Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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इस काम को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए मिडवेस्ट इंस्टीट्यूट, जॉनसन कैंसर रिसर्च सेंटर को तुलनात्मक स्टेम सेल जीवविज्ञान (MICSCB) के लिए कंसास राज्य द्वारा समर्थित किया गया था, जो MLW और एनआईएच R21AG066488 को LKC के लिए था। OLS को MICSCB से GRA समर्थन प्राप्त हुआ। लेखकइस परियोजना में उपयोग किए जाने वाले लिपोसोम और सहायक वार्तालापों और प्रतिक्रिया के लिए वीस और क्रिस्टनसन प्रयोगशालाओं के सदस्यों को प्रदान करने के लिए डॉ संतोष आर्यल को धन्यवाद देते हैं। डॉ हांग वह तकनीकी सहायता के लिए धन्यवाद दिया जाता है। MLW उसके समर्थन और वकील के लिए Betti Goren Weiss धन्यवाद.

1. सामान्य प्रोटोकॉल दिशानिर्देश
<ol><li>एक हवा की मेज पर या एक कंपन मुक्त मेज पर एक न्यूनतम पर माइक्रोस्कोप बनाए रखें। सुनिश्चित करें कि बाहरी कंपन (उदाहरण के लिए, फर्श पर पैर दोहन, मेज को छूना, दरवाजा ...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

नैनोकणों के आकार और एकाग्रता का अनुमान लगाने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं। इनमें पहनावा विधियां शामिल हैं जो एक आबादी से आकार का अनुमान उत्पन्न करती हैं, जिसमें गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन (डीएलएस),...

