Name: improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis
Uploaded: 2021-11-17T13:00:00
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O trabalho foi apoiado pelo estado do Kansas para o Midwest Institute for Comparative Stem Cell Biology (MICSCB), o Johnson Cancer Research Center to MLW e NIH R21AG06488 para LKC. O OLS recebeu suporte gra do MICSCB. Os autores agradecem ao Dr. Santosh Aryal por fornecer os lipossomos utilizados neste projeto e aos membros dos laboratórios Weiss e Christenson por conversas úteis e feedback. Hong Ele é grato pelo apoio técnico. MLW agradece Betti Goren Weiss por seu apoio e conselho.

1. Diretrizes gerais do protocolo
<ol><li>Mantenha o microscópio em uma mesa de ar ou no mínimo em uma mesa livre de vibrações. Certifique-se de que vibrações estranhas (por exemplo, batidas no chão, tocando na mesa, fechamentos de portas, tráfego de laboratório) sejam mantidas ao mínimo.</li>
	<li>Defina e mantenha a temperatura do módulo laser a uma temperatura constante para todas as gravações de vídeo. NOTA: A temperatura escolhida foi de 25 °C porque o analisador de tamanho de na...

<ol>
	<li>Lotvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).</li><li>Thery, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+(MISEV2018):+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines.">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).</li><li>Consortium, E. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EV-TRACK:+transparent+reporting+and+centralizing+knowledge+in+extracellular+vesicle+research.">EV-TRACK: transparent reporting and centralizing knowledge in extracellular vesicle research.</a> Nature Methods. 14 (3), 228-232 (2017).</li><li>Gardiner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Techniques+used+for+the+isolation+and+characterization+of+extracellular+vesicles:+results+of+a+worldwide+survey.">Techniques used for the isolation and characterization of extracellular vesicles: results of a worldwide survey.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 5, 32945 (2016).</li><li>Maas, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Possibilities+and+limitations+of+current+technologies+for+quantification+of+biological+extracellular+vesicles+and+synthetic+mimics.">Possibilities and limitations of current technologies for quantification of biological extracellular vesicles and synthetic mimics.</a> Journal of Controlled Release. 200, 87-96 (2015).</li><li>Danaei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+particle+size+and+polydispersity+index+on+the+clinical+applications+of+lipidic+nanocarrier+systems.">Impact of particle size and polydispersity index on the clinical applications of lipidic nanocarrier systems.</a> Pharmaceutics. 10 (2), 57 (2018).</li><li>Kestens, V., Bozatzidis, V., De Temmerman, P. J., Ramaye, Y., Roebben, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+particle+tracking+analysis+method+for+the+size+determination+of+nano-+and+microparticles.">Validation of a particle tracking analysis method for the size determination of nano- and microparticles.</a> Journal of Nanoparticle Research. 19 (8), 271 (2017).</li><li>Filipe, V., Hawe, A., Jiskoot, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+evaluation+of+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA)+by+NanoSight+for+the+measurement+of+nanoparticles+and+protein+aggregates.">Critical evaluation of nanoparticle tracking analysis (NTA) by NanoSight for the measurement of nanoparticles and protein aggregates.</a> Pharmaceutical Research. 27 (5), 796-810 (2010).</li><li>Hole, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interlaboratory+comparison+of+size+measurements+on+nanoparticles+using+nanoparticle+tracking+analysis+(NTA).">Interlaboratory comparison of size measurements on nanoparticles using nanoparticle tracking analysis (NTA).</a> Journal of Nanoparticle Research. 15 (12), 2101 (2013).</li><li>Malvern analytical Ltd. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NanoSight LM10 Operating Manual-P550H. , (2013).</li><li>Kim, A., Ng, W. B., Bernt, W., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+size+estimation+of+nanoparticle+tracking+analysis+on+polydisperse+macromolecule+assembly.">Validation of size estimation of nanoparticle tracking analysis on polydisperse macromolecule assembly.</a> Scientific Reports. 9 (1), 2639 (2019).</li><li>Gollwitzer, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+techniques+for+size+measurement+of+nanoparticles+in+cell+culture+medium.">A comparison of techniques for size measurement of nanoparticles in cell culture medium.</a> Analytical Methods. 8 (26), 5272-5282 (2016).</li><li>vander Pol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+distribution+of+exosomes+and+microvesicles+determined+by+transmission+electron+microscopy,+flow+cytometry,+nanoparticle+tracking+analysis,+and+resistive+pulse+sensing.">Particle size distribution of exosomes and microvesicles determined by transmission electron microscopy, flow cytometry, nanoparticle tracking analysis, and resistive pulse sensing.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (7), 1182-1192 (2014).</li></ol>

