Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Arbeidet ble støttet av staten Kansas til Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), Johnson Cancer Research Center til MLW og NIH R21AG066488 til LKC. OLS mottok GRA-støtte fra MICSCB. Forfatterne takker Dr. Santosh Aryal for å ha gitt liposomene som brukes i dette prosjektet og medlemmene av Weiss- og Christenson-laboratoriene for nyttige samtaler og tilbakemeldinger. Dr. Hong Han er takket for teknisk støtte. MLW takker Betti Goren Weiss for hennes støtte og råd.

1. Generelle retningslinjer for protokoller
<ol><li>Vedlikehold mikroskopet på et luftbord eller i det minste på et vibrasjonsfritt bord. Sørg for at fremmede vibrasjoner (f.eks. fottapping på gulvet, berøring av bordet, dørlukkinger, laboratorietrafikk) holdes på et minimum.</li>
	<li>Still inn og vedlikehold temperaturen på lasermodulen ved konstant temperatur for alle videoopptak. MERK: Den valgte temperaturen var 25 °C fordi nanopartikkelstørrelsesanalysatoren ble kalibrert ved den tem...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Det finnes flere metoder for å estimere størrelsen og konsentrasjonen av nanopartikler11. Disse inkluderer ensemblemetoder som genererer et størrelsesestimat fra en populasjon, inkludert dynamisk lysspredning (DLS), sentrifugalsedimentering og analyse-elektronmikroskopi på enkeltpartikkelnivå, NTA, mikroskopi og justerbar resistiv pulsmåling. Av disse er DLS og NTA mye brukt, ikke-ødeleggende størrelse og konsentrasjonsmålingsmetoder, basert på brownsk bevegelse i et ideelt medium. DLS e...