ईवी और अन्य नैनोमीटर-स्केल किए गए कणों का सटीक और दोहराने योग्य विश्लेषण अनुसंधान और उद्योग में कई चुनौतियों को प्रस्तुत करता है। ईवी अनुसंधान की प्रतिकृति मुश्किल रही है, भाग में, डेटा संग्रह से जुड़े आवश्यक मापदंडों की रिपोर्टिंग में एकरूपता की कमी के कारण। इन कमियों को दूर करने के लिए, ISEV ने ईवी शोधकर्ताओं के लिए जैव रासायनिक, बायोफिजिकल और कार्यात्मक मानकों के न्यूनतम सेट के रूप में उद्योग दिशानिर्देशों का प्रस्ताव दिया और उन्हें एक स्थिति बयान के रूप में प्रकाशित किया, जिसे आमतौर पर MISEV20141 के रूप में जाना जाता है। ईवी अनुसंधान की तेज गति के लिए एक अद्यतन दिशानिर्देश की आवश्यकता थी, और "MISEV2018: ISEV का एक स्थिति कथन" ने MISEV2014 दिशानिर्देशों2 का विस्तार किया। MISEV2018 पेपर में टेबल, सुझाए गए प्रोटोकॉल की रूपरेखा, और विशिष्ट ईवी-संबद्ध लक्षण वर्णन को दस्तावेज़ करने के लिए पालन करने के लिए चरण शामिल थे। प्रयोगों की व्याख्या और प्रतिकृति को सुविधाजनक बनाने के लिए एक और उपाय के रूप में, EV-TRACK को एक भीड़-सोर्सिंग नॉलेजबेस (http://evtrack.org) के रूप में विकसित किया गया था ताकि EV जीव विज्ञान की अधिक पारदर्शी रिपोर्टिंग और प्रकाशितपरिणामों के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को सक्षम किया जा सके। विधियों की मानकीकृत रिपोर्टिंग के लिए इन सिफारिशों के बावजूद, फ़ील्ड प्रकाशित परिणामों की प्रतिकृति और पुष्टि करने के बारे में पीड़ित है।
गुणवत्ता मूल्यांकन उपकरणों के लिए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ और नेशनल साइंस फाउंडेशन के प्रयास के साथ फिटिंग, इस पेपर से पता चलता है कि ISEV को तरीकों और विवरणों की मानकीकृत रिपोर्टिंग की आवश्यकता होती है ताकि प्रयोगशालाओं के बीच परिणामों की प्रतिकृति के लक्ष्य के साथ डेटा मूल्यांकन उपकरण लागू किए जा सकें। ईवी आबादी के गुणों को परिभाषित करने के लिए सेल स्रोतों, सेल संस्कृति प्रक्रियाओं और ईवी अलगाव विधियों की रिपोर्टिंग महत्वपूर्ण कारक हैं। एनटीए उपकरणों के बीच, पता लगाने की सेटिंग्स, वाहक तरल पदार्थ का अपवर्तक सूचकांक, पॉलीडिस्पर्सिटी में योगदान देने वाली विषम कण आबादी, मानकीकृत रिपोर्टिंग आवश्यकताओं की कमी, और अनुपस्थित इंट्रा- और इंटर-ऑब्जर्वर माप परिणामों जैसे कारकों ने प्रयोगशालाओं के बीच एनटीए की तुलना को मुश्किल या असंभव बना दिया है।
2006 के बाद से उपयोग में, एनटीए नैनोपार्टिकल आकार और एकाग्रता निर्धारण के लिए एक लोकप्रिय विधि है जो वर्तमान में लगभग 80% ईवीशोधकर्ताओं द्वारा उपयोग की जाती है। MISEV2018 दिशानिर्देशों के लिए एकल-पुटिका विश्लेषण के दो रूपों की आवश्यकता होती है, जिनमें से एनटीए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है। एनटीए अपनी व्यापक पहुंच, प्रति नमूना कम लागत, और इसके सीधे संस्थापक सिद्धांत (स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण) के कारण ईवी लक्षण वर्णन के लिए आम उपयोग में बना हुआ है। एनटीए द्वारा ईवी मूल्यांकन लेजर प्रकाश प्रकीर्णन और ब्राउनियन गति विश्लेषण का उपयोग करके एक कण आकार वितरण और एकाग्रता अनुमान उत्पन्न करता है, जिसमें ईवी के अपवर्तक सूचकांक द्वारा निर्धारित पहचान की निचली सीमा होती है। ज्ञात चिपचिपाहट और तापमान के तरल पदार्थ के नमूने का उपयोग करते समय, ईवी के प्रक्षेपवक्रों को दो आयामों में उनके माध्य-वर्ग विस्थापन को निर्धारित करने के लिए ट्रैक किया जाता है। यह कण प्रसार गुणांक की गणना करने और एक संशोधित स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण 5,6,7 द्वारा एक गोले-समतुल्य हाइड्रोडायनामिक व्यास में परिवर्तित करने की अनुमति देता है। एनटीए के कण-से-कण विश्लेषण में लक्षण वर्णन के अन्य तरीकों की तुलना में ईवी की विषम