Existem vários métodos disponíveis para estimar o tamanho e concentração das nanopartículas11. Estes incluem métodos de conjunto que geram uma estimativa de tamanho de uma população, incluindo dispersão dinâmica de luz (DLS), sedimentação centrífuga e microscopia de nível de partícula única, NTA, microscopia de força atômica e sensoriamento de pulso resistivo tíclico. Destes, DLS e NTA são amplamente utilizados, tamanho não destrutivo e métodos de medição de concentração...

A análise precisa e repetível de EVs e outras partículas em escala de nanômetros apresenta inúmeros desafios em toda a pesquisa e indústria. A replicação da pesquisa de EV tem sido difícil, em parte, devido à falta de uniformidade na comunicação dos parâmetros necessários associados à coleta de dados. Para suprir essas deficiências, o ISEV propôs diretrizes do setor como um conjunto mínimo de padrões bioquímicos, biofísicos e funcionais para pesquisadores de EV e publicou-as como uma declaração de posição, comumente referida como MISEV20141. O ritmo acelerado da pesquisa de EV exigiu uma diretriz atualizada, e o "MISEV2018: uma declaração de posição do ISEV" expandiu as diretrizes do MISEV20142. O artigo do MISEV2018 incluiu tabelas, contornos de protocolos sugeridos e passos a seguir para documentar a caracterização específica associada ao EV. Como mais uma medida para facilitar a interpretação e a replicação de experimentos, o EV-TRACK foi desenvolvido como uma base de conhecimento de fonte de multidões (http://evtrack.org) para permitir um relato mais transparente da biologia EV e da metodologia utilizada para os resultados publicados3. Apesar dessas recomendações para relatórios padronizados de métodos, o campo continua sofrendo com a replicação e confirmação dos resultados publicados.
Encaixando-se com o esforço dos Institutos Nacionais de Saúde e da Fundação Nacional de Ciência para ferramentas de avaliação da qualidade, este artigo sugere que o ISEV requer relatórios padronizados de métodos e detalhes para que as ferramentas de avaliação de dados possam ser aplicadas com o objetivo de replicar resultados entre laboratórios. Reportar fontes celulares, procedimentos de cultura celular e métodos de isolamento de EV são fatores importantes para definir as qualidades da população de EV. Entre os instrumentos da NTA, fatores como configurações de detecção, índice refrativo de fluido portador, populações de partículas heterogêneas contribuindo para a polidispersidade, falta de requisitos padronizados de notificação e resultados de medição intra e inter-observadores tornam a comparação da NTA entre laboratórios difícil ou impossível.
Em uso desde 2006, o NTA é um método popular para o tamanho das nanopartículas e determinação de concentração que atualmente é usado por aproximadamente 80% dos pesquisadores de EV4. As Diretrizes MISEV2018 exigem duas formas de análise de vesícula única, das quais a NTA é uma das opções populares. A NTA continua a ser usada em comum para caracterização de EV devido à sua ampla acessibilidade, baixo custo por amostra e sua teoria fundadora direta (a equação de Stokes-Einstein). A avaliação do EV pela NTA gera uma estimativa de distribuição e concentração de tamanho de partículas utilizando dispersão de luz laser e análise de movimento browniano, com o menor limite de detecção determinado pelo índice de refração do EV. Ao usar uma amostra fluida de viscosidade e temperatura conhecidas, as trajetórias dos EVs são rastreadas para determinar seu deslocamento médio-quadrado em duas dimensões. Isso permite que o coeficiente de difusão de partículas seja calculado e convertido em um diâmetro hidrodinâmico equivalente à esfera por uma equação modificada de Stokes-Einstein 5,6,7. A análise de partículas-partículas da NTA tem menos interferência por aglomerados ou partículas maiores em uma população heterogênea de EVs do que outros métodos de caracterização7. Embora algumas partículas maiores tenham um impacto mínimo na precisão do dimensionamento, a presença de quantidades minúsculas de partículas grandes e de dispersão de luz resulta em uma notável redução na detecção de partículas menores devido à redução da detecção e rastreamento de EV de softwarereduzido. Como técnica de medição, a NTA é geralmente considerada não tendenciosa em relação a partículas maiores ou agregados de partículas, mas pode resolver populações de múltiplos tamanhos através da análise individual de partículas9. Devido ao uso de dispersão de luz por partículas, uma das limitações da análise NTA é que qualquer particulado como poeira, plástico ou pó com atributos de refração e tamanho semelhantes em comparação com EVs não pode ser diferenciado dos EVs reais por este método de caracterização.