Nøyaktig og repeterbar analyse av elbiler og andre nanometerskalerte partikler byr på mange utfordringer på tvers av forskning og industri. Replikering av EV-forskning har blant annet vært vanskelig på grunn av manglende ensartethet i rapportering av nødvendige parametere knyttet til datainnsamling. For å løse disse manglene foreslo ISEV bransjeretningslinjer som et minimalt sett med biokjemiske, biofysiske og funksjonelle standarder for EV-forskere og publiserte dem som en posisjonserklæring, ofte referert til som MISEV20141. Det akselererende tempoet i EV-forskningen krevde en oppdatert retningslinje, og "MISEV2018: a position statement of the ISEV" utvidet MISEV2014-retningslinjene2. MISEV2018-artikkelen inkluderte tabeller, disposisjoner av foreslåtte protokoller og trinn du må følge for å dokumentere spesifikk EV-tilknyttet karakterisering. Som et ytterligere tiltak for å legge til rette for tolkning og replikering av eksperimenter, ble EV-TRACK utviklet som en crowd-sourcing kunnskapsbase (http://evtrack.org) for å muliggjøre mer gjennomsiktig rapportering av EV-biologi og metodikken som brukes for publiserte resultater3. Til tross for disse anbefalingene for standardisert rapportering av metoder, fortsetter feltet å lide når det gjelder replikering og bekreftelse av publiserte resultater.
I henhold til National Institutes of Health's og National Science Foundations innsats for kvalitetskontrollverktøy, antyder dette dokumentet at ISEV krever standardisert rapportering av metoder og detaljer slik at datavurderingsverktøy kan brukes med mål om å replikere resultater mellom laboratorier. Rapportering av cellekilder, cellekulturprosedyrer og EV-isolasjonsmetoder er viktige faktorer for å definere kvalitetene til EV-befolkningen. Blant NTA-instrumenter gjør faktorer som deteksjonsinnstillinger, brytningsindeksen for bærervæske, heterogene partikkelpopulasjoner som bidrar til polydispersitet, mangel på standardiserte rapporteringskrav og fraværende intra- og interobservatørmålingsresultater NTA-sammenligning mellom laboratorier vanskelig eller umulig.
I bruk siden 2006 er NTA en populær metode for nanopartikkelstørrelse og konsentrasjonsbestemmelse som i dag brukes av omtrent 80% av EV-forskere4. MISEV2018-retningslinjene krever to former for enkelt vesicle-analyse, hvorav NTA er et av de populære alternativene. NTA fortsetter å være i vanlig bruk for EV-karakterisering på grunn av sin brede tilgjengelighet, lave kostnader per prøve og dens enkle grunnteori (Stokes-Einstein-ligningen). EV-vurdering fra NTA genererer en partikkelstørrelsesfordeling og konsentrasjonsestimat ved hjelp av laserlysspredning og Brownian bevegelsesanalyse, med den nedre grensen for deteksjon bestemt av den brytningsindeksen til EV. Ved bruk av en væskeprøve av kjent viskositet og temperatur spores banene til ELBIL-ene for å bestemme deres gjennomsnittlige firkantede forskyvning i to dimensjoner. Dette gjør at partikkeldiffusjonskoeffisienten kan beregnes og omdannes til en sfæreekvivalent hydrodynamisk diameter ved en modifisert Stokes-Einstein-ligning 5,6,7. NTA's partikkel-til-partikkelanalyse har mindre interferens ved agglomerater eller større partikler i en heterogen populasjon av elbiler enn andre karakteriseringsmetoder7. Mens noen få større partikler har minimal innvirkning på størrelsesnøyaktigheten, resulterer tilstedeværelsen av jevne minuttmengder med store, høye lysspredningspartikler i en merkbar reduksjon i påvisning av mindre partikler på grunn av redusert programvare EV-deteksjon og sporing8. Som måleteknikk anses NTA generelt ikke å være partisk mot større partikler eller aggregater av partikler, men kan løse flere størrelser gjennom individuell partikkelanalyse9. På grunn av bruk av lysspredning av partikler, er en av begrensningene ved NTA-analyse at eventuelle partikler som støv, plast eller pulver med lignende brytning og størrelsesattributter sammenlignet med elbiler ikke kan skilles fra faktiske elbiler ved denne karakteriseringsmetoden.
NanoSight LM10 (nanopartikkelstørrelsesanalysator) og LM14 (lasermodul) har blitt solgt siden 2006, og selv om nyere modeller av dette instrumentet er utviklet, finnes denne modellen i mange kjerneanlegg og regnes som en pålitelig arbeidshest. Opplæring er nødvendig for å optimalisere NTA-innstillingene riktig for høyoppløselige målinger av størrelse og konsentrasjon. De to viktige innstillingene som trengs for optimale videoopptak er (1) kameranivået og (2) deteksjonsterskelen. Disse må angis av operatøren basert på utvalgets egenskaper. En av de viktigste begrensningene ved NTA-analyse er anbefalingen av prøvekonsentrasjoner mellom 107 og 109 partikler/ml, for å oppnå denne prøvefortynning kan være nødvendig10. Løsninger som brukes til fortynning, som fosfatbufret saltvann, 0,15 M saltvann eller ultrarent vann, er sjelden fri for partikler som er mindre enn 220 μm i størrelse, noe som kan påvirke NTA-målingene. NTA-karakterisering av løsningene som brukes til fortynning, bør utføres på samme kameranivå og deteksjonsterskel som nanopartikkelprøvene som analyseres. Størrelsen og konsentrasjonen av nanopartikler tilstede i fortynningsstoffer som brukes til EV-prøvefortynning er sjelden inkludert i publikasjoner som involverer NTA-analyse av elbiler.