आबादी में agglomerates या बड़े कणों द्वारा कम हस्तक्षेपहोता है। जबकि कुछ बड़े कणों का आकार सटीकता पर न्यूनतम प्रभाव पड़ता है, बड़े, उच्च प्रकाश-प्रकीर्णन कणों की भी मिनट की मात्रा की उपस्थिति के परिणामस्वरूप कम सॉफ़्टवेयर ईवी का पता लगाने और ट्रैकिंग 8 के कारण छोटे कणों का पता लगाने में उल्लेखनीय कमी आतीहै। एक माप तकनीक के रूप में, एनटीए को आम तौर पर बड़े कणों या कणों के समुच्चय की ओर पक्षपाती नहीं माना जाता है, लेकिन व्यक्तिगत कण विश्लेषण9 के माध्यम से कई आकार की आबादी को हल कर सकता है। कणों द्वारा प्रकाश-प्रकीर्णन के उपयोग के कारण, एनटीए विश्लेषण की सीमाओं में से एक यह है कि ईवी की तुलना में समान अपवर्तन और आकार विशेषताओं के साथ धूल, प्लास्टिक या पाउडर जैसे किसी भी कण को लक्षण वर्णन की इस विधि द्वारा वास्तविक ईवी से अलग नहीं किया जा सकता है।
NanoSight LM10 (nanoparticle आकार विश्लेषक) और LM14 (लेजर मॉड्यूल) 2006 के बाद से बेचा गया है, और हालांकि इस उपकरण के नए मॉडल विकसित किए गए हैं, यह विशेष मॉडल कई मुख्य सुविधाओं में पाया जाता है और इसे एक विश्वसनीय वर्कहॉर्स माना जाता है। आकार और एकाग्रता के उच्च-रिज़ॉल्यूशन माप के लिए एनटीए सेटिंग्स को ठीक से अनुकूलित करने के लिए प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। इष्टतम वीडियो रिकॉर्डिंग के लिए आवश्यक दो महत्वपूर्ण सेटिंग्स (1) कैमरा स्तर और (2) पहचान सीमा हैं। इन्हें नमूने की विशेषताओं के आधार पर ऑपरेटर द्वारा सेट किया जाना चाहिए। एनटीए विश्लेषण की प्रमुख बाधाओं में से एक 107 और 109 कणों / एमएल के बीच नमूना सांद्रता की सिफारिश है, इस नमूने को प्राप्त करने के लिए कमजोर पड़ने की आवश्यकता हो सकतीहै। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधान, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा, 0.15 एम खारा, या अल्ट्राप्योर पानी, शायद ही कभी आकार में 220 μm से कम कणों से मुक्त होते हैं, जो एनटीए माप को प्रभावित कर सकते हैं। कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले समाधानों के एनटीए लक्षण वर्णन को उसी कैमरा स्तर पर किया जाना चाहिए और नैनोपार्टिकल नमूनों के रूप में पता लगाने की सीमा का विश्लेषण किया जाना चाहिए। ईवी नमूना कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले डिलुएंट्स में मौजूद नैनोकणों के आकार और एकाग्रता को शायद ही कभी ईवी के एनटीए विश्लेषण से जुड़े प्रकाशनों में शामिल किया जाता है।
यह प्रोटोकॉल सिंथेटिक ईवी-जैसे लिपोसोम के एनटीए विश्लेषण का उपयोग करता है, जिसका मूल्यांकन चयनित कैमरा स्तरों, डिटेक्शन थ्रेसहोल्ड और नमूनों के यांत्रिक फ़िल्टरिंग का उपयोग करके किया जाता है ताकि एनटीए डेटासेट पर कैमरा स्तर, डिटेक्शन थ्रेशोल्ड या नमूना निस्पंदन के व्यवस्थित प्रभावों का विश्लेषण किया जा सके। Liposomes के रूप में पूरक फ़ाइल S1 में वर्णित संश्लेषित किए गए थे. सिंथेटिक लिपोसोम का उपयोग इस प्रयोग में उनके आकार की एकरूपता, भौतिक विशेषताओं और 4 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण में स्थिरता के कारण किया गया था। यद्यपि ईवी के वास्तविक नमूनों का उपयोग किया जा सकता था, भंडारण के दौरान ईवी की विषमता और स्थिरता ने इस अध्ययन और इसकी व्याख्या को जटिल बना दिया हो सकता है। (ए) लिपोसोम और (बी) ईवी से एनटीए रिपोर्टों में समानताएं इंगित करती हैं कि इस पेपर में लिपोसोम के लिए प्रकट किए गए व्यवस्थित प्रभाव संभवतः ईवी लक्षण वर्णन (चित्रा 1) पर भी लागू होंगे। साथ में, ये निष्कर्ष इस धारणा का समर्थन करते हैं कि महत्वपूर्ण सॉफ़्टवेयर सेटिंग्स की पूरी रिपोर्टिंग और नमूना प्रसंस्करण का विवरण, जैसे कि डिल्यूएंट, कमजोर पड़ने और निस्पंदन, एनटीए डेटा की पुनरुत्पादकता को प्रभावित करते हैं।
