Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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Il lavoro è stato supportato dallo stato del Kansas al Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), al Johnson Cancer Research Center a MLW e nih R21AG066488 a LKC. OLS ha ricevuto il supporto GRA dal MICSCB. Gli autori ringraziano il Dr. Santosh Aryal per aver fornito i liposomi utilizzati in questo progetto e i membri dei laboratori Weiss e Christenson per conversazioni e feedback utili. Dr. Hong He è ringraziato per il supporto tecnico. MLW ringrazia Betti Goren Weiss per il suo supporto e i suoi consigli.

1. Linee guida generali del protocollo
<ol><li>Mantenere il microscopio su un tavolo d'aria o almeno su un tavolo privo di vibrazioni. Assicurarsi che le vibrazioni estranee (ad esempio, picchiettare il piede sul pavimento, toccare il tavolo, chiudere le porte, il traffico del laboratorio) siano ridotte al minimo.</li>
	<li>Impostare e mantenere la temperatura del modulo laser a una temperatura costante per tutte le registrazioni video. NOTA: la temperatura scelta è stata di 25 °C perché l'analiz...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Esistono diversi metodi disponibili per stimare le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle11. Questi includono metodi di ensemble che generano una stima delle dimensioni da una popolazione, tra cui lo scattering dinamico della luce (DLS), la sedimentazione centrifuga e l'analisi a livello di singola particella: microscopia elettronica, NTA, microscopia a forza atomica e rilevamento di impulsi resistivi sintonizzabili. Di questi, DLS e NTA sono metodi di misurazione delle dimensioni e d...