Denne protokollen bruker NTA-analyse av syntetiske EV-lignende liposomer evaluert ved hjelp av utvalgte kameranivåer, deteksjonsterskler og mekanisk filtrering av prøvene for å analysere de systematiske effektene av kameranivå, deteksjonsterskel eller prøvefiltrering på NTA-datasettet. Liposomer ble syntetisert som beskrevet i Supplemental File S1. Syntetiske liposomer ble brukt i dette eksperimentet på grunn av deres størrelse ensartethet, fysiske egenskaper og stabilitet i lagring ved 4 °C. Selv om faktiske prøver av elbiler kunne ha blitt brukt, kan heterogeniteten og stabiliteten til elbiler under lagring ha komplisert denne studien og dens tolkning. Likheter i NTA-rapportene fra (A) liposomer og (B) elbiler tyder på at de systematiske effektene som avdekkes for liposomer i dette papiret, sannsynligvis også vil gjelde for EV-karakterisering (figur 1). Sammen støtter disse funnene forestillingen om at fullstendig rapportering av kritiske programvareinnstillinger og beskrivelsen av prøvebehandling, for eksempel fortynning, fortynning og filtrering, påvirker reproduserbarheten av NTA-data.
Formålet med dette dokumentet er å demonstrere at varierende NTA-innstillinger (temperatur, kameranivå og deteksjonsterskel) og prøvepreparering endrer resultatene som samles inn: systematiske, betydelige forskjeller i størrelse og konsentrasjon ble oppnådd. Siden NTA er et av de populære alternativene for å oppfylle MISEV2018-karakteriseringsspesifikasjonen, viser disse resultatene viktigheten av å rapportere prøvepreparering og NTA-innstillinger for å sikre reproduserbarhet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figur 1: Representative NTA-rapporter for å sammenligne liposomer med elbiler. (A) Liposomer: ufiltrert prøve karakterisert på NTA 12. (B) Elbiler: ufiltrert prøve karakterisert på NTA 26. Forkortelser: NTA = Nanopartikkelsporingsanalyse; Elbiler = ekstracellulære vesicles. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) har vært en av flere karakteriseringsmetoder som er brukt til ekstracellulær vesicle (EV) forskning siden 2006. Mange anser at NTA-instrumenter og deres programvarepakker lett kan brukes etter minimal opplæring, og at størrelseskalibrering er mulig internt. Siden både NTA-anskaffelse og programvareanalyse utgjør EV-karakterisering, blir de adressert i Minimal informasjon for studier av extracellulære vesikler 2018 (MISEV2018). I tillegg har de blitt overvåket av Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) for å forbedre robustheten til EV-eksperimenter (f.eks. minimere eksperimentell variasjon på grunn av ukontrollerte faktorer).
Til tross for arbeidet med å oppmuntre til rapportering av metoder og kontroller, klarer mange publiserte forskningsartikler ikke å rapportere kritiske innstillinger som trengs for å reprodusere de opprinnelige NTA-observasjonene. Få artikler rapporterer NTA-karakterisering av negative kontroller eller fortynningsmidler, noe som tydeligvis antar at kommersielt tilgjengelige produkter, som fosfatbufret saltvann eller ultrarent destillert vann, er partikkelfrie. På samme måte rapporteres positive kontroller eller størrelsesstandarder sjelden av forskere for å verifisere partikkelstørrelse. Stokes-Einstein-ligningen inneholder prøveviskositet og temperaturvariabler for å bestemme partikkelforskyvning. Rapportering av stabil laserkammertemperatur under hele prøvevideosamlingen er derfor et viktig kontrollmål for nøyaktig replikering. Filtrering av prøver eller fortynningsstoffer rapporteres heller ikke rutinemessig, og i så fall er spesifikasjonene til filteret (produsent, membranmateriale, porestørrelse) og lagringsforhold sjelden inkludert. International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)s minimale standarder for akseptable eksperimentelle detaljer bør inneholde en veldokumentert NTA-protokoll for karakterisering av elbiler. Følgende eksperiment gir bevis på at en NTA-analyseprotokoll må etableres av den enkelte forsker og inkluderes i metodene for publikasjoner som bruker NTA-karakterisering som et av alternativene for å oppfylle MISEV2018-krav for enkelt vesicle karakterisering.