इस पेपर का उद्देश्य यह प्रदर्शित करना है कि एनटीए सेटिंग्स (तापमान, कैमरा स्तर, और पता लगाने की सीमा) और नमूना तैयारी में बदलाव के परिणामों को बदलना है: आकार और एकाग्रता में व्यवस्थित, महत्वपूर्ण अंतर प्राप्त किए गए थे। जैसा कि एनटीए MISEV2018 लक्षण वर्णन विनिर्देश को पूरा करने के लिए लोकप्रिय विकल्पों में से एक है, ये परिणाम पुनरुत्पादन सुनिश्चित करने के लिए नमूना तैयारी और एनटीए सेटिंग्स की रिपोर्टिंग के महत्व को प्रदर्शित करते हैं।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> चित्रा 1: प्रतिनिधि एनटीए रिपोर्ट करने के लिए लिपोसोम की तुलना करने के लिए EVs. (ए) लिपोसोम्स: 12 मार्च 2020 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना की विशेषता है। (बी) ईवी: 26 अगस्त 2021 को एनटीए पर अनफ़िल्टर्ड नमूना विशेषता है। संक्षेप: NTA = Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण; EVs = extracellular vesicles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) 2006 के बाद से extracellular vesicle (EV) अनुसंधान के लिए उपयोग किए जाने वाले कई लक्षण वर्णन विधियों में से एक रहा है। कई लोग मानते हैं कि एनटीए उपकरणों और उनके सॉफ़्टवेयर पैकेजों को न्यूनतम प्रशिक्षण के बाद आसानी से उपयोग किया जा सकता है और यह आकार अंशांकन इन-हाउस संभव है। जैसा कि एनटीए अधिग्रहण और सॉफ्टवेयर विश्लेषण दोनों ईवी लक्षण वर्णन का गठन करते हैं, उन्हें बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी 2018 (MISEV2018) में संबोधित किया जाता है। इसके अलावा, उन्हें पारदर्शी रिपोर्टिंग और बाह्य कोशिकीय पुटिका अनुसंधान (ईवी-ट्रैक) में ज्ञान को केंद्रीकृत करने द्वारा निगरानी की गई है ताकि ईवी प्रयोगों की मजबूती में सुधार किया जा सके (उदाहरण के लिए, अनियंत्रित कारकों के कारण प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करें)।
विधियों और नियंत्रणों की रिपोर्टिंग को प्रोत्साहित करने के प्रयासों के बावजूद, कई प्रकाशित शोध पत्र मूल एनटीए टिप्पणियों को पुन: पेश करने के लिए आवश्यक महत्वपूर्ण सेटिंग्स की रिपोर्ट करने में विफल रहते हैं। कुछ कागजात नकारात्मक नियंत्रण या डिलुएंट्स के एनटीए लक्षण वर्णन की रिपोर्ट करते हैं, स्पष्ट रूप से यह मानते हुए कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उत्पाद, जैसे कि फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा या अल्ट्राप्योर आसुत पानी, कण-मुक्त हैं। इसी तरह, सकारात्मक नियंत्रण या आकार मानकों को शायद ही कभी शोधकर्ताओं द्वारा कण आकार को सत्यापित करने के लिए रिपोर्ट किया जाता है। स्टोक्स-आइंस्टीन समीकरण में कण विस्थापन को निर्धारित करने के लिए नमूना चिपचिपाहट और तापमान चर शामिल हैं। पूरे नमूना वीडियो संग्रह के दौरान स्थिर लेजर कक्ष तापमान की रिपोर्टिंग, इसलिए, सटीक प्रतिकृति के लिए एक आवश्यक नियंत्रण उपाय है। नमूनों या डिलुएंट्स के निस्पंदन को भी नियमित रूप से रिपोर्ट नहीं किया जाता है, और यदि हां, तो फ़िल्टर की बारीकियों (निर्माता, झिल्ली सामग्री, छिद्र आकार) और भंडारण की स्थिति शायद ही कभी शामिल होती है। इंटरनेशनल सोसाइटी फॉर एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (ISEV) के स्वीकार्य प्रयोगात्मक विवरण के न्यूनतम मानकों में ईवी के लक्षण वर्णन के लिए एक अच्छी तरह से प्रलेखित एनटीए प्रोटोकॉल शामिल होना चाहिए। निम्नलिखित प्रयोग इस बात का सबूत प्रदान करता है कि एक एनटीए विश्लेषण प्रोटोकॉल को व्यक्तिगत शोधकर्ता द्वारा स्थापित करने की आवश्यकता है और प्रकाशनों के तरीकों में शामिल किया जाना चाहिए जो एकल पुटिका लक्षण वर्णन के लिए MISEV2018 आवश्यकताओं को पूरा करने के विकल्पों में से एक के रूप में एनटीए लक्षण वर्णन का उपयोग करते हैं।