L'analisi accurata e ripetibile dei veicoli elettrici e di altre particelle su scala nanometrica presenta numerose sfide nella ricerca e nell'industria. La replica della ricerca EV è stata difficile, in parte, a causa della mancanza di uniformità nella segnalazione dei parametri necessari associati alla raccolta dei dati. Per affrontare queste carenze, l'ISEV ha proposto linee guida del settore come un insieme minimo di standard biochimici, biofisici e funzionali per i ricercatori EV e li ha pubblicati come una dichiarazione di posizione, comunemente indicata come MISEV20141. Il ritmo accelerato della ricerca sui veicoli elettrici ha richiesto una linea guida aggiornata e il "MISEV2018: una dichiarazione di posizione dell'ISEV" ha ampliato le linee guida MISEV20142. Il documento MISEV2018 includeva tabelle, schemi di protocolli suggeriti e passaggi da seguire per documentare la caratterizzazione specifica associata ai veicoli elettrici. Come ulteriore misura per facilitare l'interpretazione e la replica degli esperimenti, EV-TRACK è stato sviluppato come una knowledge base di crowdsourcing (http://evtrack.org) per consentire una segnalazione più trasparente della biologia dei veicoli elettrici e della metodologia utilizzata per i risultati pubblicati3. Nonostante queste raccomandazioni per la segnalazione standardizzata dei metodi, il campo continua a soffrire per quanto riguarda la replica e la conferma dei risultati pubblicati.
In linea con lo sforzo del National Institutes of Health e della National Science Foundation per gli strumenti di valutazione della qualità, questo documento suggerisce che l'ISEV richiede una segnalazione standardizzata di metodi e dettagli in modo che gli strumenti di valutazione dei dati possano essere applicati con l'obiettivo di replicare i risultati tra i laboratori. La segnalazione di sorgenti cellulari, procedure di coltura cellulare e metodi di isolamento EV sono fattori importanti per definire le qualità della popolazione EV. Tra gli strumenti NTA, fattori come le impostazioni di rilevamento, l'indice di rifrazione del fluido vettore, le popolazioni eterogenee di particelle che contribuiscono alla polidispersità, la mancanza di requisiti di segnalazione standardizzati e l'assenza di risultati di misurazione intra e inter-osservatore rendono difficile o impossibile il confronto NTA tra i laboratori.
In uso dal 2006, nta è un metodo popolare per la determinazione delle dimensioni delle nanoparticelle e della concentrazione che è attualmente utilizzato da circa l'80% dei ricercatori EV4. Le linee guida MISEV2018 richiedono due forme di analisi a singola vescicola, di cui NTA è una delle opzioni popolari. L'NTA continua ad essere di uso comune per la caratterizzazione dei veicoli elettrici grazie alla sua ampia accessibilità, al basso costo per campione e alla sua semplice teoria fondante (l'equazione di Stokes-Einstein). La valutazione EV da parte di NTA genera una distribuzione granulometrica e una stima della concentrazione utilizzando lo scattering della luce laser e l'analisi del movimento browniano, con il limite inferiore di rilevamento determinato dall'indice di rifrazione dell'EV. Quando si utilizza un campione fluido di viscosità e temperatura note, le traiettorie dei veicoli elettrici vengono tracciate per determinare il loro spostamento medio quadrato in due dimensioni. Ciò consente di calcolare il coefficiente di diffusione delle particelle e convertirlo in un diametro idrodinamico equivalente alla sfera da un'equazionedi Stokes-Einstein modificata 5,6,7. L'analisi da particella a particella di NTA ha meno interferenze da parte di agglomerati o particelle più grandi in una popolazione eterogenea di veicoli elettrici rispetto ad altri metodi di caratterizzazione7. Mentre alcune particelle più grandi hanno un impatto minimo sulla precisione del dimensionamento, la presenza di quantità anche minime di particelle grandi e ad alta diffusione della luce si traduce in una notevole riduzione del rilevamento di particelle più piccole a causa della riduzione del rilevamento e del tracciamentoEV del software 8. Come tecnica di misurazione, l'NTA è generalmente considerato non prevenuto verso particelle più grandi o aggregati di particelle, ma può risolvere popolazioni di dimensioni multiple attraverso l'analisi delle singole particelle9. A causa dell'uso della diffusione della luce da parte delle particelle, uno dei limiti dell'analisi NTA è che qualsiasi particolato come polvere, plastica o polvere con attributi di rifrazione e dimensioni simili rispetto ai veicoli elettrici non può essere differenziato dai veicoli elettrici effettivi con questo metodo di caratterizzazione.
Il NanoSight LM10 (analizzatore di dimensioni delle nanoparticelle) e LM14 (modulo laser) sono stati venduti dal 2006 e, sebbene siano stati sviluppati modelli più recenti di questo strumento, questo particolare modello si trova in molte strutture principali ed è considerato un cavallo di battaglia affidabile. La formazione è necessaria per ottimizzare correttamente le impostazioni NTA per misurazioni ad alta risoluzione di dimensioni e concentrazione. Le due impostazioni importanti necessarie per registrazioni video ottimali sono (1) il livello della telecamera e (2) la soglia di rilevamento. Questi devono essere impostati dall'operatore in base alle caratteristiche del campione. Uno dei principali vincoli dell'analisi NTA è la raccomandazione di concentrazioni del campione tra 107 e 109 particelle / mL, per ottenere questa diluizione del campione può essere necessaria10. Le soluzioni utilizzate per la diluizione, come la soluzione salina tamponata con fosfato, la soluzione salina da 0,15 M o l'acqua ultrapura, sono raramente prive di particelle di dimensioni inferiori a 220 μm, il che può influire sulle misurazioni NTA. La caratterizzazione NTA delle soluzioni utilizzate per la diluizione deve essere eseguita allo stesso livello di telecamera e alla stessa soglia di rilevamento dei campioni di nanoparticelle che vengono analizzati. Le dimensioni e la concentrazione delle nanoparticelle presenti nei diluenti utilizzati per le diluizioni di campioni EV sono raramente incluse nelle pubblicazioni che coinvolgono l'analisi NTA dei veicoli elettrici.