Tabell 1 inneholder resultatene av NTA-videoene for liposomprøvene (18 filtrerte og 18 ufiltrerte) og et representativt DPBS-fortynningsmiddel. Sammenligninger på tvers av de to gruppene ble fullført uavhengig av kameranivå eller deteksjonsterskel i dette dokumentet. Filtrerte prøver hadde en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 108,5 nm, en partikkelmodus på 86,2 nm og en konsentrasjon på 7,4 × 108 partikler/ml. Ufiltrerte prøver hadde derimot en gjennomsnittlig partikkeldiameter p?...

Watch this Scientific Journal Video about Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis at JoVE.com

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanopartikkelsporingsanalyse (NTA) er en mye brukt metode for å karakterisere ekstracellulære vesikler. Dette dokumentet fremhever NTA eksperimentelle parametere og kontroller pluss en ensartet metode for analyse og karakterisering av prøver og fortynningsstoffer som er nødvendige for å supplere retningslinjene foreslått av MISEV2018 og EV-TRACK for reproduserbarhet mellom laboratorier.

Forbedre reproduserbarheten for å møte minimal informasjon for studier av ekstracellulære vesicles 2018 retningslinjer i nanopartikkelsporingsanalyse

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Denne protokollen ble utviklet for nybegynnere av NanoSight LM10. Ved å følge de trinnvise instruksjonene kan du oppnå nøyaktige og reproduserbare resultater. Denne teknikken bidrar til å sikre konsistente resultater på tvers av flere prøvekjøringer uavhengig av brukerens ferdighetsnivå.Nanopartikkelkarakterisering, spesielt kvantifisering, er fortsatt en utfordring i det ekstracellulære vesicleforskningsfeltet. Denne protokollen tillater en konsistent størrelses- og konsentrasjonsanalyse av nanopartikler i suspensjon. Begynn med å rengjøre glassoverflatene på lasermodulen med et objektivrenser og linsepapir av god kvalitet.Før modulen monteres, må du kontrollere at O-ringtetningen sitter riktig i sporet på strømningscelledekselet. Plasser deretter strømningscelledekselet på lasermodulen, og sørg for at elektriske kontakter er i riktig retning. Deretter plasserer du de fire fjærbelastede tommelskruene gjennom strømningscelleplaten og griper inn trådene til lasermodulen uten å stramme individuelt.Mens du legger et jevnt trykk ned på strømningscelledekselet, stram tommelskruene jevnt på en vekslende diagonal måte til de sitter godt. Skyll to en milliliter tuberkulin sprøyter med slip lock adaptere tre ganger med en milliliter DPBS. Fjern og kast stempelet fra den første tuberkulinsprøyten før sprøyten settes inn i den gjenværende porten for å fungere som et annullert fortynnings- eller prøvereservoar.Fyll deretter den andre sprøyten med en milliliter DPBS og fest den til innløpsporten til strømningscelledekselet. Hold lasermodulen vippet med utløpssprøyteporten forhøyet slik at luften kan renses fra kammeret når DPBS injiseres sakte i lasermodulen. Skyll de resterende DPBS fra lasermodulen ved å injisere en milliliter luft i innløpsporten.Gjenta spylingen to ganger. Etter den siste spylingen tømmer du lasermodulen så fullstendig som mulig og laster inn modulen for fokusering og posisjonering. Åpne programvaren.Klikk startkamera under opptaksfanen øverst til venstre. Hvis kameraet slås av automatisk etter fem minutter, klikker du start kameraet for å starte det på nytt. I samme fane justerer du kameranivået til 14 til 16 for å gjøre laserlinjen lysere og forenkle partikkelidentifikasjon og fokus.Ved å flytte den øverste glidebryteren på venstre side av hodestykket inn eller ut, omdirigerer du bildet fra kameraet til okularene. I synsfeltet finner du området med økt tetthet, referert til som avtrykk og midtpunkt, og fokuserer avtrykket loddrett. I synsfeltet midtstiller du laserlinjen, og deretter flytter du den øverste glidebryteren for å avlede lyset til kameraet som observert på dataskjermen.Bildet på dataskjermen er et speilbilde fra visningen i mikroskopokularene. Juster fokuset for å gjøre bildet av individuelle bevegelige partikler skarpere på skjermen med fokusknappen. For å laste prøvene, trekk opp en milliliter av prøven i en skyllet en milliliter tuberkulin sprøyte og fest sprøyten til innløpsporten på strømningscelledekselet.Fortsett å føre stempelet frem til det er tydelig væske i den åpne sprøyten som er festet til utløpsporten. Modulen skal vippes slik at luft kan renses fra lasermodulen. I kameravisningen flytter du fokus til høyre for laserlinjen til et område med et jevnt antall partikler.Juster den vertikale retningen for å midtstille de horisontale lysbåndene og fokusere på nytt til det høyeste antallet partikler er synlig. Sørg for å opprettholde fokusposisjonen konsistent for alle påfølgende tiltak. Juster kameranivået til det punktet at det mørke informasjonssymbolet blinker av og til øverst til høyre i kameravisningen.For nanopartikkelsporingsanalyse, eller NTA, sett varigheten til 30 eller 60 sekunder og antall videoer til fem. Hvis du vil endre det