तालिका 1 लिपोसोम नमूनों (18 फ़िल्टर और 18 unfiltered) और एक प्रतिनिधि DPBS diluent के लिए NTA वीडियो के परिणाम शामिल हैं। इस पेपर में कैमरा स्तर या डिटेक्शन थ्रेशोल्ड की परवाह किए बिना दो समूहों में तुलना पूरी हो गई थ?...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण (NTA) एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है जो बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं को चिह्नित करता है। यह पेपर एनटीए प्रयोगात्मक मापदंडों और नियंत्रणों के साथ-साथ प्रयोगशालाओं के बीच पुनरुत्पादन के लिए MISEV2018 और EV-TRACK द्वारा प्रस्तावित दिशानिर्देशों के पूरक के लिए आवश्यक नमूनों और डिलुएंट्स के विश्लेषण और लक्षण वर्णन की एक समान विधि पर प्रकाश डालता है।

Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण में बाह्य कोशिकीय पुटिकाओं 2018 दिशानिर्देशों के अध्ययन के लिए न्यूनतम जानकारी को पूरा करने के लिए पुनरुत्पादन में सुधार

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

यह प्रोटोकॉल NanoSight LM10 के नौसिखिए ऑपरेटरों के लिए विकसित किया गया था। चरण-दर-चरण निर्देशों का पालन करके, सटीक और पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त किए जा सकते हैं। यह तकनीक उपयोगकर्ता के कौशल स्तर की परवाह किए बिना कई परीक्षण रन में लगातार परिणाम सुनिश्चित करने में मदद करती है।Nanoparticle लक्षण वर्णन, विशेष रूप से परिमाणीकरण, बाह्य कोशिकीय पुटिका अनुसंधान क्षेत्र में एक चुनौती बनी हुई है। यह प्रोटोकॉल निलंबन में नैनोकणों के एक सुसंगत आकार और एकाग्रता विश्लेषण की अनुमति देता है। एक अच्छी गुणवत्ता लेंस क्लीनर और लेंस पेपर के साथ लेजर मॉड्यूल के कांच की सतहों की सफाई से शुरू करें।मॉड्यूल की असेंबली से पहले, सुनिश्चित करें कि ओ-रिंग सील प्रवाह सेल कवर के नाली में ठीक से बैठी है। फिर लेजर मॉड्यूल पर प्रवाह सेल कवर रखें, यह सुनिश्चित करते हुए कि विद्युत संपर्क उचित अभिविन्यास में हैं। अगला, प्रवाह सेल प्लेट के माध्यम से चार वसंत-लोडेड अंगूठे के शिकंजा को रखें और व्यक्तिगत रूप से कसने के बिना लेजर मॉड्यूल के धागे को संलग्न करें।प्रवाह सेल कवर पर समान दबाव डालते समय, समान रूप से अंगूठे के शिकंजा को एक वैकल्पिक विकर्ण तरीके से कसते हुए जब तक कि स्नग न हो जाए। पर्ची लॉक एडाप्टर के साथ दो एक मिलीलीटर ट्यूबरकुलिन सिरिंज को तीन बार DPBS के एक मिलीलीटर के साथ फ्लश करें। निकालें और एक voided diluent या नमूना जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए शेष बंदरगाह में सिरिंज डालने से पहले पहले tuberculin सिरिंज से प्लंजर त्याग.फिर दूसरी सिरिंज को DPBS के एक मिलीलीटर के साथ भरें और इसे प्रवाह सेल कवर के इनलेट पोर्ट से संलग्न करें। आउटलेट सिरिंज पोर्ट के साथ झुका हुआ लेजर मॉड्यूल पकड़ो हवा को कक्ष से शुद्ध करने की अनुमति देने के लिए ऊंचा क्योंकि DPBS को लेजर मॉड्यूल में धीरे-धीरे इंजेक्ट किया जाता है। इनलेट पोर्ट में एक मिलीलीटर हवा इंजेक्ट करके लेजर मॉड्यूल से शेष DPBS फ्लश करें।फ्लशिंग को दो बार दोहराएं। अंतिम फ्लश के बाद, लेजर मॉड्यूल को यथासंभव पूरी तरह से खाली करें और ध्यान केंद्रित करने और स्थिति के लिए मॉड्यूल को लोड करें। सॉफ़्टवेयर खोलें.