Questo protocollo utilizza l'analisi NTA di liposomi sintetici simili a EV valutati utilizzando livelli di telecamera selezionati, soglie di rilevamento e filtraggio meccanico dei campioni per analizzare gli effetti sistematici del livello della telecamera, della soglia di rilevamento o della filtrazione del campione sul set di dati NTA. I liposomi sono stati sintetizzati come descritto nel file supplementare S1. I liposomi sintetici sono stati utilizzati in questo esperimento a causa della loro uniformità dimensionale, delle caratteristiche fisiche e della stabilità in conservazione a 4 °C. Sebbene fossero stati utilizzati campioni reali di veicoli elettrici, l'eterogeneità e la stabilità dei veicoli elettrici durante lo stoccaggio potrebbero aver complicato questo studio e la sua interpretazione. Le somiglianze nei rapporti NTA dei liposomi (A) e dei veicoli elettrici (B) indicano che gli effetti sistematici rivelati per i liposomi in questo articolo si applicheranno probabilmente anche alla caratterizzazione EV (Figura 1). Insieme, questi risultati supportano l'idea che la reportistica completa delle impostazioni critiche del software e la descrizione dell'elaborazione dei campioni, come diluente, diluizione e filtrazione, influiscano sulla riproducibilità dei dati NTA.
Lo scopo di questo documento è dimostrare che la variazione delle impostazioni NTA (temperatura, livello della telecamera e soglia di rilevamento) e la preparazione del campione cambiano i risultati raccolti: sono state ottenute differenze sistematiche e significative in termini di dimensioni e concentrazione. Poiché NTA è una delle opzioni più popolari per soddisfare le specifiche di caratterizzazione MISEV2018, questi risultati dimostrano l'importanza di riportare la preparazione del campione e le impostazioni NTA per garantire la riproducibilità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figura 1: Rapporti NTA rappresentativi per confrontare i liposomi con i veicoli elettrici. (A) Liposomi: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 12 marzo 2020. (B) Veicoli elettrici: campione non filtrato caratterizzato su NTA al 26 agosto 2021. Abbreviazioni: NTA = Nanoparticle tracking analysis; EV = vescicole extracellulari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è stata uno dei numerosi metodi di caratterizzazione utilizzati per la ricerca sulle vescicole extracellulari (EV) dal 2006. Molti ritengono che gli strumenti NTA e i loro pacchetti software possano essere facilmente utilizzati seguendo una formazione minima e che la calibrazione delle dimensioni sia fattibile internamente. Poiché sia l'acquisizione di NTA che l'analisi del software costituiscono la caratterizzazione EV, sono affrontati in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). Inoltre, sono stati monitorati da Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) per migliorare la robustezza degli esperimenti EV (ad esempio, ridurre al minimo le variazioni sperimentali dovute a fattori incontrollati).
Nonostante gli sforzi per incoraggiare la segnalazione di metodi e controlli, molti articoli di ricerca pubblicati non riportano le impostazioni critiche necessarie per riprodurre le osservazioni originali NTA. Pochi articoli riportano la caratterizzazione NTA di controlli negativi o diluenti, evidentemente assumendo che i prodotti disponibili in commercio, come la soluzione salina tamponata con fosfato o l'acqua distillata ultrapura, siano privi di particolato. Allo stesso modo, i controlli positivi o gli standard di dimensione sono raramente riportati dai ricercatori per verificare il dimensionamento delle particelle. L'equazione di Stokes-Einstein incorpora la viscosità del campione e le variabili di temperatura per determinare lo spostamento delle particelle. La segnalazione della temperatura stabile della camera laser durante l'intera raccolta video del campione è, quindi, una misura di controllo essenziale per una replica accurata. Anche la filtrazione di campioni o diluenti non viene riportata di routine e, in tal caso, le specifiche del filtro (produttore, materiale della membrana, dimensione dei pori) e le condizioni di conservazione sono raramente incluse. Gli standard minimi di dettaglio sperimentale accettabile dell'International Society for Extracellular Vesicle (ISEV) dovrebbero includere un protocollo NTA ben documentato per la caratterizzazione dei veicoli elettrici. Il seguente esperimento fornisce la prova che un protocollo di analisi NTA deve essere stabilito dal singolo ricercatore e incluso nei metodi delle pubblicazioni che utilizzano la caratterizzazione NTA come una delle opzioni per soddisfare i requisiti MISEV2018 per la caratterizzazione di singole vescicole.