eksisterende basisfilnavnet, klikker du kategorien for et nytt lagringsområde for genererte data med et nytt filnavn. Merk deretter av i måltemperaturboksen for å legge inn ønsket temperatur og klikk på opprett skript for å gjenbruke standardmålingen.Når eksemplet er lastet inn og eksperimentet er klart til å kjøres, klikker du opprett og kjør skript. Fyll ut feltene med nødvendig informasjon om operatoren, prøven og fortynningsmiddelet i skjermbildet angi rapportdetaljer. Når alle ønskede felt er fylt ut, klikker du innstillinger OK for å starte skriptet.Før hvert videoopptak, se etter en melding om å flytte stempelet manuelt. Injiser ca. 0,05 milliliter av prøven i laserkammeret. Når partiklene kommer til hvile, klikker du OK. Når du har fullført det femte videoopptaket, vises en innstillingsbekreftelsesboks sammen med prosessboksen.Etter hvert som delbildene fremskyndes manuelt fra bunnen av videoskjermen, noterer du deg antall blå kryss som lager partikler på skjermen og angir deteksjonsterskelen for behandling av prøven. Vent til videoene automatisk behandles i et histogram med resultater før en dialogboksvarsling om fullføring vises, og trykk deretter OK. Når boksen for eksportinnstillinger vises, lagrer du resultatene ved å klikke eksporter. Fremhev alle de fem innspillingsvideoene som er oppført i det nåværende eksperimentet.Deretter klikker du behandle valgte filer og venter på at innstillingsbekreftelsesboksen skal vises i prosessboksen for å blinke for å endre deteksjonsterskelen, og deretter justere deteksjonsterskelen til ønsket nivå og gå til innstilling og klikk OK. Videoene behandles automatisk i et histogram med resultater, og en dialogboksvarsling om fullføring vises. Klikk OK.In den representative analysen vises resultatene av nanotracking-analysen, eller NTA, for liposomprøvene og et representativt DPBS-fortynningsmiddel. Filtrerte prøver hadde en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 108 nanometer og en konsentrasjon på 7,4 ganger 10 til de åttende partiklene per milliliter.Ufiltrerte prøver hadde derimot en gjennomsnittlig partikkeldiameter på 159 nanometer og en konsentrasjon på 7,6 ganger 10 til åttende partikler per milliliter. Ved kombinerte kameranivåer, da deteksjonsterskelen ble økt fra to til fem, viste gjennomsnittlig og modus partikkelstørrelse en betydelig reduksjon i partikkelstørrelsene til de filtrerte prøvene. Partikkelkonsentrasjonene ved kombinerte kameranivåer ble redusert etter hvert som deteksjonsterskelen ble økt.Det ble ikke påvist signifikant forskjell i partikkelkonsentrasjoner mellom filtrerte og ufiltrerte prøver. Ved kombinerte deteksjonsterskler, etter hvert som kameranivået økte fra 12 til 14, ble det notert en reduksjon i gjennomsnittlig og modus partikkelstørrelse på de filtrerte prøvene. Partikkelkonsentrasjonene ved kombinerte deteksjonsterskler økte etter hvert som kameranivåene økte fra 12 til 14.Ingen signifikante forskjeller mellom filtrerte og ufiltrerte prøver ble observert. Trinn 4.1 til og med 5.2 er viktig for å finne riktig visningsområde. Å oppnå konsistente resultater på tvers av flere prøvekjøringer avhenger av denne repeterbare ferdigheten.Dynamisk lysspredning brukes ofte som følgesvenn til nanopartikkelsporingsanalyse først og fremst for å få zetapotensialet, som er overflateladningen til partiklene. For nanopartikkelanalyse fortsetter NTA å være en svært verdifull metode for kvantifisering av partikler som er nyttige for ekstracellulær vesicleforskning.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Evaluation of Polymeric Gene Delivery Nanoparticles by Nanoparticle Tracking Analysis and High-throughput Flow Cytometry

Evaluering av polymere Gene levering Nanopartikler av nanopartikler Tracking Analysis og High-throughput flowcytometri

Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

A Novel Tredimensjonal Flow Chamber Device å studere Chemokine, rettet Ekstravasering Celler Sirkulerende under fysiologiske strømningsforhold

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

Langsgående Måling av ekstracellulære matrix Stivhet i 3D tumormodeller Bruke Partikkel-sporing Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

Kvantifisering og Size-profilering av Ekstracellulær Blemmer Bruke Tunable Resistive Pulse Sensing

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Tracking i en modifisert to-foton Microscope: en søknad til sporing av intracellulær Blemmer

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Papirbaserte Enheter for isolering og karakterisering av Ekstracellulær Blemmer

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Retroductal Nanoparticle injeksjon til Murine Submandibular kjertel

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Evaluering av lagrings stabiliteten til ekstracellulære blemmer

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo to-Color 2-Foton Imaging av genetisk-Tagged reporter celler i huden

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...