ऊपरी बाएँ कोने बॉक्स में कैप्चर टैब के अंतर्गत, कैमरा प्रारंभ करें क्लिक करें. यदि कैमरा पांच मिनट के बाद स्वचालित रूप से बंद हो जाता है, तो इसे पुनरारंभ करने के लिए स्टार्ट कैमरा पर क्लिक करें। एक ही टैब में, लेजर लाइन को उज्ज्वल करने और कण पहचान और फोकस को सरल बनाने के लिए कैमरा स्तर को 14 से 16 तक समायोजित करें।सिर के टुकड़े के बाईं ओर शीर्ष स्लाइडर को अंदर या बाहर ले जाकर, छवि को कैमरे से आईपीस में मोड़ें। दृश्य के क्षेत्र में, बढ़े हुए घनत्व के क्षेत्र को ढूंढें, जिसे थंबप्रिंट और केंद्र के रूप में जाना जाता है, और थंबप्रिंट को लंबवत रूप से ध्यान केंद्रित करें। दृश्य के क्षेत्र में, लेजर लाइन को केंद्र में रखें, फिर कंप्यूटर स्क्रीन पर देखे गए कैमरे में प्रकाश को मोड़ने के लिए शीर्ष स्लाइडर को स्थानांतरित करें।कंप्यूटर स्क्रीन पर छवि माइक्रोस्कोप आईपीस में दृश्य से एक दर्पण छवि है। फोकस घुंडी के साथ स्क्रीन पर व्यक्तिगत चलती कणों की छवि को तेज करने के लिए फोकस समायोजित करें। नमूनों को लोड करने के लिए, एक मिलीलीटर ट्यूबरकुलिन सिरिंज में नमूने के एक मिलीलीटर को ड्रा करें और सिरिंज को प्रवाह सेल कवर के इनलेट पोर्ट से संलग्न करें।प्लंजर को तब तक आगे बढ़ाते रहें जब तक कि आउटलेट पोर्ट से जुड़ी खुली सिरिंज में तरल पदार्थ स्पष्ट न हो जाए। मॉड्यूल को लेजर मॉड्यूल से हवा को शुद्ध करने की अनुमति देने के लिए झुकाया जाना चाहिए। कैमरा दृश्य में, लेजर लाइन के दाईं ओर फ़ोकस को कणों की एक समान संख्या के क्षेत्र में ले जाएँ।ऊर्ध्वाधर अभिविन्यास को प्रकाश और पुन: ध्यान केंद्रित करने के क्षैतिज बैंड को केंद्र में समायोजित करें जब तक कि कणों की उच्चतम संख्या दृश्य में न हो। बाद के सभी उपायों के लिए फोकस की स्थिति को सुसंगत बनाए रखना सुनिश्चित करें। कैमरा स्तर को इस बिंदु पर समायोजित करें कि अंधेरे जानकारी प्रतीक कैमरा दृश्य के शीर्ष दाईं ओर रुक-रुक कर चमकता है।Nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण, या NTA के लिए, अवधि को 30 या 60 सेकंड और वीडियो की संख्या को पांच पर सेट करें। मौजूदा आधार फ़ाइल नाम बदलने के लिए, किसी नए फ़ाइल नाम के साथ जनरेट किए गए डेटा के लिए एक नई संग्रहण साइट के लिए टैब क्लिक करें. फिर वांछित तापमान इनपुट करने के लिए लक्ष्य तापमान बॉक्स की जांच करें और मानक माप का पुन: उपयोग करने के लिए स्क्रिप्ट बनाने पर क्लिक करें।एक बार नमूना लोड हो जाता है और प्रयोग चलाने के लिए तैयार होता है, तो स्क्रिप्ट बनाने और चलाने पर क्लिक करें। सेट रिपोर्ट विवरण पॉप-अप स्क्रीन में, ऑपरेटर, नमूना, और diluent पर आवश्यक जानकारी के साथ फ़ील्ड भरें। जब सभी इच्छित फ़ील्ड भर गए हैं, तो स्क्रिप्ट प्रारंभ करने के लिए सेटिंग्स ठीक क्लिक करें.प्रत्येक वीडियो कैप्चर से पहले, प्लंजर को मैन्युअल रूप से आगे बढ़ाने के लिए एक प्रॉम्प्ट की तलाश करें। लेजर कक्ष में नमूने के लगभग 0.05 मिलीलीटर इंजेक्ट करें। जैसे ही कण आराम करने के लिए आते हैं, ठीक क्लिक करें. पांचवें वीडियो कैप्चर को पूरा करने पर, प्रक्रिया बॉक्स के साथ एक सेटिंग्स पुष्टिकरण बॉक्स दिखाई देगा।