La tabella 1 contiene i risultati dei video NTA per i campioni di liposomi (18 filtrati e 18 non filtrati) e un diluente DPBS rappresentativo. I confronti tra i due gruppi sono stati completati indipendentemente dal livello della telecamera o dalla soglia di rilevamento in questo documento. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108,5 nm, una modalità particellare di 86,2 nm e una concentrazione di 7,4 × 108 particelle/ml. Al contrario, i campioni non filtrati avev...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

L'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) è un metodo ampiamente utilizzato per caratterizzare le vescicole extracellulari. Questo documento evidenzia i parametri e i controlli sperimentali NTA oltre a un metodo uniforme di analisi e caratterizzazione di campioni e diluenti necessari per integrare le linee guida proposte da MISEV2018 e EV-TRACK per la riproducibilità tra laboratori.

Migliorare la riproducibilità per soddisfare le informazioni minime per gli studi sulle vescicole extracellulari 2018 Linee guida nell'analisi del tracciamento delle nanoparticelle

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Questo protocollo è stato sviluppato per gli operatori alle prime armi del NanoSight LM10. Seguendo le istruzioni passo-passo, è possibile ottenere risultati accurati e riproducibili. Questa tecnica aiuta a garantire risultati coerenti in più cicli di prova indipendentemente dal livello di abilità dell'utente.La caratterizzazione delle nanoparticelle, in particolare la quantificazione, continua ad essere una sfida nel campo della ricerca sulle vescicole extracellulari. Questo protocollo consente un'analisi coerente delle dimensioni e della concentrazione delle nanoparticelle in sospensione. Inizia pulendo le superfici vetrate del modulo laser con un detergente per lenti di buona qualità e carta per lenti.Prima di assemblare il modulo, assicurarsi che la guarnizione dell'O-ring sia posizionata correttamente nella scanalatura del coperchio della cella di flusso. Quindi posizionare il coperchio della cella di flusso sul modulo laser, assicurandosi che i contatti elettrici siano nel corretto orientamento. Quindi, posizionare le quattro viti a pollice caricate a molla attraverso la piastra della cella di flusso e innestare le filettature del modulo laser senza stringere individualmente.Mentre si esercita una pressione uniforme sul coperchio della cella di flusso, stringere uniformemente le viti a pollice in modo diagonale alternato fino a quando non si stringono. Lavare due siringhe di tubercolina da un millilitro con adattatori antiscivolo tre volte con un millilitro di DPBS. Rimuovere e scartare lo stantuffo dalla prima siringa di tubercolina prima di inserire la siringa nella porta rimanente per fungere da diluente svuotato o serbatoio del campione.Quindi riempire la seconda siringa con un millilitro di DPBS e collegarla alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso. Tenere il modulo laser inclinato con la porta della siringa di uscita sollevata per consentire l'eliminazione dell'aria dalla camera mentre il DPBS viene iniettato lentamente nel modulo laser. Lavare il DPBS rimanente dal modulo laser iniettando un millilitro di aria nella porta di ingresso.Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, svuotare il modulo laser nel modo più completo possibile e caricare il modulo per la messa a fuoco e il posizionamento. Aprire il software.Nella scheda Acquisizione nella casella nell'angolo in alto a sinistra, fare clic su Avvia fotocamera. Se la fotocamera si spegne automaticamente dopo cinque minuti, fare clic su Avvia fotocamera per riavviarla. Nella stessa scheda, regolare il livello della fotocamera su 14-16 per illuminare la linea laser e semplificare l'identificazione e la messa a fuoco delle particelle.Spostando il cursore superiore sul lato sinistro del pezzo di testa dentro o fuori, deviare l'immagine dalla fotocamera agli oculari. Nel campo visivo, individuare l'area di maggiore densità, denominata identificazione personale e centro, e mettere a fuoco l'identificazione personale verticalmente. Nel campo visivo, centrare la linea laser, quindi spostare il cursore superiore per deviare la luce verso la fotocamera come osservato sullo schermo del computer.L'immagine sullo schermo del computer è un'immagine speculare dalla vista negli oculari del microscopio. Regola la messa a fuoco per rendere più nitida l'immagine delle singole particelle in movimento sullo schermo con la manopola di messa a fuoco. Per caricare i campioni, prelevare un millilitro del campione in una siringa di tubercolina da un millilitro risciacquata e collegare la siringa alla porta di ingresso del coperchio della cella di flusso.Continuare a far avanzare lo stantuffo fino a quando il fluido non è evidente nella siringa aperta attaccata alla porta di uscita. Il modulo deve essere inclinato per consentire l'eliminazione dell'aria dal modulo laser. Nella vista della fotocamera, spostare la messa a fuoco a destra della linea laser su un'area di un numero uniforme di particelle.Regolate l'orientamento verticale per centrare le bande orizzontali di luce e rimettere a fuoco fino a quando non è visualizzato il maggior numero di particelle. Assicurarsi di mantenere la posizione del focus coerente per tutte le misure successive. Regolare il livello della fotocamera in modo che il simbolo di informazioni scure lampeggi a intermittenza in alto a destra nella vista