O NanoSight LM10 (analisador de tamanho de nanopartículas) e O LM14 (módulo laser) foram vendidos desde 2006, e embora modelos mais recentes deste instrumento tenham sido desenvolvidos, este modelo em particular é encontrado em muitas instalações principais e é considerado um cavalo de trabalho confiável. O treinamento é necessário para otimizar adequadamente as configurações nta para medições de alto nível de tamanho e concentração. As duas configurações importantes necessárias para gravações de vídeo ideais são (1) o nível da câmera e (2) o limiar de detecção. Estes devem ser definidos pelo operador com base nas características da amostra. Uma das principais restrições da análise da NTA é a recomendação de concentrações amostrais entre 107 e 109 partículas/mL, para alcançar esta diluição amostral pode ser necessária10. Soluções utilizadas para diluição, como soro fisiológico tamponado de fosfato, soro fisiológico de 0,15 M ou água ultrauso, raramente são livres de partículas com menos de 220 μm de tamanho, o que pode afetar as medições da NTA. A caracterização nta das soluções utilizadas para diluição deve ser realizada no mesmo nível de câmera e limiar de detecção das amostras de nanopartículas que estão sendo analisadas. O tamanho e a concentração de nanopartículas presentes em diluentes utilizados para diluições de amostras de EV raramente são incluídos em publicações envolvendo análises de EVs.
Este protocolo utiliza a análise NTA de lipossomos sintéticos semelhantes ao EV avaliados usando níveis de câmera selecionados, limiares de detecção e filtragem mecânica das amostras para analisar os efeitos sistemáticos do nível da câmera, limiar de detecção ou filtragem de amostras no conjunto de dados NTA. Lipossomos foram sintetizados como descrito no Arquivo Suplementar S1. Lipossomos sintéticos foram utilizados neste experimento devido à sua uniformidade de tamanho, características físicas e estabilidade no armazenamento a 4 °C. Embora amostras reais de EVs pudessem ter sido usadas, a heterogenicidade e estabilidade dos EVs durante o armazenamento podem ter complicado este estudo e sua interpretação. As semelhanças nos relatórios NTA de (A) lipossomos e (B) EVs indicam que os efeitos sistemáticos revelados para lipossomos neste artigo provavelmente também se aplicarão à caracterização de EV (Figura 1). Juntos, esses achados apoiam a noção de que o relato completo de configurações críticas de software e a descrição do processamento de amostras, como diluente, diluição e filtração, impactam na reprodutibilidade dos dados da NTA.
O objetivo deste artigo é demonstrar que foram obtidas as configurações nta variando (temperatura, nível de câmera e limiar de detecção) e mudanças na preparação da amostra dos resultados coletados: foram obtidas diferenças sistemáticas e significativas de tamanho e concentração. Como a NTA é uma das opções populares para cumprir a especificação de caracterização MISEV2018, esses resultados demonstram a importância de relatar a preparação da amostra e as configurações da NTA para garantir a reprodutibilidade.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63059/63059fig01.jpg"> Figura 1: Representante NTA relata comparar lipossomos com EVs. (A) Lipossomos: amostra não filtrada caracterizada na NTA em 12 de março de 2020. (B) EVs: amostra não filtrada caracterizada na NTA em 26 de agosto de 2021. Abreviaturas: NTA = Análise de rastreamento de nanopartículas; EVs = vesículas extracelulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63059/63059fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automatic Pipetter</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Tubes, Conical, Nunc 15 mL</td>
			<td>Thermo Sci.</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Cleaner</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lens Paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-10</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoSight LM-14 Laser Module</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight NTA Software Ver. 3.2</td>
			<td>Malvern Panalytical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper Towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 1-200 &#181;L, Filtered, Sterile, Low Binding</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P -3243-200X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette Tips, 50-1,000 &#181;L, Filtered, Sterile</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>P-3243-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline, Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered (No Ca or Mg)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 100 nm (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standards, Latex Transfer- 50 nm&#160; (3 mL)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>NTA4087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Filter, 33 mm, .22 &#181;m, MCE, Sterile</td>
			<td>Fisher brand</td>
			<td>09-720-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe, TB, 1 mL, slip tip</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waste fluid container</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving reproducibility to meet minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 guidelines in nanoparticle tracking analysis

