדי לחדד את התמונה של חלקיקים נעים בודדים על המסך באמצעות ידית המיקוד. כדי לטעון את הדגימות, לצייר מיליליטר אחד של המדגם לתוך מזרק שחפת מיליליטר שטוף ולחבר את המזרק ליציאת הכניסה של כיסוי תא הזרימה.ממשיכים לקדם את הבוכנה עד שהנוזל ניכר במזרק הפתוח המחובר ליציאת השקע. המודול צריך להיות מוטה כדי לאפשר לאוויר להיות מטוהר ממודול הלייזר. בתצוגת המצלמה, העבר את המוקד מימין לקו הלייזר לאזור של מספר אחיד של חלקיקים.התאם את הכיוון האנכי כדי למרכז את רצועות האור האופקיות ולמקד מחדש עד שהמספר הגבוה ביותר של חלקיקים יהיה בתצוגה. ודא לשמור על המיקום של המוקד עקבי עבור כל האמצעים הבאים. התאם את רמת המצלמה לנקודה שבה סמל המידע הכהה מהבהב לסירוגין לסירוגין בפינה השמאלית העליונה של תצוגת המצלמה.לניתוח מעקב אחר חלקיקים, או NTA, הגדר את משך הזמן ל-30 או 60 שניות ואת מספר הסרטונים לחמש. כדי לשנות את שם קובץ הבסיס הקיים, לחץ על הכרטיסיה עבור אתר אחסון חדש עבור נתונים שנוצרו עם שם קובץ חדש. לאחר מכן בדוק את תיבת טמפרטורת היעד כדי להזין את הטמפרטורה הרצויה ולחץ על צור סקריפט כדי לעשות שימוש חוזר במדידה הרגילה.לאחר טעינת הדגימה והניסוי מוכן להפעלה, לחץ על צור והפעל קובץ Script. במסך המוקפץ של פרטי הדוח המוגדר, מלא את השדות במידע הדרוש על האופרטור, המדגם והדולל. לאחר מילוי כל השדות הרצויים, לחץ על הגדרות אישור כדי לאתחל את קובץ ה- Script.לפני כל לכידת וידאו, חפש הנחיה לקדם את הבוכנה באופן ידני. הזרקו כ-0.05 מיליליטר של הדגימה לתא הלייזר. כשהחלקיקים נחים, לחץ על אישור. עם השלמת לכידת הווידאו החמישית, תופיע תיבת אישור הגדרות יחד עם תיבת התהליך.כאשר המסגרות מתקדמות באופן ידני מתחתית מסך הווידאו, שים לב למספר הצלבים הכחולים היוצרים חלקיקים על המסך והגדר את סף האיתור לעיבוד המדגם. המתן לעיבוד אוטומטי של סרטוני הווידאו בהיסטוגרמה של תוצאות לפני הצגת הודעת השלמה בתיבת דו-שיח ולאחר מכן לחץ על אישור. לאחר הופעת התיבה הגדרות ייצוא, שמור את התוצאות על-ידי לחיצה על ייצוא. סמן את כל חמשת סרטוני הלכידה המפורטים בניסוי הנוכחי.לאחר מכן, לחץ על עבד קבצים נבחרים והמתן שתיבת אישור ההגדרה תופיע בתיבת התהליך כדי לשנות את סף האיתור ולאחר מכן התאם את סף האיתור לרמה הרצויה ועבור להגדרה ולחץ על אישור. הסרטונים יעובדו באופן אוטומטי בהיסטוגרמה של תוצאות ותיבת דו-שיח תוצג הודעה על השלמה. לחץ OK.In את הניתוח הייצוגי, את התוצאות של ניתוח nanotracking, או NTA, עבור דגימות ליפוזום ודילול DPBS מייצג מוצגים. דגימות מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 108 ננומטר וריכוז של 7.4 כפול 10 לחלקיקים השמיניים למיליליטר.לעומת זאת, דגימות לא מסוננות היו קוטר חלקיקים ממוצע של 159 ננומטר וריכוז של 7.6 כפול 10 לחלקיקים השמיניים למיליליטר. ברמות מצלמה משולבות, ככל שסף האיתור הוגדל משניים לחמש, גודל החלקיקים הממוצע והמצב הראה ירידה משמעותית בגדלי החלקיקים של הדגימות המסוננות. ריכוזי החלקיקים ברמות המצלמה המשולבות ירדו ככל שסף האיתור הוגדל.לא זוהה הבדל משמעותי בריכוזי החלקיקים בין דגימות מסוננות לדגימות לא מסוננות. בסף זיהוי משולב, ככל שרמת המצלמה עלתה מ-12 ל-14, נרשמה ירידה בגודל החלקיקים הממוצע והמצבי של הדגימות המסוננות. ריכוזי החלקיקים בסף הזיהוי המשולב עלו ככל שרמות המצלמה עלו מ-12 ל-14.לא נצפו הבדלים משמעותיים בין דגימות מסוננות לדגימות לא מסוננות. שלבים 4.1 עד 5.2 חשובים כדי למצוא את אזור הצפייה הנכון. השגת תוצאות עקביות על-פני ריצות ניסיון מרובות תלויה במיומנות חוזרת זו.פיזור אור דינמי משמש לעתים קרובות כבן לוויה לניתוח מעקב ננו-חלקיקים בעיקר כדי לקבל את פוטנציאל הזטה, שהוא מטען פני השטח של החלקיקים. עבור ניתוח חלקיקים, NTA ממשיך להיות שיטה בעלת ערך רב לכימות של חלקיקים שימושי למחקר שלפוחית חוץ תאית.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

עיצוב של bioreactor לחץ על מחזורי Ex Vivo מחקר של מסתמי הלב אבי העורקים

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

הערכת משלוח גן פולימרית חלקיקים על ידי Nanoparticle מעקב ניתוח וזרימת cytometry תפוקה גבוהה

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

התקן תזרים הלשכה תלת ממדי רומן ללמוד chemokine ביים-extravasation של תאים במחזור בתנאי זרימה פיסיולוגיים

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

כימות וגודל-פרופיל של תאית שלפוחית ​​באמצעות Pulse חישה מתכוונן התנגדותי

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

ננו-חלקיק Retroductal הזרקה אל בלוטת Submandibular מאתר

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

הערכת יציבות האחסון של שלפוחיות ומסחטות

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

ב Vivo שני צבעים 2-פוטון הדמיה של תאי כתב שתייגת גנטית בעור

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...