della fotocamera.Per l'analisi del tracciamento delle nanoparticelle, o NTA, impostare la durata su 30 o 60 secondi e il numero di video su cinque. Per modificare il nome del file di base esistente, fare clic sulla scheda relativa a un nuovo sito di archiviazione per i dati generati con un nuovo nome file. Quindi selezionare la casella della temperatura di destinazione per inserire la temperatura desiderata e fare clic su Crea script per riutilizzare la misurazione standard.Una volta caricato l'esempio e l'esperimento è pronto per l'esecuzione, fare clic su Crea ed esegui script. Nella schermata pop-up dei dettagli del report impostato, compilare i campi con le informazioni necessarie sull'operatore, sul campione e sul diluente. Quando tutti i campi desiderati sono stati compilati, fare clic su Impostazioni OK per avviare lo script.Prima di ogni acquisizione video, cerca un prompt per far avanzare manualmente lo stantuffo. Iniettare circa 0,05 millilitri del campione nella camera laser. Quando le particelle si riposano, fare clic su OK. Al termine della quinta acquisizione video, verrà visualizzata una casella di conferma delle impostazioni insieme alla casella di processo.Poiché i fotogrammi vengono avanzati manualmente dalla parte inferiore dello schermo video, annotare il numero di croci blu che creano particelle sullo schermo e impostare la soglia di rilevamento per l'elaborazione del campione. Attendi che i video vengano elaborati automaticamente in un istogramma dei risultati prima che venga visualizzata una notifica di completamento nella finestra di dialogo, quindi premi OK. Dopo aver visualizzato la casella delle impostazioni di esportazione, salvare i risultati facendo clic su Esporta. Evidenzia tutti e cinque i video di acquisizione elencati nell'esperimento corrente.Quindi, fare clic su Elabora file selezionati e attendere che la casella di conferma dell'impostazione venga visualizzata nella casella di processo per lampeggiare per modificare la soglia di rilevamento, quindi regolare la soglia di rilevamento al livello desiderato e andare su Impostazione e fare clic su OK. I video verranno elaborati automaticamente in un istogramma dei risultati e verrà visualizzata una notifica di completamento nella finestra di dialogo. Fare clic OK.In l'analisi rappresentativa, vengono mostrati i risultati dell'analisi di nanotracking, o NTA, per i campioni di liposomi e un diluente DPBS rappresentativo. I campioni filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 108 nanometri e una concentrazione di 7,4 volte 10 all'ottava particella per millilitro.Al contrario, i campioni non filtrati avevano un diametro medio delle particelle di 159 nanometri e una concentrazione di 7,6 volte 10 all'ottava particella per millilitro. A livelli combinati di telecamere, poiché la soglia di rilevamento è stata aumentata da due a cinque, la dimensione media e modale delle particelle ha mostrato una significativa diminuzione delle dimensioni delle particelle dei campioni filtrati. Le concentrazioni di particelle a livelli combinati di telecamere sono diminuite con l'aumentare della soglia di rilevamento.Non è stata rilevata alcuna differenza significativa nelle concentrazioni di particelle tra campioni filtrati e non filtrati. Alle soglie di rilevamento combinate, poiché il livello della telecamera è aumentato da 12 a 14, è stata osservata una diminuzione della dimensione media e modale delle particelle dei campioni filtrati. Le concentrazioni di particelle alle soglie di rilevamento combinate sono aumentate con l'aumentare dei livelli della telecamera da 12 a 14.Non sono state osservate differenze significative tra campioni filtrati e non filtrati. I passaggi da 4.1 a 5.2 sono importanti per trovare l'area di visualizzazione corretta. Il raggiungimento di risultati coerenti in più cicli di prova dipende da questa abilità ripetibile.La diffusione dinamica della luce viene spesso utilizzata come compagno dell'analisi di tracciamento delle nanoparticelle principalmente per ottenere il potenziale zeta, che è la carica superficiale delle particelle. Per l'analisi delle nanoparticelle, l'NTA continua ad essere un metodo molto prezioso di quantificazione delle particelle utile per la ricerca sulle vescicole extracellulari.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

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Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

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Bioingegneria

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l&#39;analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Misurazione longitudinale di matrice extracellulare rigidità in 3D Tumore modelli utilizzando-particelle inseguimento Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Quantificazione e Size-profiling dei extracellulare vescicole Utilizzando sintonizzabile resistivo Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Dispositivi a base di carta per Isolamento e caratterizzazione di extracellulare vescicole

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Iniezione delle nanoparticelle Retroductal alla ghiandola sottomandibolare murina

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Valutazione della stabilità di conservazione delle vescicole extracellulari

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In Vivo a due colori immagini fotone di cellule reporter geneticamente taggate nella pelle

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...