जैसा कि फ्रेम वीडियो स्क्रीन के नीचे से मैन्युअल रूप से उन्नत होते हैं, स्क्रीन पर कणों को बनाने वाले नीले क्रॉस की संख्या पर ध्यान दें और नमूने के प्रसंस्करण के लिए पता लगाने की सीमा निर्धारित करें। वीडियो को स्वचालित रूप से परिणामों के हिस्टोग्राम में संसाधित करने के लिए प्रतीक्षा करें, इससे पहले कि पूर्णता की संवाद बॉक्स अधिसूचना प्रदर्शित हो, फिर ठीक हिट करें। निर्यात सेटिंग्स बॉक्स प्रकट होने के बाद, निर्यात क्लिक करके परिणाम सहेजें. वर्तमान प्रयोग में सूचीबद्ध कैप्चर वीडियो के सभी पांच को हाइलाइट करें।इसके बाद, चयनित फ़ाइलों को संसाधित करें क्लिक करें और डिटेक्शन थ्रेशोल्ड को बदलने के लिए फ़्लैश करने के लिए प्रक्रिया बॉक्स में दिखाई देने के लिए सेटिंग पुष्टिकरण बॉक्स की प्रतीक्षा करें, फिर डिटेक्शन थ्रेशोल्ड को वांछित स्तर पर समायोजित करें और सेटिंग पर जाएं और ठीक क्लिक करें। वीडियो को परिणामों के हिस्टोग्राम में स्वचालित रूप से संसाधित किया जाएगा और पूरा होने की एक संवाद बॉक्स अधिसूचना प्रदर्शित की जाएगी। प्रतिनिधि विश्लेषण OK.In क्लिक करें, liposome नमूनों और एक प्रतिनिधि DPBS diluent के लिए nanotracking विश्लेषण, या NTA के परिणाम दिखाए जाते हैं। फ़िल्टर किए गए नमूनों में 108 नैनोमीटर का औसत कण व्यास और प्रति मिलीलीटर आठवें कणों के लिए 7.4 गुना 10 गुना की एकाग्रता थी।इसके विपरीत, अनफ़िल्टर्ड नमूनों में 159 नैनोमीटर का औसत कण व्यास और प्रति मिलीलीटर आठवें कणों के लिए 7.6 गुना 10 गुना की एकाग्रता थी। संयुक्त कैमरा स्तरों पर, जैसा कि पता लगाने की सीमा को दो से पांच तक बढ़ाया गया था, माध्य और मोड कण आकार ने फ़िल्टर किए गए नमूनों के कण आकार में महत्वपूर्ण कमी दिखाई। संयुक्त कैमरा स्तरों पर कण सांद्रता कम हो गई थी क्योंकि पता लगाने की सीमा में वृद्धि हुई थी।फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के बीच कण सांद्रता में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं पाया गया था। संयुक्त पहचान थ्रेसहोल्ड पर, जैसा कि कैमरा स्तर 12 से 14 तक बढ़ गया, फ़िल्टर किए गए नमूनों के माध्य और मोड कण आकार में कमी देखी गई थी। संयुक्त पता लगाने थ्रेसहोल्ड पर कण सांद्रता में वृद्धि हुई क्योंकि कैमरे का स्तर 12 से 14 तक बढ़ गया।फ़िल्टर किए गए और अनफ़िल्टर्ड नमूनों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया था। चरण 4.1 से 5.2 तक सही देखने के क्षेत्र को खोजने के लिए महत्वपूर्ण हैं। एकाधिक परीक्षण रन में लगातार परिणाम प्राप्त करना इस दोहराने योग्य कौशल पर निर्भर करता है।गतिशील प्रकाश प्रकीर्णन का उपयोग अक्सर मुख्य रूप से जीटा क्षमता प्राप्त करने के लिए नैनोपार्टिकल ट्रैकिंग विश्लेषण के लिए एक साथी के रूप में किया जाता है, जो कणों की सतह चार्ज है। Nanoparticle विश्लेषण के लिए, NTA बाह्य कोशिकीय पुटिका अनुसंधान के लिए उपयोगी कणों के परिमाणीकरण का एक बहुत ही मूल्यवान तरीका बना हुआ है।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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डिजाइन के लिए एक चक्रीय दबाव bioreactor पूर्व vivo</emमहाधमनी हार्ट वाल्व का> अध्ययन