A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) tem sido um dos vários métodos de caracterização utilizados para pesquisas de vesícula extracelular (EV) desde 2006. Muitos consideram que os instrumentos NTA e seus pacotes de software podem ser facilmente utilizados após o treinamento mínimo e que a calibração de tamanho é viável internamente. Como tanto a aquisição da NTA quanto a análise de software constituem caracterização de EV, elas são abordadas em Informações Mínimas para Estudos de Vesículas Extracelulares 2018 (MISEV2018). Além disso, eles têm sido monitorados por Relatórios Transparentes e Centralização do Conhecimento em Pesquisa De Vesícula Extracelular (EV-TRACK) para melhorar a robustez dos experimentos de EV (por exemplo, minimizar a variação experimental devido a fatores descontrolados).
Apesar dos esforços para incentivar a notificação de métodos e controles, muitos artigos de pesquisa publicados não relatam as configurações críticas necessárias para reproduzir as observações originais da NTA. Poucos artigos relatam a caracterização da NTA de controles negativos ou diluentes, evidentemente assumindo que produtos disponíveis comercialmente, como soro fisiológico tamponado com fosfato ou água destilada ultrapura, são livres de partículas. Da mesma forma, controles positivos ou padrões de tamanho raramente são relatados pelos pesquisadores para verificar o dimensionamento de partículas. A equação de Stokes-Einstein incorpora variáveis de viscosidade e temperatura para determinar o deslocamento de partículas. Relatar a temperatura estável da câmara de laser durante toda a coleção de vídeo da amostra é, portanto, uma medida de controle essencial para uma replicação precisa. A filtragem de amostras ou diluentes também não é relatada rotineiramente e, se for o caso, as especificidades do filtro (fabricante, material de membrana, tamanho dos poros) e condições de armazenamento raramente são incluídas. Os padrões mínimos de detalhes experimentais aceitáveis da Sociedade Internacional para Vesícula Extracelular (ISEV) devem incluir um protocolo NTA bem documentado para a caracterização de EVs. O experimento a seguir fornece evidências de que um protocolo de análise NTA precisa ser estabelecido pelo pesquisador individual e incluído nos métodos de publicações que utilizam a caracterização do NTA como uma das opções para cumprir os requisitos MISEV2018 para caracterização de vesícula única.

A Tabela 1 contém os resultados dos vídeos NTA para as amostras de lipossomo (18 filtrados e 18 não filtrados) e um representante do DPBS diluente. As comparações entre os dois grupos foram concluídas independentemente do nível da câmera ou do limiar de detecção neste artigo. As amostras filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 108,5 nm, um modo de partícula de 86,2 nm e uma concentração de 7,4 × 108 partículas/mL. Em contraste, as amostras não filtradas aprese...

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Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

A análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) é um método amplamente utilizado para caracterizar vesículas extracelulares. Este artigo destaca parâmetros e controles experimentais da NTA, além de um método uniforme de análise e caracterização de amostras e diluentes necessários para complementar as diretrizes propostas pelo MISEV2018 e EV-TRACK para reprodutibilidade entre laboratórios.

Melhorando a reprodutibilidade para atender informações mínimas para estudos de diretrizes extracelulares de vesículas 2018 em análise de rastreamento de nanopartículas

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...

Este protocolo foi desenvolvido para operadores novatos do NanoSight LM10. Seguindo as instruções passo a passo, podem ser obtidos resultados precisos e reprodutíveis. Esta técnica ajuda a garantir resultados consistentes em várias corridas de teste, independentemente do nível de habilidade do usuário.A caracterização de nanopartículas, especialmente a quantificação, continua a ser um desafio no campo de pesquisa de vesículas extracelular. Este protocolo permite uma análise consistente de tamanho e concentração de nanopartículas em suspensão. Comece limpando as superfícies de vidro do módulo laser com uma lente de boa qualidade limpador e papel de lente.Antes da montagem do módulo, certifique-se de que o selo o-ring esteja devidamente sentado na ranhura da tampa da célula de fluxo. Em seguida, coloque a tampa da célula de fluxo no módulo laser, garantindo que os contatos elétricos estejam na orientação adequada. Em seguida, coloque os quatro parafusos de polegar carregados de mola através da placa da célula de fluxo e engaje os fios do módulo laser sem apertar individualmente.Ao colocar pressão uniforme na tampa da célula de fluxo, aperte uniformemente os parafusos do polegar de forma diagonal alternada até ficar confortável. Lave duas seringas de tuberculina de um mililitro com adaptadores de bloqueio de deslizamento três vezes com um mililitro de DPBS. Remova e descarte o êmbolo da primeira seringa tuberculina antes de inserir a seringa na porta restante para servir como um diluído ou reservatório de amostra vazio.Em seguida, encha a segunda seringa com um mililitro de DPBS e conecte-a à porta de entrada da tampa da célula de fluxo. Segure o módulo laser inclinado com a porta de seringa de saída elevada para permitir que o ar seja expurgado da câmara à medida que o DPBS é injetado lentamente no módulo laser. Lave o DPBS restante do módulo laser injetando um mililitro de ar na porta de entrada.Repita a descarga duas vezes. Após a última descarga, esvazie o módulo laser o mais completamente possível e carregue o módulo para foco e posicionamento. Abra o software.Sob a guia de captura na caixa de canto superior esquerdo, clique na câmera iniciar. Se a câmera desligar automaticamente após cinco minutos, clique em iniciar a câmera para reiniciá-la. Na mesma guia, ajuste o nível da câmera para 14 a 16 para iluminar a linha laser e simplificar a identificação e o foco das partículas.Movendo o controle deslizante superior do lado esquerdo da parte da cabeça para dentro ou para fora, desvie a imagem da câmera para as oculares. No campo de visão, encontre a área de maior densidade, referida como impressão digital e central, e concentre a impressão digital verticalmente. No campo de visão, centralize a linha laser e mova o controle deslizante superior para desviar a luz para a câmera, como observado na tela do computador.A imagem na tela do computador é uma imagem espelhada da vista nas oculares do microscópio. Ajuste o foco para aguçar a imagem de partículas móveis individuais na tela com o botão de foco. Para carregar as amostras, elave um mililitro da amostra em uma seringa de tuberculina de um mililitro enxaguado e conecte a seringa à porta de entrada da tampa celular de fluxo.Continue avançando o êmbolo até que o fluido fique evidente na seringa aberta presa à porta de saída. O módulo deve ser inclinado para permitir que o ar seja expurgado do módulo laser. Na visão da câmera, mova o foco para a direita da linha laser para uma área de um número uniforme de partículas.Ajuste a orientação vertical para centralizar as faixas horizontais de luz e refocar até que o maior número de partículas esteja à vista. Certifique-se de manter a posição do foco consistente para todas as medidas subsequentes. Ajuste o nível da câmera ao ponto em que o símbolo de informações escuras pisca intermitentemente no canto superior direito da visão da câmera.Para análise de rastreamento de nanopartículas, ou NTA, defina a duração para 30 ou 60 segundos e o número de vídeos para cinco. Para alterar o nome de arquivo base existente, clique na guia de um novo site de armazenamento para obter dados gerados com um novo nome de arquivo. Em seguida, verifique a caixa de temperatura alvo para inserir a temperatura desejada e clique em criar script para reutilizar a medição padrão.Uma vez que a amostra esteja carregada e o experimento esteja pronto para ser executado, clique em criar e executar o script. No relatório definido detalha a tela pop-up, preencha os campos com as informações necessárias sobre o operador, amostra e diluente. Quando todos os campos desejados