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Polymeric जीन डिलीवरी के मूल्यांकन nanoparticle ट्रैकिंग विश्लेषण और उच्च throughput प्रवाह cytometry द्वारा नैनोकणों

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

शारीरिक प्रवाह शर्तों के तहत घूम प्रकोष्ठों की प्रतिलिपि का निर्देश परिस्त्राव अध्ययन करने के लिए एक उपन्यास तीन आयामी फ्लो चैंबर डिवाइस

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

कण ट्रैकिंग Microrheology 3 डी का उपयोग ट्यूमर मॉडल में बाह्य मैट्रिक्स कठोरता के अनुदैर्ध्य मापन

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

मात्रा का ठहराव और tunable प्रतिरोधक पल्स सेंसिंग का उपयोग कोशिकी vesicles के आकार की रूपरेखा

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

एक संशोधित दो photon माइक्रोस्कोप में 3 डी कक्षीय ट्रैकिंग: Intracellular vesicles की ट्रैकिंग के लिए एक आवेदन

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

कोशिकी vesicles के अलगाव और विशेषता के लिए कागज आधारित उपकरणों

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Murine अवअधोहनुज ग्रंथि को Retroductal Nanoparticle इंजेक्शन

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

बाह्य पुटिका के भंडारण स्थिरता का मूल्यांकन

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Vivo में दो रंग 2-फोटो त्वचा में आनुवंशिक रूप से टैग ्डकी गई रिपोर्टर कोशिकाओं की इमेजिंग

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...