tiverem sido preenchidos, clique em configurações OK para iniciar o script.Antes de cada captura de vídeo, procure um prompt para avançar o êmbolo manualmente. Injete aproximadamente 0,05 mililitros da amostra na câmara laser. À medida que as partículas vêm descansar, clique em OK. Ao completar a quinta captura de vídeo, uma caixa de confirmação de configurações aparecerá junto com a caixa de processo.Como os quadros são avançados manualmente a partir da parte inferior da tela de vídeo, observe o número de cruzes azuis que fazem partículas na tela e defina o limiar de detecção para processamento da amostra. Aguarde que os vídeos sejam processados automaticamente em um histograma de resultados antes que uma notificação de caixa de diálogo de conclusão seja exibida e, em seguida, clique em OK. Após a montagem da caixa de configurações de exportação, salve os resultados clicando na exportação. Destaque todos os cinco vídeos de captura listados no experimento atual.Em seguida, clique em processar arquivos selecionados e aguarde que a caixa de confirmação de configuração apareça na caixa de processo para piscar para alterar o limiar de detecção e, em seguida, ajustar o limiar de detecção para o nível desejado e ir para a configuração e clicar em OK. Os vídeos serão processados automaticamente em um histograma de resultados e uma notificação de caixa de diálogo de conclusão será exibida. Clique OK.In análise representativa, os resultados da análise de nano-rastreamento, ou NTA, para as amostras de lipossomo e um diluente DPBS representativo são mostrados. As amostras filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 108 nanômetros e uma concentração de 7,4 vezes 10 a oitavas partículas por mililitro.Em contraste, amostras não filtradas apresentaram diâmetro médio de partículas de 159 nanômetros e uma concentração de 7,6 vezes 10 a oitavas partículas por mililitro. Nos níveis combinados de câmera, como o limiar de detecção foi aumentado de dois para cinco, o tamanho médio e de partículas de modo mostrou uma diminuição significativa no tamanho das partículas das amostras filtradas. As concentrações de partículas nos níveis combinados de câmera foram diminuídas à medida que o limiar de detecção foi aumentado.Não foi detectada diferença significativa nas concentrações de partículas entre amostras filtradas e não filtradas. Em limiares combinados de detecção, à medida que o nível da câmera aumentava de 12 para 14, observou-se uma diminuição no tamanho médio e de partículas de modo das amostras filtradas. As concentrações de partículas em limiares combinados de detecção aumentaram à medida que os níveis de câmera aumentavam de 12 para 14.Não foram observadas diferenças significativas entre amostras filtradas e não filtradas. As etapas 4.1 a 5.2 são importantes para encontrar a área de visualização correta. Alcançar resultados consistentes em várias corridas de ensaio depende dessa habilidade repetível.A dispersão dinâmica da luz é frequentemente usada como um companheiro para análise de rastreamento de nanopartículas principalmente para obter o potencial zeta, que é a carga superficial das partículas. Para a análise de nanopartículas, a NTA continua a ser um método muito valioso de quantificação de partículas úteis para pesquisas de vesículas extracelulares.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Bioengenharia

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Non-viral gene delivery using polymeric nanoparticles has emerged as an attractive approach for gene therapy to treat genetic diseases1 and as a ...

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Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

3D Orbital Rastreamento em um microscópio de dois fotões Modificação: Uma Aplicação para o rastreamento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Os dispositivos à base de papel para o Isolamento e Caracterização de Extracelular Vesículas

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Injeção de Retroductal de nanopartículas para a glândula Submandibular murino

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Evaluation of the Storage Stability of Extracellular Vesicles

Avaliação da estabilidade do armazenamento de vesículas extracelulares

Extracellular vesicles (EVs) are promising targets in current research, to be used as drugs, drug-carriers, and biomarkers. For their clinical ...

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

In vivo duas cores 2-Photon Imaging de células de repórter geneticamente marcadas na pele

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...